)"指减缓、停止 或逆转疾病、感染、状况或细胞组的生长或进展。例如，与不存在治疗或接触的情况下发生 的生长或进展相比，抑制可大于约20%、40%、60%、80%、90%、95%或99%。
[0107] 术语"治疗剂"和设及治疗或医疗功能的相似术语，意指所引用的分子、大分子、药 物或其他物质能够有益地影响受试者中的疾病或状况的起始、病程和/或一种或更多种症 状，并可与纳米颗粒缀合用于制备治疗疾病或其他状况的药物。用于封装在本文描述的纳 米颗粒中或吸附在本文描述的纳米颗粒上的合适的治疗剂包括疏水性治疗剂，所述疏水性 治疗剂诸如但不限于:类视黄醇，所述类视黄醇诸如视黄醇及其醋、W及视黄醇的衍生物， 所述视黄醇的衍生物诸如全反式视黄酸(ATRA)和视黄醒;小分子;抗体；核酸；蛋白质；激 素;受体;配体;细胞(例如，富血小板血浆(PRP));生长因子;细胞提取物等。
[0108] 术语"治疗剂"和设及治疗或医疗功能的相似术语，意指所引用的分子、大分子、药 物或其他物质能够有益地影响受试者中的疾病或状况的起始、病程和/或一种或更多种症 状，并可与纳米颗粒缀合用于制备治疗疾病或其他状况的药物。
[0109] 视黄醇（C20曲O〇;286.45g/mol)是具有重要生物活性的二祗类醇。视黄醇具有61-63°C的烙解溫度、3100单位/mg的活性和6.2的Lo评。视黄醇几乎不溶于水，溶于或部分溶于 乙醇，并可与氯仿、乙酸和汽油混合。视黄醇是用于多种皮肤状况的药用化妆品/治疗剂，所 述多种皮肤状况包括光老化、瘦疮、伤口愈合、黄褐斑银屑病、皮肤癌、黑色素瘤和其他皮肤 状况（OWanos等人，Drug 53 :358-388,1997)。视黄醇具有差的水溶性和差的光稳定性 (Melo等人，J Con化〇1 Release 138:32-39,2009;美国专利号5,851，538(Froix等人），通 过引用将其W其全部并入本文）。维甲酸是维生素A的簇酸形式，并且也被称为全反式视黄 酸或ATRA。
[0110] 纳米颗粒和制备方法
[0111] 本公开内容提供了可W从诸如谷醇溶蛋白的疏水的水不溶性蛋白质形成的纳米 颗粒，所述谷醇溶蛋白例如玉米醇溶蛋白和e-酪蛋白或玉米醇溶蛋白和乳铁蛋白。
[0112] 图1通过流程图的方式图示了根据一个实施方案制备由0-酪蛋白稳定化的玉米醇 溶蛋白纳米颗粒的一般步骤。如本领域技术人员会容易地认识到的，所使用的具体量用于 例证，并且可将很多变化应用到本文描述的程序。在所述方法的初始步骤或阶段，将不溶于 水的蛋白质(0.4到1.25%w/v)溶解在水醇溶剂(例如，乙醇和去离子水的组合）中。溶剂的 组成可W是，例如，90 % : 10 % v/v或92 % : 8 % v/v的酒精:水。对于其中选择的分子将被封装 在纳米颗粒(例如，ATRA)中的方法，将待被封装的分子(0.03W/V到0.3%w/v)添加到该第一 水相的溶液中。待被封装的分子可W约为50%w/w的蛋白质聚合物。
[0113] 溶液的抑可W被改变，例如，通过添加 0.OlN化OH或0.OlN HC1，W使溶液的pH达 到在约pH6和约pH7之间。如果水pH在添加酸性分子诸如视黄酸之后改变或被碱性分子改 变，贝阿将抑重新调节到抑6-7。可例如通过探头型超声仪处理第一相的溶液，来帮助蛋白 质的溶解。
[0114] 在所述方法的后续步骤中，可将初始步骤或阶段的水性溶液添加到包含缓冲剂和 任选的天然树胶或多糖(例如，阿拉伯树胶）的e-酪蛋白溶液中。巧樣酸盐缓冲剂是合适的 缓冲剂。如在本公开内容中稍后所描述的，第二水相所使用的缓冲剂的选择对于在纳米颗 粒形成期间保持抑W及对于所形成的纳米颗粒的后续冻干是重要的。如果不使用缓冲剂， 或如果，例如，使用0.1 N肥1调节第二水相溶液的抑，所产生的颗粒倾向于比使用巧樣酸盐 缓冲剂产生的那些颗粒大，并且颗粒倾向于表现出较宽的尺寸范围。巧樣酸盐缓冲剂的使 用产生一些最小的颗粒直径尺寸，诸如约lOOnm。其他缓冲剂的使用可W产生在约IOOnm到 约300nm的相同或相似的直径尺寸范围的颗粒，但在冻干步骤之后，已知使用其他缓冲剂形 成的纳米颗粒的平均尺寸增大两到=倍。
[0115] 可将第二水相溶液的抑调节到在约抑6.8和约抑7.4之间，W获得期望的纳米颗粒 尺寸。如果pH在该范围之外，则颗粒尺寸倾向于变的较大，并且所产生的颗粒的多分散性指 数(PDI)变的较高。PDI是颗粒在不同的尺寸范围内分布的量度。从而所述方法可利用诸如 玉米醇溶蛋白的蛋白质在具有接近玉米醇溶蛋白的等电点（即，Pl 5到9)的约6.8到约7.4 的选择的pH的水醇溶液和水性溶液中的溶解度差异。
[0116] 可W在高超声剪切下或在高压均质下，或在超声剪切和高压均质两者的组合下将 缓冲剂添加到第二水相溶液中。超声能量和超声剪切的持续时间对于形成在期望的直径尺 寸范围内的颗粒可W是特别地重要的。可W按W下执行超声剪切能量:例如，从〇.6kW/h到 1.39kW/h，持续约2到10分钟，脉冲接通时间5到10秒并且断开时间巧化秒。超声处理对于产 生在期望的尺寸范围内的颗粒可W是重要的。当采用高压均质时，所述处理可W使用在 0.1 mm和0.25mm之间的孔口尺寸来执行，并在从5000到40，OOOpsi的压力下持续在5到10分 钟之间的时间段。
[0117] 在对第二相的溶液应用超声剪切和/或高压均质后，可揽拌混合物W使乙醇或其 他溶剂蒸发，W形成纳米颗粒。在一个实施方案中，可W通过例如机械揽拌器在室溫(23°C) W从约30化pm到约50化pm的速率进行揽拌，持续约1到6小时、或约数小时。
[0118] 为了从任何残留材料分离纳米颗粒的目的，然后可使纳米颗粒经受超速离屯、过 滤。根据所封装的分子或药物，或根据纳米颗粒的特定处理，诸如PEG化，可W使用约化Da (或具有高于或低于化化的截断Mwt的其他适当的过滤器）、和在化化和40kDa之间的截断分 子量的离屯、过滤器进行超速离屯、过滤。超速离屯、的时间可W变化，例如，从约20分钟到约50 分钟。然后可将冷冻保护剂添加到纳米颗粒中。例如，可添加2%w/v海藻糖作为冷冻保护 剂。还可使用其他的冷冻保护剂或冻干保护剂，诸如糖类，包括葡萄糖、薦糖、乳糖、聚薦糖、 甜菜碱、或多元醇，所述多元醇诸如甘露醇或山梨醇。可使纳米颗粒保持在例如-80°C，W形 成固体块状物，随后可诸如通过在高真空下干燥冷冻状态的纳米颗粒将固体块状物冻干。 如本领域技术人员会容易地认识到的，超声能量的持续时间和缓冲剂可根据期望的参数而 变化。
[0119] 因此，本文描述的纳米颗粒的颗粒直径尺寸的范围可W小于约400nm、或小于约 300nm。在一些实施方案中，颗粒直径尺寸的范围是约IOOnm到约300nm、或约75nm到约 3(K)nm。虽然尺寸W直径的方式来讨论，但纳米颗粒的形状不必然绝对地为球形，尽管纳米 颗粒中的球形形状是可实现的并且是一些实施方案所典型的。可在颗粒的相对侧之间测量 维度，例如，从相对侧横跨颗粒的最大维度，或从相对侧横跨颗粒的最大维度和从相对侧跨 越颗粒的最小维度的平均值。
[0120] 用于纳米颗粒的不溶于水的疏水性蛋白可源自多种来源，所述多种来源包括植 物、动物和合成来源。在一些实施方案中，蛋白可来自谷醇溶蛋白家族，谷醇溶蛋白包含高 量的疏水性氨基酸，诸如，例如，脯氨酸、谷氨酷胺和天冬酷胺。运些疏水性氨基酸使得蛋白 不溶于水。可在诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高梁的多种谷物中W及在其他植物和动物来源 中发现谷醇溶蛋白。合适的谷醇溶蛋白的一些实例包括，但不限于，玉米醇溶蛋白、麦醇溶 蛋白、大麦醇溶蛋白和高梁醇溶蛋白。
[0121] 在一些实施方案中，白玉米醇溶蛋白可被用于产生合适的纳米颗粒，诸如具有约 IOOnm到约4(K)nm的直径的那些纳米颗粒。黄玉米醇溶蛋白可产生具有相对较大的直径尺寸 的颗粒，并且还可产生具有较宽颗粒直径尺寸分布的颗粒。黄玉米醇溶蛋白中的色素可影 响黄玉米醇溶蛋白的溶解度W及使用黄玉米醇溶蛋白的纳米颗粒形成。
[0122] 本文描述了制备比W其他方式可能的直径尺寸和直径尺寸范围普遍更小的直径 尺寸和更窄的直径尺寸范围的纳米颗粒的方法。可通过使用一种或更多种特定级别的基础 蛋白诸如玉米醇溶蛋白进行pH控制的纳米沉淀过程，并通过使用经选择W实现使纳米颗粒 无免疫原性的纳米颗粒尺寸和直径的多种缓冲剂组合来制备运些较小的纳米颗粒。
[0123] 图2通过流程图的方式图示了根据一个实施方案，用于制备京尼平交联的玉米醇 溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒的一般步骤。
[0124] 可W通过在如W上概括的先前步骤（参见例如，图1)之后，向有机相添加京尼平 (l.Omg/mL)作为交联剂来使玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒交联。随后，可W纯化、洗涂并 冻干所得到的纳米颗粒。
[0125] 如在图3中所显示的，在实施方案中，可W通过喷雾干燥来制备纳米颗粒。在实施 方案中，喷雾干燥过程可W通过W下来进行：将玉米醇溶蛋白和酪蛋白两者溶解在二元乙 醇溶液(55 %乙醇/CB)中W使得蛋白的总浓度为约1 % Wt。
[0126] 可W在喷雾干燥之前将货物分子(例如，BCS II/IV类药物)从约10% (w/v)的浓度 的乙醇胆存溶液添加到悬浮液。可W使用新一代喷雾干燥器，例如化no Spray化yer B-90，BilCHI，在室溫进行喷雾干燥，持续约6小时。可W如下设定操作参数:通过4皿喷雾网喷 雾干燥，喷雾率为约100 %，入口溫度设定为约100 °C，且氮流速为约15化/min。
[0127] 对于PEG-玉米醇溶蛋白，可W将溶液超声水浴并在喷雾前肉眼检查W确保完全溶 解。可W使用合适的刮刀从收集筒收集干燥的颗粒，并将其胆存在干燥器中直到使用。
[0128] 在实施方案中，在喷雾干燥之后，可W使玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒与京尼平 交联。例如，在喷雾干燥之后，可W将得到的玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒在包含京尼平 (l.Omg/mL)的抑为约7的适当缓冲溶液(例如，巧樣酸盐缓冲溶液）中在室溫解育约4小时。 得到的纳米颗粒可W使用微孔离屯、过滤器QOk MWCO)来纯化并用去离子此O洗涂。最后，可 W添加冷冻保护剂（例如，海藻糖），并随后将颗粒冷却到约-80°C，之后在约-105°C/ IOOmTorr真空下冻干约48小时。随后将冻干的颗粒胆存在干燥器中。
[0129] 可W用很多种"货物"或"货物分子"来制备纳米颗粒。例如，在蛋白纳米颗粒制备 中，可添加具有多种理化性质的颗粒或剂，W提供由纳米颗粒封装、由其吸附、与其复合和/ 或与其缀合的材料。颗粒可W锁住小的亲水性分子、小的疏水性分子和/或大分子。可达到 约60%到约80%或更大的封装效率。纳米颗粒可在体外或体内环境中提供所封装的分子1 到7天或1到2周的持续释放。在一些实施方案(例如，蛋白/抗体等）中，货物可W被吸附/复 合/缀合到纳米颗粒的表面。
[0130] 在实施方案中，货物或货物分子是药物材料。适合与本发明的纳米颗粒一起使用 的作为封装的货物或货物分子、复合或缀合的货物分子或吸附的货物分子的此类材料包 括：用于体内或体外使用来诊断性或治疗性治疗受试者的、可与纳米颗粒缔合而不明显干 扰纳米颗粒的物理完整性的任何材料。
[0131] 在其他实施方案中，货物或货物分子是农业材料。适于与本文描述的纳米颗粒一 起使用的此类材料包括:用于体内或体外治疗、诊断或应用到植物或非哺乳动物(包括微生 物)的可与纳米颗粒缔合(即，封装，缀合或吸附）而不明显干扰纳米颗粒的物理完整性的任 何材料。
[0132] 在另一个实施方案中，货物或货物分子是免疫增强剂。适于与所描述的纳米颗粒 一起使用的此类材料包括:将引起免疫响应的可与纳米颗粒缔合(即，封装、缀合或吸附）而 不明显干扰纳米颗粒的物理完整性的任何抗原、半抗原、有机部分或有机或无机化合物。纳 米颗粒可被用于产生用于治疗诸如AIDS的疾病的抗病毒产品。
[0133] 运些纳米颗粒可被用于多种体内、离体(ex vivo)或体外诊断或治疗应用。一些实 例是:疾病的治疗，所述疾病诸如癌症、自身免疫性疾病、遗传缺陷、中枢神经系统素乱、传 染病和屯、脏疾患;诊断用途，诸如放射免疫测定、电子显微镜、PCR、酶联免疫吸附测定、核磁 共振光谱、对比成像、免疫显像;和递送农药(pesticides )，所述农药诸如除草剂、杀真菌 剂、驱避剂、引诱剂、抗微生物剂或其他毒素。也可包括非遗传材料，诸如:生长因子、激素、 趋化因子、细胞因子、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、粒细胞集落刺激因子和其它蛋白 或运些中任一个的片段、抗病毒剂。
[0134] 本发明还提供了作为口服递送装置的纳米颗粒，诸如包含活性剂(药物)的纳米颗 粒。纳米颗粒可W提供祀向递送和剂的释放的时间控制。所述剂可W是例如有效治疗儿童 病的剂，例如视黄醇或视黄酸W及本文描述的其他剂中的类似物。
[0135] 本发明还提供了用于制备本文描述的纳米颗粒的试剂盒。所述试剂盒可包括选择 的量的水溶性蛋白质、e-酪蛋白、一种或更多种缓冲剂、一种或更多种天然树胶或多糖和交 联剂，或其组合。
[0136] 因此本发明提供了封装多种剂的纳米颗粒W及制备其的方法。在一个实施方案 中，所述方法可被用于产生无免疫原性的纳米颗粒。所述方法可包括提供疏水性不溶于水 的蛋白质；用水醇溶剂溶解所述蛋白并溶解货物分子，W提供第一水相溶液;将水醇溶液添 加到包含e-酪蛋白（和任选的天然树胶或多糖）的缓冲剂，W产生具有在约抑6.8和约抑7.4 之间的pH的第二水相溶液;处理第二水相溶液W实现分散体内颗粒直径尺寸的减少的目 的；使任何残留的溶剂蒸发，W产生具有小于约4(K)nm的直径尺寸的纳米颗粒。然后可W将 纳米颗粒离屯、W分离并收集。可选地，在实施方案中，可将纳米颗粒交联或喷雾干燥。
[0137] 在实施方案中，在喷雾干燥之前用于玉米醇溶蛋白的增溶的有机溶剂或有机溶剂 的混合物的选择可W包括W下的一种或更多种:水;EtOH/水;EtOH/巧樣酸盐缓冲液，抑为 约7.4;EtOH/憐酸盐缓冲盐水，抑为约7.4; IPA/水;MeOH/水;丙酬/水和DCM/乙醇（1:1)。在 实施例中，若干种有机混合物可被用于进行喷雾过程。在一个实施方案中，在40ml的终体积 中最终的有机溶剂/水的比率是约3:2。
[0138] 在实施方案中，可W使用一种或更多种分子使喷雾干燥的玉米醇溶蛋白稳定，所 述分子包括巧樣酸、SLS、Tween 80、普朗尼克F68、卵憐脂、卵憐脂-普朗尼克F68、PVP(聚乙 締化咯烧酬）、阳G(聚乙二醇）20W)a、TPGS 1000、阿拉伯树胶、酪蛋白钢盐、0-酪蛋白、右旋 糖酢、PSA(聚唾液酸）。
[0139] 在实施方案中，可W将果胶和树胶添加到材料基质（玉米醇溶蛋白和酪蛋白）中， 其中在喷雾溶液中的总浓度为约1 % Wt。
[0140] 如本文公开的方法可W包括在离屯、之后冻干纳米颗粒。所述方法还可W包括将纳 米颗粒胆存在限制纳米颗粒暴露于大气压的条件下。基础蛋白可W是，例如，选择的级别的 玉米醇溶蛋白，诸如白玉米醇溶蛋白。
[0141] 缓冲剂可W是巧樣酸盐缓冲剂。为实现颗粒的直径尺寸减少而对第二水相溶液的 处理还可包括使纳米颗粒经受超声剪切、高压均质或其组合。对于其他纳米颗粒制品，例 如，表面活性剂，可W不存在(例如，e-酪蛋白-右旋糖酢纳米颗粒或玉米醇溶蛋白-e-酪蛋 白-阿拉伯树胶纳米颗粒)或可W使用其他的表面活性剂(例如，其中除了非离子表面活性 剂之外使用十二烷基硫酸钢来制备玉米醇溶蛋白纳米颗粒）。
[0142] 所述方法可W包括在第一相溶液的形成中向所述蛋白质添加用于纳米颗粒封装 的分子。所述分子可W是被选择用于对受试者施用的治疗性物质，W提供有治疗活性、无免 疫原性的纳米颗粒。所述蛋白质还可W是PEG化的和/或交联的。
[0143] 本发明还提供了包含无免疫原性的纳米颗粒的治疗组合物，所述无免疫原性的纳 米颗粒通过将治疗性分子封装在疏水性不溶于水的蛋白质中形成，所述纳米颗粒具有小于 约400nm的直径。在一些实施方案中，颗粒的直径是约IOOnm到约400nm、或约IOOnm到约 300nm。本发明还提供了药学上治疗量的包含治疗剂的无免疫原性的纳米颗粒，所述纳米颗 粒具有小于约400nm的平均直径。所述纳米颗粒可W被用于制备用于治疗受试者中的疾病 或状况的药物，所述受试者罹患可W被所述治疗剂治疗的疾病或状况或有罹患可W被治疗 剂治疗的疾病或状况的风险（即，有相应需要的）。
[0144] 蛋白质、聚合物和纳米颗粒组分的变化形式
[0145] 还可W制备本文描述的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的变化形式。例如，代替玉米醇溶 蛋白，可将诸如麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高梁醇溶蛋白的其他疏水性谷醇溶蛋白用作 用于纳米颗粒形成的蛋白质。因此，麦醇溶蛋白纳米颗粒、大麦醇溶蛋白纳米颗粒和高梁醇 溶蛋白纳米颗粒可与本文描述的玉米醇溶蛋白纳米颗粒相似地被制备并使用。<