br>[0146] 另外，可W将纳米颗粒的蛋白质缀合到诸如PEG的部分W修饰纳米颗粒的表面。表 面修饰部分可W是PEG部分或其他水溶性聚合物，诸如聚乙締化咯烧酬(PVP)、聚乙醇酸 (PGA)、聚乙締醇（PVA)、壳聚糖、右旋糖酢、聚乙締亚胺（PEI)、聚唾液酸（PSA)、聚丙締酸 (PAA)等。可将运些水溶性聚合物缀合到诸如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和 高梁醇溶蛋白的疏水性醇溶蛋白的任一种，W形成纳米颗粒的表面修饰。
[0147] 相似地，可将疏水性聚合物复合、混合或缀合到谷醇溶蛋白纳米颗粒。此类聚合物 可包括，例如，聚已酸内醋、聚乳酸-共径基乙酸、聚环氧丙烷、聚天冬氨酸醋、聚谷氨酸醋、 精胺、聚赖氨酸、聚乙締亚胺或聚丙締酸醋（例如，聚甲基丙締酸醋、聚二甲氨基丙締酸乙醋 等）。还可将天然聚合物复合、混合或缀合到谷醇溶蛋白纳米颗粒和碳水化合物聚合物，所 述谷醇溶蛋白纳米颗粒诸如其他蛋白聚合物（白蛋白、酪蛋白、明胶等），且所述碳水化合物 聚合物诸如壳聚糖、右旋糖酢、阿拉伯树胶、右旋糖酢接枝的酪蛋白、海藻酸盐或其组合。相 似地，可将脂肪酸混合、复合或缀合到谷醇溶蛋白纳米颗粒表面。此类脂肪酸的实例可包括 硬脂酸、栋桐酸、憐脂酷乙醇胺和/或油酸。可将运些聚合物和/或脂肪酸缀合到诸如玉米醇 溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高梁醇溶蛋白的疏水性谷醇溶蛋白的任一种，W形成 表面修饰的纳米颗粒。
[0148] 因为玉米醇溶蛋白和0-酪蛋白是蛋白质，由于蛋白质具有大量表面官能团，所述 表面官能团可W被用于附连祀向配体、成像剂、药物和用于将药物祀向至特定组织和其他 生物医药应用的其他聚合物，所W实现了在纳米颗粒的形成中使用运些分子的另外的优 势。可W对谷醇溶蛋白疏水核或纳米颗粒表面进行其他的或另外的修饰。运些修饰可W包 括缀合刺激响应元件，诸如缀合聚甲基丙締酸径乙醋到纳米颗粒W制备pH敏感的纳米颗 粒，或缀合聚(N-异丙基丙締酷胺）W制备热敏感的纳米颗粒。另外，谷醇溶蛋白纳米颗粒可 例如使用诸如戊二醒、京尼平、巧樣酸、聚唾液酸(PSA)等的交联剂来交联，W控制药物释放 并增加药物封装产率和效率。
[0149] 纳米颗粒的药物制剂
[0150] 本文描述的纳米颗粒可W被用来制备治疗性药物组合物。纳米颗粒可W W水性分 散体的形式或作为冻干的纳米颗粒的干燥粉末被添加到组合物中。可W将纳米颗粒配制为 药物组合物并W多种形式施用到诸如人类患者的哺乳动物宿主。所述形式可特别地适用于 选定的施用途径，诸如口服施用。
[0151] 本文描述的纳米颗粒可W与诸如惰性稀释剂的药学上可接受的媒介物组合来口 服施用。组合物和制品中的剂的重量百分数可W变化，并且还可W适宜地为给定的单位剂 量形式的重量的约2%到约60%。在包含纳米颗粒的此类治疗上有用的组合物中的活性化 合物的量为可获得有效的剂量水平的量。分散体、气溶胶制剂、凝胶等还可包含W下中的一 种或更多种:诸如黄著胶、金合欢胶、玉米淀粉或明胶的粘合剂。除了 W上类型的材料之外， 单位剂量形式可W包含液体载体，所述液体载体诸如植物油或聚乙二醇。可W存在多种其 他的材料W修饰单位剂量形式的物理形式。除了甲基和丙基对径基苯甲酸醋类作为防腐剂 之外，局部制剂可W包含纳米颗粒，W及任选地染料W增加颜色。在制备单位剂量形式中使 用的任何材料所采用的量应是药学上可接受的且基本上无毒的。另外，可W将纳米颗粒分 散体或冻干的纳米颗粒并入到另外的持续释放制剂或装置中。
[0152] 可W在水中，任选地与缓冲剂混合、或在其他药学上可接受的溶剂或其混合物中 制备纳米颗粒的分散体。在普通胆存和使用条件下，制剂可W包含防腐剂W阻止微生物的 生长。最终的剂量形式应该是在制备和胆存条件下是无菌、流体且稳定的。液体载体或媒介 物可W是包含W下的液体分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙 二醇等）、植物油、无毒甘油醋及其合适的混合物。微生物活动的阻止可通过多种抗细菌剂 和抗真菌剂来引起，所述多种抗细菌剂或抗真菌剂例如对径基苯甲酸醋、氯下醇、苯酪、山 梨酸、硫柳隶等。在许多情况中，在一些制剂中将优选地包含等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化 钢。
[0153] 无菌溶液可通过W下来制备:在适当的溶剂中并入需要的量的纳米颗粒与W上列 举的多种其他成分(按需要），之后过滤灭菌。在无菌粉末用于制备无菌溶液的情况中，制备 方法可包括得到纳米颗粒的粉末加上存在于之前的无菌过滤的材料中的任何另外的期望 的成分的真空干燥技术和冷冻干燥技术。
[0154] 在实施方案中，本文描述的化合物可被配制为用于口服施用。可W通过将活性化 合物与例如药学上可接受的载体或赋形剂合并来配制本文描述的化合物。在多种实施方案 中，可将本文描述的化合物配制为口服剂量形式，所述口服剂量形式包括，仅W举例的方 式，片剂、粉末、丸剂、糖衣锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、馳剂、浆液、悬浮剂等。
[0155] 在实施方案中，用于口服使用的药物制品可通过W下来获得:将一种或更多种固 体赋形剂与本文描述的化合物的一种或更多种混合，可选地研磨得到的混合物，W及如果 期望，添加合适的辅助物，然后处理颗粒的混合物，W获得片剂或糖衣锭核。特别地，合适的 赋形剂是:填充剂，诸如糖类，所述糖类包括乳糖、薦糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，诸 如，例如，小麦淀粉、水稻淀粉、±豆淀粉、明胶、黄著胶、甲基纤维素、微晶纤维素、径丙基甲 基纤维素、簇甲基纤维素钢;或其他，诸如，聚乙締化咯烧酬(PVP或聚维酬)或憐酸巧。在实 施方案中，任选地添加崩解剂。崩解剂包括，仅W举例的方式，交联的交联簇甲纤维素钢、聚 乙締化咯烧酬、琼脂、或海藻酸或其盐诸如海藻酸钢。
[0156] 在实施方案中，诸如糖衣锭核和片剂的剂量形式具有一种或更多种合适的包衣。 在实施方案中，浓缩的糖溶液被用于包被剂量形式。糖溶液任选地包含另外的成分，诸如仅 W举例的方式，阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙締化咯烧酬、卡波姆凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化 铁、漆溶液、和合适的有机溶剂或溶剂混合物。还任选地将染料和/或色素添加到包衣中，用 于鉴定目的。另外，任选地利用染料和/或色素来表征活性化合物剂量的不同组合。
[0157] 在实施方案中，可W将治疗有效量的本文描述的化合物的至少一种配制为其他口 服剂量形式。口服剂量形式包括由明胶制成的推入配合式(push-fit)胶囊，W及由明胶和 诸如甘油或山梨醇的塑化剂制成的柔软的、密封的胶囊。在实施方案中，推入配合式胶囊包 含与一种或更多种填充剂混合的活性成分。填充剂包括，仅W举例的方式，乳糖、诸如淀粉 的阻碍剂化inder)、和/或诸如滑石粉或硬脂酸儀的润滑剂，W及任选地稳定剂。在实施方 案中，软胶囊包含溶解或悬浮在合适的液体中的一种或更多种活性化合物。合适的液体包 括，仅W举例的方式，一种或更多种脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可任选地添加 稳定剂。
[0158] 在实施方案中，治疗有效量的本文描述的化合物的至少一种被配制为用于口腔或 舌下施用。适于口腔或舌下施用的制剂包括，仅W举例的方式，片剂、锭剂或凝胶。
[0159] 本文描述的装载药物的纳米颗粒的有用剂量可通过在哺乳动物模型中比较它们 的体外活性和体内活性来确定。哺乳动物包括灵长类动物、人类、晒齿类动物、犬、猫、牛、棉 羊、马、猪、山羊、牛等。
[0160] 用于将小鼠和其他动物中的有效剂量外推到人类的方法在本领域是已知的；例 如，参见美国专利号4,938,949(Borch等人），通过引用将其全文并入。用于治疗所需的装载 入纳米颗粒的化合物或其活性盐、药物前体或衍生物的量不仅随所选择的特定化合物或盐 变化，还随施用途径、被治疗的状况的性质和患者的年龄和状况变化，并且最终将由监护医 师或临床医师决定。
[0161] 装载治疗剂的纳米颗粒可W W单位剂量形式方便地被施用，所述单位剂量形式例 如包含5mg/m2到lOOOmg/m2、适宜地lOmg/m 2至Ij750mg/m2、最适宜地50mg/m2to 500mg/m2活性 成分每单位剂量形式。期望的剂量可适宜地存在于单一剂量中或作为W适当的间隔施用的 分开的剂量(例如，作为每天2、3、4个或更多个亚剂量)存在。所述亚剂量自身可W被进一步 分成例如，很多离散的松散地间隔的施用物。
[0162] W下实施例意图例证W上发明并且不应被解释为使发明范围缩小。本领域技术人 员将容易地认识到实施例表明了本发明可藉W被实践的很多其他方式。应理解可W做出许 多变化和改变，同时保持在本发明的范围内。 实施例
[0163] 实施例1.用于玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒的材料和方法。
[0164] 相分离方法
[01化]将来自玉米的15mg白玉米醇溶蛋白（F6000级）溶解于2ml 90%Et0H中，W使得总 浓度为0.5% (w/v)。将全反式视黄酸(ATRA)从Img的最佳浓度的胆存溶液添加到该乙醇溶 液。在探头式声处理下将有机相逐滴添加到包含0.15% (w/v)e-酪蛋白（Sigma目录号# C6905)的0.1M巧樣酸盐缓冲溶液中。可在该步骤期间任选地添加稳定剂(例如，0.1%w/v的 阿拉伯树胶），或在逐滴添加有机相之前任选地将稳定剂(例如，0.1%w/v的阿拉伯树胶)添 加到0 . IM巧樣酸盐缓冲液中。将探头式声处理设定为38 %振幅，持续10分钟（IOsec开且 Isec关循环）。将玉米醇溶蛋白-酪蛋白分散体放置在磁揽拌器下（300rpm)，持续4小时，W 使化OH蒸发。另外，使用Mi 11 ipore离屯、过滤器(MWCO 5-lOkDa;40，000巧m，持续60分钟）分 离纳米颗粒，并利用移液管用DI出0和/或抑7.0的PBS洗涂数次。最后，添加冷冻保护剂(海 藻糖)并随后放置于-8(TC，然后在-105°C/100mTorr真空冻干48小时。随后将制剂胆存在干 燥器(在2-8°C)中的封闭的小瓶中，直到进一步的使用。
[0166] 对于京尼平交联的玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒，将京尼平添加（1. Omg/ml)到 有机相，并如W上进行剩余步骤。随后，纯化、洗涂并冻干所得到的纳米颗粒。
[0167] ZC纳米颗粒的喷雾干燥方法
[0168] 喷雾干燥过程通过W下来进行:将玉米醇溶蛋白和酪蛋白两者溶解在二元乙醇溶 液巧5%Et0H/巧樣酸盐缓冲液）中，W使得蛋白质的总浓度为1%。对于PEG-玉米醇溶蛋白， 对溶液进行水浴声处理并在喷雾前进行可视化检查，W确保完全溶解。在喷雾干燥前，将 ATRA从10%的浓度的乙醇胆存溶液添加到悬浮液。使用化no Spray D巧er B-90,BiiCHI在 室溫进行喷雾干燥，持续6小时。如W下设定操作参数：
[0169] 通过4WI1喷雾网喷雾干燥，喷雾率100%，入口溫度设定为100°C，且氮流速为15化/ min。
[0170] 使用合适的刮刀从收集筒收集干燥颗粒，并将其胆存在干燥器中直到使用。
[0171] 对于京尼平交联的ZC纳米颗粒，在喷雾干燥之后，通过在包含京尼平（1. Omg/ml) 的巧樣酸盐缓冲溶液(pH 7)中在室溫解育4小时使ZC纳米颗粒交联。得到的纳米颗粒使用 Millipore离屯、过滤器(IOkDa MWCO)来纯化并用DI水洗涂。最后，添加冷冻保护剂(海藻糖） 并随后将纳米颗粒放置于-80°C，之后在-105°C/100mTorr真空冻干48小时。将冻干的纳米 颗粒胆存在干燥器中直至使用。
[0172] 利用动态光散射（DLS)测量颗粒尺寸分析和C电势。使用Malvern Zetasizer-S 3600(Malve;rn Instruments Inc.,South Borough,MA)来测量颗粒的平均尺寸W及C电势。 对于原子力显微术，将IOOiU的分散体放置在聚乙締胺包被的玻璃盖片上并惊干。使用 Agilent 5500AFM/SPM显微镜来表征ZC纳米颗粒的AFM图像。利用Ium的扫描面积收集AFM图 像。对于扫描电子显微术(SEM)，将ZC纳米颗粒W20iig/ml的浓度分散在水中，并应用在抛光 的样品网格上。将样品真空干燥并用3nm的金层金属化。
[0173] 通过反相册LC确定ATRA量。简而言之，将2mg装载ATRA的ZC纳米颗粒分散在DI水 中，随后Wl4,000rpm离屯、lOmin。丢弃上清液并将剩余的团块溶解在50%的水醇溶液/巧樣 酸缓冲液中，探头式声处理5min，之后水浴声处理5min。从校正曲线确定药物浓度。如W下 计算装载和封装效率：
[0174] 化％ = ( ZC纳米颗粒中的ATRA的重量/ZC纳米颗粒的重量)* 100
[0175] 邸％ = (ZC纳米颗粒中的ATRA的重量/供给的ATRA的重量)*100
[0176] 柱:C18柱，I 〇〇A,5um,4.6mm X 150mm;流动相：乙腊（1.13ml/min)-l %w/v乙酸锭 缓冲液(0.12ml/min);检测波长:340nm;注射体积:50]il;运行时间：lOmin。
[0177] 装载效率(ATRA) = 1.17-4.1 %
[017 引 封装效率(ATRA) =61-88.56%
[01巧]对于尼罗红ZC纳米颗粒：
[0180] 装载效率=2.9 %
[0181] 封装效率=71.06 %
[0182] 对于姜黄素 ZC纳米颗粒：
[0183] 装载效率= 0.98%
[0184] 封装效率= 73.5%
[0185] 优化
[0186] 为优化制剂参数，使用S水平Box-Behnken设计。使用了具有S个制剂变量的总共 15个实验。在=个水平(低、中和高)研究了 =个参数。被选择用于研究的因变量:颗粒尺寸 (￥1)、？01(￥2)和％￡6(￥3)。参见表1。
[0187] 表1.制剂参数的优化.
[0189] Xi，玉米醇溶蛋白/酪蛋白比;拉，水相的抑;X3 %水醇相
[0190] 统计分析
[0191] 使用多元线性回归分析和AN0VAWp<0.05的显著水平分析多种参数的影响 (MINITABTM 软件）。
[0192] 通过差示扫描量热仪DSC Q200(TA Instruments, Inc.USA)来确定制剂中的ATRA 的物理状态。将精确称量的样品（5mg)卷放入侣卷边锅(T Zero Lid#T100819)并在氮气氛 (流速20ml/min)下WlOtVmin的速率从23°C加热到300°C。将空白侣室bell)用作参考。使 用TA通用分析软件(TA Instr皿ents Inc,USA)处理热谱图。
[0193] 体外降解和ATRA从ZC纳米颗粒的释放
[0194] 通过将玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒在模拟胃液和模拟肠液中解育长达4小时 来确定ZC纳米颗粒的降解曲线。通过凝胶电泳分析来分析样品。另外，通过HPLC来定量模拟 胃液中的ATRA释放。简而言之，将IOmg装载ATRA的ZC纳米颗粒悬浮在包含释放介质的1.5ml Eppendo计管中。将管放置在37°C的摇床中。在不同的时间点，将样品移出，并在14,000rpm 离屯、lOmin。使用Iml移液管小屯、地移除上清液，并将剩余的团块溶解在50%的化OH中。如描 述的使用HPLC确定ATRA的浓度。
[0195] 稳定性研究
[0196] 对于装载ATRA的玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒的固态稳定性，将40mg装载ATRA 的纳米颗粒放置在六个密封的玻璃小瓶中，并在黑暗中在室溫（即，25°C)下W及在冰箱中 在4°C下保持。在不同的时间点，确定颗粒尺寸、PDI、封装效率和纳米颗粒中残留的药物百 分比。
[0197] 在相分离过程期间形成了杂化核-壳颗粒。颗粒是均一的，并具有90-150nm的平均 颗粒尺寸，具有狭窄多分散性(PD)。纳米颗粒具有高的负C电势，指示了良好的胶体稳定性。 (参见表2和3)。
[0198] 表2.纳米沉淀(相分离)方法(来自第Sp壯）
[0200] ~ZC，玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒;ZCG，玉米醇溶蛋白-酪蛋白阿拉伯树胶纳米 颗粒;ATRA，全反式视黄酸。
[0201] 表3.空白ZC颗粒和装载ATRA的ZC颗粒的颗粒特征和封装效率
[0203]基于Box-Behnken模型，根据观察值和预测值来优化制剂。最佳因素被确定为玉米 醇溶蛋白/酪蛋白比（I :2)，水相的抑(7.4) W及水醇相的％(70%)。
[0204] ATRAW高封装效率被封装在玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒中（参见表3)。化学稳 定性研究指示了装载ATRA的ZC纳米颗粒在胆存条件中是稳定的，且持续多达60天在颗粒尺 寸和ATRA含量上都没有显著的变化。体外降解和释放研究显示了纳米颗粒制剂表现出持续 的释放曲线。另外，ZC纳米颗粒在模拟胃液中是稳定的。
[0205] 差示扫描量热法(DSC).<