交联。将得到的纳米颗粒使用Millipore离屯、过滤器(30k MWCO)纯化并用DI 水洗涂。任选地，添加冷冻保护剂(例如，海藻糖）。在运之后，将纳米颗粒放置于-80°C，之后 在-105°C/l〇〇mTorr真空冻干48小时。最后，将冻干的颗粒胆存在干燥器中直至使用。
[0324] 表27.喷雾干燥的ZLF纳米颗粒的物理化学特征.
[0326] 实施例16.与之前开发的基于玉米醇溶蛋白的纳米颗粒相比，玉米醇溶蛋白-乳铁 蛋白纳米颗粒的体外评价.
[0327] Caco-2细胞培养物
[0328] 第4代化CO-2细胞（ATCC,Manassas ,VA)由Gunaje Jayarama博:t (Department of Pharmaceutical Sciences , South Dakota State University ,Brookings , SD)友好地提 供。将细胞Wlx IO6个细胞接种到6孔无菌板(T.RANSWELL⑥,Corning Costar Co;rp., Cambridge，MA)中的TRANSWEL丄⑥聚醋滤膜(孔径0.4um，生长面积4.67cm2)上。使细胞 在补充W20%FBS、1%非必需氨基酸、1%1^-谷氨酷胺、链霉素（lOOiig/ml)和盘尼西林 (lOOIU/ml)的DMEM(4.5g/L葡萄糖)培养基中生长。将培养物保存在37°C下5%C02和95%空 气的气氛W及95%相对湿度(0)2培养箱，Galaxy 170S)中。在前两周中每天更换生长培养 基，之后每周更换=次，直至使用时。当达到汇合时，将细胞用膜蛋白酶处理，并在实验中使 用第25-35代。在完全生长培养基中的3周期间允许细胞在TRANSWELL磨滤膜中分化。 [0329]研究了沙奎那韦和装载沙奎那韦的化F纳米颗粒W顶端到基底侧(AP-化）的吸收 方向或基底侧到顶端(BL-AP)的分泌方向穿过化C0-2细胞单层的渗透性。在渗透性实验之 前，将细胞单层用pH 7.4的皿SS冲洗两次，并在实验条件下平衡20min。随后，用1.5ml实验 溶液替换顶端的流体。利用EVOM 仪(World Precision InstrumentsJnc. ,Saraso1:a,FL)测 量跨上皮电阻（transepithelial elechical resistance，T邸R)W确保单层的汇合和完 整性。如下计算TE邸：
[0；330] T邸R( Q ? cm2) =化旨-1?!) XA
[0331] 其中R( Q )是测量的电阻，且A是表面积(cm2)。具有大于或等于1000 Q . cm2的TE邸 值的细胞被用于实验。在时间0时，取回来自顶端室的样品（0.5ml) W确定初始沙奎那韦浓 度。在37°C、在控制的气氛(5%C02,95%相对湿度)下解育单层。在3小时期间，从基底侧房 室取回样品（Iml)并立即用新鲜的缓冲溶液替换。所有实验W-式=份进行。结果被表示为 表观渗透系数(Papp)，其根据W下计算：
[0332] Papp(cm/s) = (dQ/dt) X (1/A.Co)
[0333] 其中dQ/dt是沙奎那韦穿过化CO-2单层的流量，Co是顶端室中的沙奎那韦的初始 浓度，且A是TREANS WELL⑩滤膜的表面积(4.71cm2)。
[0334] 如本文引述的使用HPLC分析在提取之后样品中的沙奎那韦含量。（参见图6)
[0335] 双向转运和外排率。
[0336] 如W下计算沙奎那韦的有效渗透率或外排率：
[0337] EfR= (Papp B-A/Papp A-B)
[033引其中（Papp B-A)是沙奎那韦在从基底侧到顶端方向上的表观渗透系数，且(Papp A-B)是沙奎那韦在从顶端到基底侧方向上的表观渗透系数。（参见图）。结果可见于表28。 [0339]表28. SQ的转运和外排率
[0%1 ]装载尼罗红的纳米颗粒穿过化CO-2的跨上皮渗透性。
[0342]如之前描述的研究了 NR和装载NR的化F纳米颗粒穿过化CO-2细胞单层的渗透性。 为定量NR含量，在分光光度计（SpectromaxMS ,Molecular Devices , Sunnydale CA)中分别 W559nm和629nm的消光波长和发射波长测量巧光。（参见图7)
[0343] 实施例17.纳米颗粒对TEER的影响.
[0344] 测量每个TRANSWELLd)插入物的TE邸。在测量前使用皿SS缓冲液在无菌条件 下平衡电极端过夜。在纳米颗粒处理后，在室溫在S个不同的位置测量TEER。每个插入物的 最终TEER( ohm)是在6小时实验期间S个读数的平均值。（参见图8)
[0345] 实施例18.装载尼罗红(NR)的纳米颗粒的细胞摄取
[0346] 使用封装在基于玉米醇溶蛋白的纳米颗粒中的NR巧光探针（ex. 559nm且 em.629nm)进行细胞摄取分析。将化CO-2细胞W2X105细胞/孔的浓度接种在6孔板中，并允 许粘附过夜。第二天，丢弃培养基，并将细胞用皿SS平衡至少30min，然后进行摄取研究。随 后在37 °C在不同时间点（例如，30min、1小时和2小时）用2mg/ml浓度的纳米颗粒处理细胞。 在解育结束时，将细胞用皿SS洗涂S次，通过膜蛋白酶处理从孔分离，用冷的皿SS洗涂，并 用2%甲醒固定。将细胞保存在4°C，并用流式细胞术(FACS，BD Biosciences ,San Jose ,CA) 分析，通过收集20,000个事件的巧光来获得每个样品的平均巧光值。（参见图9)
[0347] 实施例19.竞争性抑制测定(流式细胞术分析）
[0348] 为了验证摄取是经由乳铁蛋白受体介导的，在牛乳铁蛋白的存在下进行竞争实 验。在与NR-ZLF纳米颗粒一起解育之前，将细胞用2mg/ml乳铁蛋白处理60min(参见图10)。
[0349] 实施例20. P-甜抑制(巧黄绿素M测定）
[0350] 将化CO-2细胞接种在黑色96孔板中过夜。第二天，用50iil的在皿SS缓冲液中稀释 的空白纳米颗粒处理细胞，持续15、30和60min。将细胞洗涂=次并将SOiil 0.25iiM的巧黄绿 素AM(Molecular Probes)添加到每个孔。利用具有485/589激发/发射的酶标仪在室溫测量 巧黄绿素的巧光。为了确定P-gp抑制，计算相对巧光％ =(处理后的巧光-背景巧光)/背景 巧光X100"(参见图11)
[0351] 通过共聚焦激光扫描显微术(化SM)或化SM使ZO-I分布可视化，将细胞用2mg/ml的 浓度的纳米颗粒处理30min。通过用PBS洗涂细胞S次来移除纳米颗粒。将细胞用0.25ml 4%的多聚甲醒在室溫固定20min。随后使用由l%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)制成的封闭溶 液中的0.25化iton-XlOO使细胞透化，持续1小时。随后洗涂细胞，并在4°C与（1:1000)Z0-1 抗体（InVihogen，Camari Ilo ,CA) -起解育过夜。ZO-I抗体与紧密连接处(或闭锁小带)结 合。在移除ZO-I抗体后，将细胞用1%BSA处理，并随后在室溫与10化1 alexa fluor 488山 羊抗小鼠IgG-起解育1小时。将细胞用PBS洗涂并在4°C与DAPI-起干燥过夜。数据（图像未 示出)表明装载NR的ZLF纳米颗粒能够穿过细胞膜。
[0352] 体外释放曲线显示出持续的释放，没有ZC纳米颗粒特有的爆发释放。在Caco-2细 胞中的体外研究表明ZLF纳米颗粒增加沙奎那韦的溶解度和渗透性的能力。然而不被理论 所束缚，该有效的细胞摄取可能是由于受体介导的内吞作用途径的利用。与游离的沙奎那 韦相比所有纳米颗粒的低外排率指示了避免了 P-gp介导的外排。
[0353] 鉴于运些数据，基于核-壳蛋白的纳米颗粒代表了保护有效装载物免于GIT中的外 部环境的有吸引力的方法。周围的壳提供了另外的扩散层，所述另外的扩散层可充当另外 的屏障并且相对于单个蛋白可延长释放时间。因此，可将具有核-壳特征的纳米颗粒随食物 预先施用（儿科药物施用的一般途径），而不显著地损失所封装的药物。玉米醇溶蛋白纳米 颗粒在发展中国家中在可获得性方面具有前景，并具有W更稳定、安全、可称量且可再分散 的固体制剂的形式提高患者依从性W及口服生物利用度的潜力。下一个主题是评价在口服 施用之后运些纳米颗粒的体内药代动力学。
[0354] 实施例21.动物研究
[0355] 通过如本文描述的相分离方法来制备基于装载沙奎那韦（SQ)的蛋白质的纳米颗 粒。在称重250g的Sprague Dawl巧大鼠（6-8周龄）中评价SQ的口服药代动力学。用于采集血 样的颈静脉血管置管的大鼠购自畑arles River (Wi lmington,MA)。所有程序由South Dakota State University的Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批 准。如表29中所显示的，将大鼠分为5组，每组4只动物。
[0356] 表29.动物组及描述.
[0358] ZC，玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒;ZLF，玉米醇溶蛋白-乳铁蛋白纳米颗粒;PZ， 聚乙二醇-玉米醇溶蛋白纳米颗粒;SQ，沙奎那韦。
[0359] 在24±2°C将大鼠维持在12hr光/暗循环下，并提供标准晒齿动物饮食。在开始实 验前，使大鼠空腹12小时，期间可自由获取水。通过使用胃管的经口强喂施用SQ制剂。在不 同的时间点（0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48小时)将血液样品（200^1)从颈静脉血管导 管套管收集到（Iml)肝素化的血液收集管中。在每次取样后导管的通杨性通过用无菌盐水 对其冲洗来保持。将样品Wl2,000巧m离屯、15min，随后收集血浆并胆存在-80°C直至通过 册LC分析。
[0360] 样品制备和色谱分析。将等份(5化1)的样品血浆转移到1.5ml离屯、管中并添加100 W的棚酸盐缓冲液(pH 10)。随后，添加20化1乙酸乙醋-己烧巧0:50)的混合物W提取药物。 重复提取两次，并收集有机相并在溫和的氮气流下使其蒸发至干燥。将获得的残留物用 50%61(^重构并满旋10111111。在25°(：在511111，250义4.61111111.(1.的对称(：-18柱（胖日16'8 Corporation, Mi Iford, USA)上进行SQ的分析。流动相是IOmM乙酸锭缓冲液-乙腊(35:65v/ V)的混合物，m.Oml/min的流速累送。W240nm的波长和3.6min的保留时间进行检测。根据 所描述的分析方法获得lOng/ml的定量限值(a limit of qualification)。
[0361] 使用PK Solutions 2.0软件（Summit Research Services,Montrose,CO)来进行 SQ血浆浓度的非房室分析。下表(表30)显示了使用非房室方法大鼠中在下格尔(dingle) 口 服施用基于不同蛋白质的制剂之后AQ的药代动力学参数。
[0362] 表30.体内SQ分析的药代动力学参数.
[0364] ZC，玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒;ZLF，玉米醇溶蛋白-乳铁蛋白纳米颗粒;PZ， 聚乙二醇-玉米醇溶蛋白纳米颗粒;CMC,簇甲基纤维素;C献，最大观察浓度;T献，最大观察 浓度的时间；tl/2,在消除阶段浓度减少一半的时间;AUCoo,使用观察到的数据点结合外推 值计算的曲线下的总面积;Ke,消除速率常数;MRT，一阶矩平均滞留时间；Fabs,绝对生物利 用度;Frel ,相对生物利用度。
[0365] 口服施用后大鼠中的SQ的血浆浓度曲线可见于图12。来自基于玉米醇溶蛋白的纳 米颗粒的SQ的生物利用度被提高。如可从曲线看出的，药物缓慢释放并且在血流中血浆浓 度被保持直至约48小时。
[0366] 虽然W上已参考公开的实施方案和实施例描述了具体的实施方案，但是此类实施 方案仅是例证性的且不限制本发明的范围。根据本领域普通技术可做出变化和改变而不偏 离本发明的如在W下权利要求中定义的其更广的方面。
[0367] 通过引用将所有的出版物、专利及专利文件并入本文，就像是通过引用单独地并 入一样。已参考多个具体且优选的实施方案和技术描述了本发明。但是，应理解可W做出许 多变化形式和改变同时保持在本发明的精神和范围内。
【主权项】
1. 一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少两种蛋白，其中第一蛋白是谷醇溶蛋白，并且 第二蛋白是β-酪蛋白或乳铁蛋白，且其中所述纳米颗粒表现出核-壳结构。2. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述谷醇溶蛋白包括白玉米醇溶蛋白、黄玉米 醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。3. 根据权利要求2所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒还包含货物分子。4. 根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述货物分子选自BCS II类和IV类药物的组。5. 根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述货物分子是选自由以下组成的组的类视 黄醇:视黄醇、13-反式-视黄酸(维甲酸)或全反式视黄酸(ATRA)、13-顺式-视黄酸(异维甲 酸）、9_顺式-视黄酸(阿利维甲酸）、视黄醛、阿维A酯、阿维A酸、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、隐黄素、叶黄素、玉米黄质及其组合。6. 根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述货物分子是沙奎那韦。7. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过喷雾干燥法或相分离法形 成。8. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒还包含货物，其中所述货物是细胞、 蛋白质、核酸、抗体、生长因子或其组合。9. 根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述货物被吸附至所述纳米颗粒的表面。10. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是交联的，且其中交联剂是京 尼平。11. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的所述谷醇溶蛋白是PEG化的， 其中所述PEG具有在约3kDa和20kDa之间的分子量。12. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒为干燥、自由流动、无色或白 色、不吸湿的粉末的形式。13. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒还包含稀释剂、赋形剂或载体，以形 成药学上可接受的组合物。14. 根据权利要求13所述的纳米颗粒，其中所述组合物是口服制剂并且任选地被包含 在食物或饮料中。15. -种试剂盒，所述试剂盒包括： a) 冻干的粉末或分散体，所述冻干的粉末或分散体包含权利要求1所述的纳米颗粒； b) -种或更多种缓冲液； c) 一种或更多种标记物； d) -种或更多种容器;及 e) 说明手册，其中所述说明手册公开了如何使用所述冻干的粉末。16. -种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括： 在水醇溶剂中溶解谷醇溶蛋白，以形成有机相； 将所述有机相添加到缓冲液中以形成沉淀物，其中所述缓冲液包含柠檬酸盐阴离子、 另外的蛋白、任选地至少一种货物分子、或任选地稳定化分子，所述稳定化分子选自树胶、 多糖或果胶或其组合； 对所述沉淀物进行声处理； 离心剩余的水相以形成团块； 洗涤所述团块， 任选地添加冷冻保护剂；以及 冻干所述团块， 其中得到的纳米颗粒具有在约50nm到约350nm之间的颗粒尺寸。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述另外的蛋白是β-酪蛋白或乳铁蛋白并且所 述多糖是右旋糖酐或阿拉伯树胶。18. -种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括： 在包含缓冲液的水醇溶剂中溶解谷醇溶蛋白和第二蛋白以形成沉淀物，其中所述缓冲 液包含柠檬酸盐阴离子； 对所述沉淀物进行声处理以形成声处理物； 任选地将一种或更多种货物分子添加到所述声处理物以形成混合物； 将所述声处理物或混合物装载到喷雾干燥器中， 将所述声处理物或混合物喷雾干燥进入收集筒以形成喷雾干燥的材料;及 从所述收集筒收集所述喷雾干燥的材料， 其中得到的纳米颗粒具有在小于约50nm到约350nm之间的颗粒尺寸。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述另外的蛋白是β-酪蛋白或乳铁蛋白。20. 根据权利要求1所述的纳米颗粒在制备用于治疗需要其的受试者中的紊乱的药物 中的用途，其中所述紊乱选自急性髓系白血病、早幼粒细胞性白血病、神经母细胞瘤和儿科 HIV〇
【专利摘要】本发明涉及口服纳米颗粒药物递送系统，包括用于使用疏水性的不溶于水的蛋白制备此系统的方法，所述纳米颗粒可以包括谷醇溶蛋白以产生所述口服药物递送系统。
【IPC分类】A61P31/12, A61K47/06, A61P35/02, A61K9/19, A61K38/16, B82Y5/00
【公开号】CN105682646
【申请号】
【发明人】奥玛赞努·佩鲁马尔, 穆罕默德·萨伊德·A·阿拉塔尼
【申请人】南达科他州立大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年6月4日