专利名称：在组成型植物v－atp酶启动子控制下的植物基因表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA构建体，该构建体包含与异源基因有效连接的植物V-ATP酶启动子。本发明还涉及表达盒、重组载体形式的这些构建体在转基因植物，植物细胞或原生质体中的用途。具体地说，本发明涉及甜菜V-ATP酶亚基C同种型2启动子。
基因工程方法使得外源基因可以特异性地转移到植物基因组。这一过程被称为转化，所形成的植物被称为转基因植物。当在植物中表达外源基因时，启动子的选择经常是一个关键因素。虽然作为对特定非生物或生物刺激或者对定位表达的反应仅表达一种基因是合乎需要的，但是，其它一些基因最好被组成型表达，即所有时间在完整植物中和所有组织中被表达。
可以由特殊的刺激诱导的表达的例子是创伤诱导，这一点在例如，WO93/07279和EP 0 375 091 Al(有关土豆)有描述，或者化学诱导，这一点在WO 95/19443 (Ward等(1993)植物分子生物学22，361-366)中已被描述，例如，以水杨酸盐诱导(从第EP 0 337 532 E1已知)，光诱导(Fluhr等(1986)科学232，1106-1112和WO 91/05054)，以及温度依赖性诱导(在EP 0 337532 B1和WO 96/12814(对番茄)中也有描述)。
细胞和组织特异性表达的例子是种子，球根和果实特异性表达(参见Edwards和Coruzzi(1990)Annu.Rev.Genet.24，275-303和US 5,753,475的综述)。
韧皮部特异性表达(Schmiilling等(1989)Plant Cell 1，665-670)，根小结特异性表达(DE 3702497)和分裂组织特异性表达(Ito等(1994)植物分子生物学24，863-878)也是已知的。
例如，为了选择转化的植物细胞(在转基因植物中选择性标记基因的表达，产生抗生素抗性植物细胞)或产生除草剂抗性，杀虫剂抗性和病原体协迫抗性植物，可以使用造成受其控制之基因的组成型表达的启动子，因为受其控制的基因的产物存在于所有植物的部分中。
其它农学，医学或其它重要性外源基因可以在各种植物中表达，例如为了产生异源重组蛋白质和产生包含哺乳动物多肽的一些植物。借助组成型活性启动子可以有利地改变内源性植物基因在空间和时间上表达模式的数量。
最经常地用于植物遗传学的组成型启动子是病毒35S CaMV启动子(Franck等(1980)细胞21，285-294)。这一启动子包含转录效应物的不同的识别序列，总体上导致引入基因的组成型表达(Benfey等(1989)EMBO J.8，2195-2202)。
其它病毒的来源的组成型启动子，例如，已在EP 0 426 641中描述的无花果草花叶病毒启动子，在WO 99/09190中描述的澳大利亚香蕉感染badnavirus(WO 99/00492)，甘蔗杆状病毒启动子。
植物内在组成型启动子，例如，玉米ALS启动子(WO 96/07746)，水稻肌动蛋白1启动子(McElroy等，植物细胞2，163-171，1990，US5,641,876)，小麦富脯氨酸蛋白质启动子(WO 91/13991)，红莓DRU启动子(WO 97/27307)和紫苜蓿H3组蛋白启动子(WO 97/20058)。
为了表达选择基因和抗性基因，有可供使用的植物组成型启动子是合乎需要的，所说的启动子在所有植物组织或细胞类型中(如果需要)具有强的均一组成型活性，此外，在协迫条件下，其显示出更强的活性或不受阻抑。有利地是，这些启动子不应来源于植物病原体(其是35S CaMV启动子)，其表达也在不同的植物组织中是不同的。
协迫因素调节组成型35S启动子还没有描述(经常地，其它协迫诱导型启动子的元件与CaMV 35S启动子相关联)；协迫诱导型启动子大多数在正常条件下显示出实际上不可检测的表达(这是不利的)，并且仅在各自诱导协迫条件下被强烈诱导。因此，对许多用途它们是不合适的。
WO 94/21793描述了由环境条件调节的组成型启动子。这是来源于烟草的组成型启动子，其由热和激素休克，由创伤，由生物诱导与感染所诱导。WO 94/2 1793建议使用这一启动子选择农作物保护剂和保护植物使之免受协迫因素的伤害。
作为一个另外的例子，EP 0 559 603描述了花椰菜热休克蛋白质hsp80的组成型启动子。这一启动子的部分也可以导致非组成型启动子(例如在可诱导启动子的情况下)，可以用其它方式调节的启动子或灭活的启动子在异源中的组成型表达。此外，EP 0 559 603进一步描述了介导昆虫抗性的基因，除草剂抗性基因，抗微生物基因，抗真菌基因，抗病毒基因以及抗feedant基因可以处于这一启动子的控制下。hsp80启动子有十分高构成活性，然而，在协迫条件下仅有些微提高，其是劣势。
在高级植物细胞中，V-型H+-ATP酶(V-ATP酶)扮演了中心角色，因为其对在液泡膜上建立电化学H+梯度作出实质性的贡献。其占全部液泡膜蛋白质的大比例(7-35％)(Klink等(1990)Bot.Acta 103，24-31；Fischer-Schliebs等(1997)生物化学378，1131-1139)。此外，V-ATP酶也在高尔基体泡的膜中被发现。这样，它在不包含大的中央空泡的细胞中也比较强地被表达。植物V-ATP酶是由至少10个不同的亚基组成的，在所定义的化学计量学中，形成约500 000 kD的中空酶。除空泡焦磷酸酶V-PPi酶)之外，其经常在相同的内膜上表达，在空泡的一些过程，例如细胞分裂，细胞延伸以及代谢物或盐积累中，V-ATP酶扮演了中心角色。
在各种植物(甜菜，烟草，胡萝卜，玉米，Mesembryanthemumcrystallinum)中多种V-ATP酶基因表达控制的研究说明，考虑到转录物数量，至少一些V-ATP酶基因显示协同表达(Rausch等(1996)植物生理学杂志148425-433；Lw等(1996)植物生理学110259-265；Lw和Rausch(1996)J.Exp.Bot.471725-1732；Kirsch等(1996)植物分子生物学32543-547；Lehr等(1999)植物分子生物学39463-475)。
本发明的目的是提供具有植物组成型启动子的新DNA构建体，所说的启动子显示出超过现有技术植物或病毒启动子的改进的性质，并且使得可以在由盐协迫和其它生物或非生物因子调节的所有植物器官中进行强的组成型基因表达。尤其是，试图使DNA构建体适于表达选择性标记和抗性基因。
我们已经发现这一目的由一种DNA构建体达到，在所说的构建体中存在与异源基因有效连接的植物V-ATP酶启动子或其功能性等同物。按照本发明，这一植物V-ATP酶启动子也可以是保持启动子功能活性的缺失的或杂种V-ATP酶启动子。
植物V-ATP酶启动子可以来源于双子叶或单子叶植物，例如甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
植物V-ATP酶启动子优选的是甜菜V-ATP酶亚基[SEQ ID No.3]，甜菜V-ATP酶亚基C同种型1[SEQ ID No.2]或甜菜V-ATP酶亚基C同种型2[SEQ ID No.1]启动子。
本发明的另一个目的是提供上述类型的新组成型植物启动子。
我们已经通过包含甜菜V-ATP酶亚基C同种型2[SEQ ID No.包含的1]启动子序列的多核苷酸或其功能等同物的多核苷酸达到了这一目的。
本发明的有利的实施方案具有所属权利要求的特征。
这样，按照本发明的DNA构建体可以包含能以与第一启动子不同的方式调节的第二启动子。由此使得可以进行更灵活的表达控制。此外，至少一个其它嘧啶骨架可以插入在启动子中，并且这影响启动子活性。
按照本发明的DNA构建体优选地是表达盒。异源表达基因为选择标记或抗性介导基因的是更优选的。这样的异源基因的例子是杀虫毒素(例如，苏云金芽孢杆菌)，除草剂抗性基因，抗微生物基因，抗真菌基因，抗病毒的基因和抗feedant基因。其它合适的基因是，例如，可选择的基因，报道基因或杀伤基因。可选择的基因的例子是对抗生素有抗性的基因(如新霉素转移酶基因，潮霉素磷酸转移酶基因或phosphinothricin乙酰转移酶基因)或者也可以是除草剂抗性基因(如草铵膦，溴草腈，氨苯磺胺或草甘膦抗性基因(更多的信息参见Glick和Thompson，植物分子生物学和生物技术中的方法，CRC出版社，伦敦，6.7章，71-119页)。报道基因的例子是编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)，13-葡萄糖醛酸酶(GUS)，荧光素酶(LUC)，绿色荧光蛋白质(GFP)或祝马丁的基因。杀伤基因的例子是芽胞杆菌RNA酶基因，TA29基因或白喉毒素基因(更多的信息参见“转基因植物”，E.Gaulun和A.Breiman，Imperial College出版社，伦敦，1997)。
本发明还提供了具有本发明的DNA构建体的重组载体。这一载体也可以是有利于处理的穿梭载体。
在本发明的一个进一步的实施方案中，重组载体是表达载体。转化的微生物，例如转化的根癌土壤杆菌与重组载体一道提供。
本发明的一个优选的实施方案与转基因植物细胞或原生质体有关，其基因组包含按照本发明的DNA构建体。这种转基因植物细胞或原生质体来源于单子叶和双子叶植物两者。优选的细胞或原生质体是来自甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥的那些。尤其优选的是按照本发明的转基因植物，其基因组包含按照本发明的DNA构建体。转基因植物可以是单子叶植物和双子叶植物两者。
尤其优选的是植物如甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemumcrystallinum或鼠耳芥。
本发明还提供了异源基因在植物细胞或原生质中控制表达的方法，其使得可以在盐协迫和其它生物或非生物因素调节的所有植物器官中进行强的组成型基因表达。按照本发明的方法包括首先用按照本发明的DNA构建体，例如表达盒转化细胞或原生质体，随后将转化的细胞或原生质体暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便已经借助DNA构建体转化了的异源基因的表达得到有效控制。这种协迫可以以盐协迫(例如NaCl或KCl)，磷酸缺陷，氮缺陷，蔗糖缺陷，创伤，传染，温度，干旱，除草剂或机械协迫的形式出现。按照本发明，用于该方法的植物细胞或原生质体可以从单子叶或双子叶植物获得，优选的是从甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥获得。
按照本发明的方法也可以用于在植物中控制表达异源基因。这种方法包括使以按照本发明的DNA构建体转化的细胞或原生质体再生，产生转基因植物，随后将转基因植物暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便已经借助DNA构建体转化了的异源基因的表达得到有效控制。这种协迫可以以盐协迫(例如NaCl或KCl)，磷酸缺陷，氮缺陷，蔗糖缺陷，创伤，传染，温度，干旱，除草剂或机械协迫的形式出现。按照本发明，用于该方法的转基因植物可以从单子叶或双子叶植物获得，优选的是从甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥获得。
此外，本发明提供了使得可以在植物细胞或原生质体中有效产生重组蛋白质的方法。为此，以按照本发明的DNA构建体转化细胞或原生质体，随后将由此转化的细胞或原生质体暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便借助DNA构建体转化的重组蛋白质得到表达。这种协迫可以以盐协迫(例如NaCl或KCl)，磷酸缺陷，氮缺陷，蔗糖缺陷，创伤，传染，温度，干旱，除草剂或机械协迫的形式出现。接着可以通过本领域技术人员已知的方法从植物细胞以及原生质体分离以这种方式所产生的蛋白质。用于该方法的植物细胞或原生质体可以来源于单子叶或双子叶植物，特别优选的植物细胞或原生质体是来源于甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥的那些。
此外，本发明还提供了使得可以在植物中有效产生重组蛋白质的方法，包括使以按照本发明的DNA构建体转化了的细胞或原生质体再生，产生转基因植物，随后将所产生的转基因植物暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便借助DNA构建体转化的重组蛋白质得到表达。这种协迫可以以盐协迫(例如NaCl或KCl)，磷酸缺陷，氮缺陷，蔗糖缺陷，创伤，传染，温度，干旱，除草剂或机械协迫的形式出现。接着从植物分离以这种方式所产生的蛋白质。用于该方法的植物可以是单子叶或双子叶植物，特别优选的是植物，例如甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemumcrystallinum或鼠耳芥。
此外，本发明扩展至按照本发明的DNA构建体用于在植物、植物细胞或原生质体中产生重组蛋白质的用途。本发明也扩展至由按照本发明的方法之一产生的重组蛋白质。
然而，按照本发明的DNA构建体也可以用于在生物或非生物协迫下在植物中表达基因。此外，按照本发明的植物V-ATP酶启动子可以用于在生物或非生物协迫下在植物中表达基因。这一启动子也可以以缺失的或杂种V-ATP酶启动子的形式使用。可以使用来源于双子叶植物或双子叶植物的按照本发明的植物V-ATP酶启动子。使用来源于甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥的植物V-ATP酶启动子是优选的。尤其优选的是甜菜V-ATP酶亚基[SEQ ID No.3]，甜菜V-ATP酶亚基C同种型1[SEQ ID No.2]或甜菜V-ATP酶亚基C同种型2[SEQID No.1]的V-ATP酶启动子。此外，至少一个另外的嘧啶骨架可以插入到所使用的启动子中。
此外，本发明涉及以按照本发明的DNA构建体转化了的，并且对生物或非生物协迫有抗性的植物细胞或原生质体。这种协迫可以以盐协迫(例如NaCl或KCl)，磷酸缺陷，氮缺陷，蔗糖缺陷，创伤，传染，温度，干旱，除草剂或机械协迫的形式出现。优选转化的盐协迫抗性植物细胞或原生质体。
此外，本发明扩展至以按照本发明的DNA构建体转化的植物，其具有生物或非生物协迫的抗性，优选的是转化的盐协迫抗性植物。
从甜菜基因组文库总共分离到三种不同的V-ATP酶基因。已经描述了亚基A和c1的eDNA克隆和基因组克隆，它们相应于外周Vl复合物和膜整合V0复合物(Lehr等，植物分子生物学39，463-475(1999，GenBank/EMBL-DatenbankX98767，X98851，Y11038，Y11037)。
以基因特异性cDNA探针进行的RNA印迹分析显示亚基A和cl以及同种型c2的表达，为本发明的目的，它们在根，叶子和甜菜悬浮培养物中已经被克隆。
令人惊奇的是，已经出现所有三个启动子都显示出十分高的活性，一般超过35S CaMV启动子的活性。
看起来，在启动子中存在的多聚嘧啶序列在这一过程中扮演了重要角色。同种型A和cl各自具有两个这样的序列骨架，而同种型c2仅具有一个这样的序列骨架。
在本发明的范围内，现在已经令人惊奇地发现，植物V-ATP酶启动子是特别适于构建可以较好用作植物表达盒的DNA构建体。
这些表达盒可以用于在植物中引起受环境作用控制的异源蛋白质的表达。这样，本发明使得植物或植物细胞装配一个或甚至多个异源基因，这些基因在植物中被植物诱导其“需要时”的组成型表达(当环境改变时)。
盐协迫下在甜菜细胞培养物上对甜菜启动子V-ATP酶和cl以及35S启动子进行了荧光素酶报道基因研究(Lehr等，植物分子生物学39，463-475，1999)。对同种型A和cl检测了启动子活性的诱导。35S CaMV启动子活性(为比较而研究)不由盐诱导和实际受到阻抑。在本发明之内，发现所有三种启动子被100mM NaCl或100mM KCl惊奇地诱导，尽管所有三个启动子的DNA构建体序列是不同的。
令人惊奇地是，也已经发现，在磷酸盐缺陷/营养物缺陷的情况下按照本发明的启动子不显示出任何降低的启动子活性，这与35S CaMV启动子相反。由此，组成型表达仍然是理想地稳定。
相反，启动子活性由创伤所诱导，而在可比较的条件下35S CaMV启动子不被诱导。同时，现已发现启动子活性受蔗糖缺陷影响；它降低cl的活性，而不降低35S CaMV启动子的活性。
也发现启动子活动受非生物因素，如高温(30-35℃)或低温(2-5℃)的影响。
此外，现已发现各种缺失可以引入这一启动子，这导致这一启动子显示出A)增强的活性，B)与天然启动子实质上相同的活性，C)降低的活性，D)在协迫条件下比天然启动子更高的诱导性，或E)在协迫条件下比天然启动子更低的诱导性。
“有效连接”意指排列得能够完成正常的功能。因此，一种编码序列与控制序列有效连接表明这样的构型，其中编码序列在控制序列的控制下得到表达。
术语“控制序列”描述了这样的DNA序列，其对在宿主有机体中表达有效连接的编码序列是所需的。控制序列适于(例如，原核生物)包含启动子，一种可有可无的操纵基因序列，核糖体结合位点和其它迄今不完全了解的序列。已知真核细胞包含启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“基因”指DNA序列，这种序列编码可以分离的生物活性多肽或前体。多肽可以由编码序列的全长序列或任何一部分编码，只要酶促活性被保持。
因此，本发明的一个方面是一种DNA构建体，其具有与异源基因有效连接的植物V-ATP酶启动子或其功能等同物。已知小的变化(例如由遗传密码的简并性造成的)可以存在于启动子序列中，而不实质上影响它的活性。因此本发明也涉及与异源基因有效连接的植物V-ATP酶启动子的功能等同物。
术语“功能等同物”指与DNA序列互补，在严格条件下与参照序列杂交，并且显示出类似于植物V-ATP酶启动子的活性的所有DNA序列。
“严格杂交条件”应当理解为意指进行杂交，并且在2.5×SSC缓冲液中60℃下保持稳定，其后在低缓冲液浓度下37℃重复洗涤步骤的那些条件。
“异源基因”是这样的DNA序列，其编码不是植物V-ATP酶亚基A，cl或c2的多肽或蛋白质。
“缺失的或杂种V-ATP酶启动子”是这样的任何V-ATP酶启动子，其有缺失或者其组成改变，但仍然有启动子活性。
以下参照附图更详细地描述本发明。
I.获得甜菜L的基因组文库的方法。
基因组文库的产生以“Lambda Fix II/Xho I部分填补”载体(Stratagene)用甜菜L的叶片材料建立基因组文库。
“Lambda Fix II/Xho I部分填补试剂盒”的使用使得可以在没有经由琼脂糖凝胶的费劲的大小分级分离下有效克隆基因组DNA片段。为此，以限制性内切核酸酶Sau3 AI部分消化基因组DNA，游离末端用Klenow聚合酶填补，掺入dGTP和dATP。所形成的3′-AG-5′突出端阻止基因组DNA片段的自连接。同时，载体(用Xho I消化，用dCTP，dTTP填补的载体)的3-′CT-5′突出端阻止中央载体片段(“要素元件”)的再连接。通过使用P2生成溶素的大肠杆菌菌株XLI-Blue MRA(P2)也阻止野生型Lambda FixII噬菌体(含有要素元件)的扩增。这样，所使用的方法使得可以十分高产率地获得在所需的大小范围内的重组基因组克隆。
基因组DNA的部分消化由试验消化确定获得在15-23kb所需大小范围内片段的最佳酶浓度。为此，低浓度琼脂糖凝胶中分级分离各种反应物以及DNA标记。确定平均大小。因为电泳分级分离造成迁移行为的延迟，特别是在高分子量DNA范围内，片段大小不可直接经最大荧光强度确定。Seed等(1982)倾向认为片段大小被过高估计了两倍。为了获得所需大小范围的片段，对制备消化，仅使用经凝胶电泳确定的最佳的酶浓度的一半。
试验消化对于试验消化，限制酶Sau3A I(10U/μl，Promega)用限制缓冲液[1×缓冲液B(Promega)，补加0.1mg/ml乙酰化的BSA(Sigma)]稀释至0.1U/μl、0.05U/μl，0.025U/μl，0.01U/μl浓度。在冰上贮存酶溶液。以总体积1.125ml的限制缓冲液(参见上述)重悬溶解在TE缓冲液中溶解的25μg CsCl2-纯化的基因组DNA，并以225μl小份贮存在在冰上的反应容器中。在37℃下在水浴中预热DNA溶液(各5pg DNA)约20分钟，通过添加25μl限制酶溶液起始各反应。将25μl纯缓冲液溶液添加至对照样品中。在37℃下进行消化2分钟，并且通过添加10μl 0.5M Na2EDTA停止消化。然后通过添加1体积异丙醇和0.1体积的3M乙酸钠(pH7)沉淀DNA，以70％乙醇洗涤，干燥，接着重悬在10-μlTE缓冲液中。
通过在0.5％TAE凝胶(泳道长度19cm)上的过夜电泳分开反应物(用溴化乙锭染色，在V/cm和RT下过夜)。用于本实验的大小标记是以HindIII消化的λDNA以及1-kb-DNA梯(Gibco，BRL)。
制备消化制备消化的条件基本上符合试验批。为了使反应标准化，DNA浓度，反应批的总量以及时间仍然不变。酶浓度来自试验消化。
以小份消化100μg基因组DNA(参见上述)，添加0.11体积的10×STE以及0.3体积的1×STE，然后用1体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶11，V/V/V)抽提混合物两次。在-20℃30分钟添加0.5体积7.5M乙酸钠，2体积无水乙醇，后出现沉淀。以70％乙醇洗涤DNA，在室温干燥，并且用200μlTE缓冲液重悬。所有离心步骤在12,000g和4℃进行10分钟。在-20℃贮存消化物。
10×STE0.1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8，1mM Na2EDTA克列诺反应在1×填补-缓冲液(1×Klenow buffer50mM Tris-HCl，pH7.2，10mM MgSO4，0.1mM DTT，Promega；0.166mM dGTP，0.166mMdATP)350μl总体积中的50μg部分消化的基因组DNA与15U克列诺聚合酶(5U/μl，Stratagene)。通过添加0.5体积的STE缓冲液(0.1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8，1mM Na2EDTA，pH8)停止反应。然后用苯酚和氯仿处理DNA。在添加0.5体积乙酸钠和2体积无水乙醇后，在-70℃沉淀DNA30分钟，在12,000g和4℃离心15分钟使沉淀成为小球状，用70％乙醇洗涤。将干燥的沉淀重悬在TE缓冲液中，并且贮存在-20℃。
连接进λFix II/Xho I部分填补载体在10μl的反应体积中，在冰上用连接酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM rATP，Promega)重悬1μg λDNA(1μg λFix II/Xho I部分填补载体)和0.4μg基因组DNA片段，添加3.75单位的T4DNA连接酶(15U/μl，Promega)，在6-8℃下温育过夜。为了检查连接效率，在以上提到的有关对照批的条件下，将0.3μg试验插入物(50ng/μl，12-kbpMF试验插入物；用dATP，dGTP部分填补的BamH I片段)与1μgλ DNA连接。第二天包装DNA。
λDNA的包装为了产生代表性基因组文库，用由Clarke和Carbon(1976)描述的公式计算单独所需克隆的总数。包装连接反应的小份，确定滴度，这一结果用于计算每包装反应中独立克隆的数量。如果需要，进行进一步的包装反应。总体而言，应当达到所计算的独立克隆的最小数量。Stratagene的Gigapack III Gold包装抽提物用于包装连接产物。通过握在手中使包装抽提物(50μl)部分除霜，添加1μl连接批，并将混合物贮存在冰上。为了检查包装效率，以相同的方式包装0.2μgλ对照DNA(野生型c1857 Sam7，0.2μg/μl)。在室温用移液管小心重悬抽提物，然后温育2小时。通过添加500ulSM缓冲液(0.01％明胶，50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，8mMMgSO4)和20μl氯仿停止反应，并且细心摇动混合溶液。然后在16,000g和4℃下离心混合物1分钟。将上清液转移到反应容器，并且在4℃贮存直到用。同一天建立滴度平板。
使用各包装抽提物的下列稀释水平
基因组文库的扩增为了回收高浓度的噬菌体悬液(其可以作为稳定的贮存培养物贮存在-80℃)，扩增甜菜的基因组文库。扩增所需的独立克隆的最小数量应该代表整个基因组(Clarke与Carbon，1976)。
以平板溶胞产物的形式进行扩增(150mM LB琼脂平板)。所需包装抽提物的体积取决于独立克隆的最小数量(参见上述)。每平板接种批600μl感受态宿主细胞各用50,000pfu感染，轻轻摇动下在37℃培养15分钟。将6ml顶层琼脂用于平板接种。培养时间是在37℃下约8小时。噬斑大小应达到1-2mm直径。然后以SM缓冲液覆盖，接着在滚动摇床上以尽可能低的速度在冷冻室中培养过夜。将上清液转移到可封离心容器中，平板以2mlSM缓冲液冲洗，并合并上清液。在添加氯仿(终浓度5％)后，将噬菌体悬液在室温下温育15分钟，并且通过在2000g下离心10分钟从细菌残渣分离。将上清液转移到一无菌容器中，用氯仿(终浓度3％)处理，现在可以在4℃贮存若干月。在所扩增的基因组文库的滴度确定之后，将小份试样在-80℃下7％DMSO(二甲亚砜)中贮存，以提供贮存液。为了确定滴度，使用下列稀释水平(90mmLB平板)1×10-6，1×l0-7，1×10-8。
II.用报道基因荧光素酶(或β-葡萄糖醛酸酶)克隆V-ATP酶启动子A，c1和c2启动子/报道基因构建体的方法亚克隆具有启动子区的基因组克隆对亚基A，获得基因组克隆的一种单一类型，而对亚基C克隆，分离两个不同的同种型。为了使基因组亚基A的克隆得到序列分析，将与亚基A cDNA杂交的4.3kb EcoRI片段(pBVA/70)亚克隆进载体pBluescriptIISK+。对于亚基C，将8kb XbaI/HindIII片段(pBVA16-l)和5kb EcoRV/HindIII片段亚克隆进相同的载体。
启动子/报道基因构建体的克隆BVA/70启动子用克列诺聚合酶将pBVA/70克隆的1.3 kb HpaII片段平端化，并连接进载体pBluescript的SmaI位点，以便获得pBVA/70。以HindIII和BglII的限制消化形成带有其3′末端(在相对于转录起始位点的-28位)的1.3kbPstI/BglII启动子片段。为了获得启动子-GUS融合体，将HindIII/BglII与pBI22l(Clontech)的BainHI/EcoRI GUS盒连接，然后克隆进载体pBluescript，以获得pBVA/70p-GUS。为了获得启动子-LUC融合体，将PstI/BglII启动子片段连接到pCaMVLN的BamHI/HindIII盒上游，并克隆进载体pBluescript。
BVA16-l启动子将质粒pBI22l(Clontech)的BamHI/EcoRI GUS盒克隆进pBluescript(pBGUS)，用BainHI和SalI从此除去。将pBVA 16-l的带有其3′末端(在相对于转录起始位点的-40位)的1.3kb PstI/BglII启动子片段与GUS盒连接，并克隆进PstI/SalI消化的pBluescript，以获得pBVA/16-lp-GUS。如上对BVA/70的描述(参见上述)克隆启动子-LUC融合体。
对GUS和LUC，在每一种情况都用质粒pFF19G与pCaMVLN作为标准。
启动子/报道基因构建体的鉴定为了比较甜菜V-型H+-ATP酶的A和cl的相对启动子活性，从基因组克隆pBVA-70和pBVA-16/1编码区的上游区域分离约1.2kb片段。在这一情况下，所称启动子的特征在于5′-调节区，不仅有启动子区，而且有5′-未翻译前导序列的部分。将这些片段随后连接进对应(参见下述)报道基因盒的噬粒载体pBluescriptII SK+上游。除大肠杆菌(uid A)β-葡萄糖醛酸酶结构基因之外，所使用的报道基因是Photinus pyralis荧光素酶基因(Jefferson，1987；de wet等，1987)。启动子/报道基因构建体组成“转录融合体”，因为所使用的启动子片段的3′-末端在各种情况下是基因组克隆翻译起始上游的30-4bp。
图1是各个构建体的示意性表示。表达载体在下文中称为pBVA-70(或16)/GUS和pBVA-70(或16)/LUC。
pBVA-70启动子片段的鉴定这一片段的总的大小是1.237kb。它包含相对于基因组克隆pBVA-70转录起始位点(+1)-1035到+202位之间的区，并且含有除启动之外的大多数前导序列(总前导序列长度＝230bp)。
pBVA-16/1启动子片段的鉴定这一片段的总的大小是1.265kb。它包含相对于基因组克隆pBVA-16/1转录起始位点(+1)-1130到+135位之间的区，并且含有除启动子序列之外的大多数前导序列(总前导序列长度＝174bp)。
图1是pBVA-70(16)/GUS和pBVA-70(16)/LUC的示意性图示。将来源于基因组克隆pBVA-70和pBVA-16/1的5′-未翻译区之区域的片段(约1.25kb)连接进各自报道基因盒的噬粒载体pBluescriptII SK+上游。为了制备启动子/GUS构建体，使用Clontech的载体pBI-221的BamHI/EcoRI。除来源于大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶结构基因之外，它还携带nopalin合酶基因的聚腺苷酸化区(Ti质粒，根癌土壤杆菌)。用载体pCaMVLN的BamHI/HindIII盒获得启动子LUC/LUC构建体。它包含Rhotinus pyralis荧光素酶结构基因和nopalinhe合酶基因的聚腺苷酸化区。附图表征了所使用的启动子片段的切割位点相对于基因组克隆转录起始位点(+1)的位置。
BVA/16-2启动子/LUC构建体的产生用于制备构建体的另一个报道基因是Photinus pyralis荧光素酶基因(de wet等，1987)，EMBL保藏号M15077。为了制备启动子/荧光素酶构建体，从载体pCLN(pCaMVLN；Callis等，1987)除去BamHI/HindIII盒。它包含具有nopalin合酶基因的聚腺苷酸化区的Photinus pyralis荧光素酶结构基因(LUC)。将这一盒克隆进以BamHI/HindIII切开的载体pBluescriptII SK+(Stratagene)。将甜菜V-型H+-ATP酶的亚基C(同种型2)的基因的启动子/前导序列片段用BamHI从pBVA/16-2 GUS切除。已经克隆进荧光素酶盒的载体pBluescriptII SK+也用BamHI切开，由此将具有粘性末端的启动子克隆到荧光素酶的上游。荧光素酶基因上游正确取向(5′-3′)的构建体中的启动子片段的位置由各种限制酶切消化检查(例如BamMI，SalI或XmnI)。经用载体引物“M13正向”和“M13反向”测序检测从从载体的MCS到启动子和从MCS的另一边到荧光素酶的翻译。启动子/前导序列LUC构建体被称为pBVA/16-2 LUC。
III.用于在Beta细胞培养物中测定启动子活性的方法冲击转化将冲击转化方法(粒子枪轰击)用于在甜菜细胞悬液培养中瞬时表达启动子基因。这是一种直接基因转移方法，由此，DNA到达植物细胞，这是由于细胞壁被机械地破坏(Sanford等，(1987))。
使用Biolistic PDS-l000/He粒子送递系统，BIORAD。
在实验期间，压力腔室中的气体压力上升，导致爆发集落圆盘消失。所用的爆发集落圆盘的数量支配压力腔室中所产生的压力。后果是，氦气流以类冲击方式从压力腔室逃逸至以前所产生的真空腔室中。气体逃逸流加速粒子包被的微载体，此后，借助保持的网，仅在几厘米后渐渐放慢。载有DNA的微载体(此处钨粒子)，相反，当它们击中植物材料时，穿过网的空隙，并且裂开细胞壁。
微载体制备在反应容器中，将1ml 70％的乙醇添加至30mg钨粒子(微载体)中，将混合物涡旋20秒。随后10分钟的温育使得粒子可以定植，然后，将它们在室温1300g(非阻碍的)下沉淀30秒。在除去上清液后，粒子以500ml无菌双蒸水洗涤如下旋涡10秒，净置10分钟，在1300g下非障碍离心30秒。然后用500μl50％甘油处理沉淀粒子，并且通过涡旋混合。在-20℃贮存它们。
以DNA装载微载体转化所需质粒DNA应无杂质(蛋白质，RNA)，并且应当主要以超螺旋形式存在。为了分离DNA，使用市售的质粒试剂盒。为了装载粒子(微载体)，推荐的方法是假定10-15次轰击的最小数量。在制备期间在悬液中迅速定植微载体，小体积使重悬困难。所采用的体积是在每一种轰击下的体积。
除了离心步骤外的所有步骤在清洁的工作台上进行。粒子悬液液在涡旋混合器上充分混合，9μl批的溶液其后转移到反应容器。在保持涡旋下添加1μl质粒DNA(1μg/μl，在TE缓冲液中)。混合物在冰浴中贮存15分钟。然后，接着在轻轻涡旋下连续添加9μl of 2.5M CaCl2(无菌)，3.6μl1.2mM亚精胺(无菌过滤)和18.2μl无水乙醇。在冰浴中温育10分钟后，粒子在室温180g下沉淀5秒，然后除去上清液。添加6.4μl无水乙醇，经“手指涡旋”小心重悬粒子，贮存在冰浴中直到进一步使用。
细胞材料的制备为了基因转移，将细胞悬液培养物(此处3-4天龄甜菜培养物)转换到琼脂平板。为了改进转化效率，通过添加甘露糖醇和山梨糖醇增加介质的渗透值，将细胞在这一培养基上预培养约4小时。渗透处理对植物细胞转化效率的作用很可能是被归因于发生胞浆分离这一事实(Vain等，1993)。可能的是，在粒子进入细胞后，其阻止胞质渗漏(Armaleo等，1990；Sanford等，1992)。
除离心之外的所有步骤都在清洁的工作台上进行。就此而言，准备10ml-可任意使用的吸移管，镊子，滤纸盘(45mm)，Büchner漏斗和洗瓶。除可任意使用的吸移管和镊子外的材料事先高压灭菌。也使用提供Gamborg B5培养基(补加有0.5g/l酪蛋白水解产物，125mM山梨糖醇，125mM甘露糖醇的0.9％琼脂，在Ingersoll等1996后)的培养皿-(50mm)。
提供带有滤纸的Büchner漏斗。然后，采用可任意使用的吸移管均匀一致地在过滤器表面分布3.3ml悬液培养物，约对应于1ml细胞包装体积(参见下述)。经简短(约2秒)使用真空由洗涤瓶除去过剩的培养基。将滤器转移到包含有营养培养基的培养皿，以这种方法制备细胞，在室温下贮存在清洁的工作台中3-4小时，直到基因转移发生。
CPV的确定在实验起始时，确定细胞悬液培养物的细胞填补体积(CPV)。就此而言，在无菌的条件下除去10ml悬液，在15ml梯度离心机管中，在1130g(swing-bucket离心机)下沉淀5分钟。参照梯度确定细胞填补体积。
转化除了粒子悬液的超声处理(参见下述)的所有步骤都在清洁的工作台上进行。事先用无水乙醇清洁粒子枪的内部和所有金属和塑料支持物。相同地，用乙醇处理保持网和爆发集落圆盘，并且在清洁的工作台上干燥。通过在无水乙醇中简短浸没使微载体(M-20，BIORAD)灭菌，并且把它们转移到干燥器中。
在最大设置(Sonopuls HD 60，Bandelin)下声处理钨粒子悬液2秒，将悬液的5μl部分(约422μg粒子，0.78μg DNA)小心移吸到微载体表面。为了阻止定植在外，经在移吸步骤之间重复手指涡旋反应容器将粒子保持在溶液中。然后，将真空运用于干燥器20分钟。在轰击之前，按照说明书固定爆发集落圆盘(3盘)，载粒微载体以及保持网。第3位选择来用于载有悬液培养物的培养皿支持体。然后，将腔室抽成27英寸(Hg)真空，使氦气进入压力腔室。在1200psi压力下，爆发集落圆盘破裂。然后在无菌的条件下密封培养皿(Parafilm)，并且在长期黑暗中24℃下培养培养物2天。
对β-葡萄糖醛酸酶活性的组织化学检测β-葡萄糖醛酸酶的结构基因的瞬时表达可以用组织化学方法检测。就此而言，在转化进行之后和温育24小时时间过后，将悬液培养物的滤纸转移到培养皿(50mm )中，用1ml反应缓冲液覆盖(参见下述)。在温箱中37℃进行一夜温育。采用立体显微镜在40×放大率下确定被染成蓝色的带的数量。
为了制备反应缓冲液，将70mg X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸，Duchefa)预溶解在500μl二甲基亚砜中，将溶液重悬在100ml缓冲溶液(115mM NaH2PO4×2H2O/Na2HPO4×2H2O pH7，10mMNa2-EDTA，0.5mM K3[Fe(CN)6]，0.5mM K4[Fe(CN)6])中。由此获得的反应缓冲液小份试样可以在-20℃下贮存若干周。
用于量化β-葡萄糖醛酸酶与荧光素酶活性的方法为了量化报道基因产品的酶活性，使用依赖于生物发光和化学发光的检测方法。为了确定酶活性，事先提取蛋白质。在发光分光计(Berthold，Lumat9501)中定量测定在尔后酶促反应中产生的“光量”。所获得的测定值代表在某一时间段总体光量。测定值表示为测定的光单位，“LU”。
蛋白质抽提物的制备用“GUS-Light测定法”(Tropix)和“荧光素酶测定系统”(Promega)提取蛋白质。为了制备蛋白质抽提物，用压舌板从滤纸除去悬液培养物，确定最新重量，然后借助液氮，用捣棒与研钵破坏细胞。将抽提缓冲液(500μl GFW)移取到冻结材料中，使抽提物除霜，然后充分与匀化。使用切除的移液管尖，将悬液转移到在冰上的反应容器中，在4℃和16,000g下离心1分钟。将上清液保持在冰上，直到活性确定。
抽提缓冲液(“GUS-光测定)在使用之前，先向缓冲液溶液(GUS裂解溶液)补加β-巯基乙醇(终浓度50mM磷酸钠缓冲液，pH7，10mM Na2-EDTA，0.1％SDS，0.1％曲通，10mMβ-巯基乙醇)。将溶液贮存在室温下，直到使用。
抽提缓冲液(荧光素酶测定系统)用无菌双蒸水以1∶5比率稀释已经浓缩5倍的缓冲液(细胞培养裂解试剂)(终浓度25mM含H3PO4的Tris-HCl pH 7.8，2mM CDTA，2mMDTT，10％甘油，1％曲通)，并贮存在室温下，直到使用。
β-葡萄糖醛酸酶活性的测定检测反应gusA基因→β-葡萄糖醛酸酶甲基-3-氧苯甲酸酸(葡萄糖醛酸内酯)+光(470nm)+金刚基为了检测-β葡萄糖醛酸酶活性，使用GUS-光试剂盒(Tropix)被用。对此，遵循制造商的说明。
蛋白质抽提物，反应缓冲液以及“加速剂”使用之前预热至室温。在20μl蛋白质抽提物转移到试管(10ml)之后，通过反应缓冲液(每一种情况下180μl)的交错(20秒)添加起始反应。在长期黑暗中室温下温育这些批1小时。然后，在每一种情况下，将300μl加速剂溶液移取到反应物中(交错，参见上述)。紧接在溶液添加之后，单独样品在发光分光计(Lumat9501，Berthold)中测量，在再一此的5秒中测定之前，停顿5秒钟。
阴性对照发光分光计所确定的绝对值不可以直接归因于外源基因的活性。为了测定背景值(在β-葡萄糖醛酸酶的情况下，很可能也对可比较的内源性活性有贡献)，借助以上描述的检测方法研究未转化的细胞悬液培养物。这一阴性对照测定值(BW，空白值；参见Tables 1a和lb)另外也包含由缓冲液物质造成的背景值。为了计算启动子活性，从转化的培养物的测定值扣除空白对照的值。
反应缓冲液(“GUS反应缓冲液”)在使用之前，用“GUS反应缓冲液”(未补加0.1M磷酸钠缓冲液，pH7，10mM Na2-EDTA)1∶100稀释底物(葡萄糖醛酸内酯，化学发光底物)荧光素酶活性测定检测反应luc基因→荧光素酶(Photinus pyralis)为了确定荧光素酶活性，使用荧光素酶测定系统(Promega)。蛋白质抽提物对反应缓冲液的比是变化的。
将蛋白质抽提物和反应缓冲液(参见下述)两者预温热至室温。在每种情况下20μl(100μl)蛋白质抽提物转移到10ml试管之后，将100μl(50μl)反应缓冲液添加至样品中，然后在10秒期间将该批在发光分光计(Lumat，9501，Berthold)中立即测量。按照测定β-葡萄糖醛酸酶活性所说的方法测定空白对照值，其用于校正转化培养物的测定值。
反应缓冲液(“荧光素酶测定试剂”)为了制备反应缓冲液，将底物(荧光素酶测定底物)溶解在“荧光素酶测定缓冲液”(终浓度470μM萤虫素，270μM辅酶A(锂盐)，530μMATP，20mM trizin，1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2×5H2O，2.67mM MgSO4，0.1mM Na2-EDTA，33.3mM DTT，pH7.8)中。将反应缓冲液分成小份，并且贮存在-70℃。
相对启动子活性测定为了量化启动子/报道基因构建体中启动子活性，借助于以上描述的酶促检测方法测量报道基因的瞬时表达。然而，当用直接基因转移来确定启动子活性时，所获得的测定值的单个转化之间的变异经常是实质上的。在冲击转化的情况下，基因转移的效率一方面受处理之后转化组织生理状态的影响。另一方面，物理因素也具有重要性，例如微载体的装载，或在大载体上粒子悬液的分布上的不同。因此测定值必须通过测量系统的校准支持。
校准理论试验质粒试验启动子为了量化启动子活性，通过测定其的基因产物的酶促活性确定报道基因的瞬时表达。然而，试验启动子的启动子活性不能以酶促活性测定的绝对值显示。量化需要与组成型启动子(标准启动子)比较。
标准的启动子在平行设置中，研究了在组成型启动子(此处是CaMV35S启动子)控制下的报道基因的表达。试验启动子的启动子活性被表示为比活性活性试验启动子/活性标准启动子，标准的启动子的活性等于1。采用在标准的启动子控制下的报道基因的表达作为参照使得可以内部比较重复实验的结果。
校准质粒(内标)为了记录单独轰击(转化)的转化效率，微载体同时装载试验质粒和校准质粒。所用的构建体(试验质粒，校准质粒)携带不同的报道基因，这使得可以平行记录它们的表达数据(酶活性)。
校准质粒的结构基因处于组成型启动子(此处CaMV d35S，强35S启动子)的控制下。校准质粒的测定值(酶活性)反映单独轰击的转化效率。在一个实验中有关内标(校正质粒)所获得的所有测定值一起考虑，除以实验中所获得的最大值。这样，最高的测定值形成转化效率1(相应于100％)。
转化效率(从0到1)被表示为相对的光单位“rLU”。考虑轰击的转化效率，在有关试验质粒(试验启动子，标准启动子)的研究中所获得的绝对测定值得到校正。就此而言，对试验质粒测定的活性除以转化效率。所校正的值被称为相对的活性。试验质粒对校准质粒的比(7∶3，W/W)在所有实验中保持。
拷贝数试验质粒DNA的同一数量用于转化(此处每次轰击约0.7μg)。当比较试验启动子和标准的启动子的活性时(参见上述)，必需考虑质粒大小，即每pg试验质粒DNA的分子数量(复制因子)。所使用每次轰击的标准启动子的分子数量(试验质粒)取作参考值，并且使其等于1。考虑分子数量(每次轰击)，校正试验启动子活性的测定值。
相对启动子活性的计算随后的实施例显示单个计算步骤的例子，以进一步说明这一点。
数据涉及甜菜V-型H+-ATP酶(试验启动子，质粒pBVA-70/LUC)的A-亚基启动子(70kD)相对启动子活性的定量研究，CaMV355启动子(质粒PCaMVLN)用作为参照(标准启动子)。两种试验质粒都携带荧光素酶结构基因(LUC)。为了记录转化效率，将校准质粒pFF19G用于共转化。它携带有在增强的35S CaMV启动子控制下的β-葡萄糖醛酸酶结构基因(GUS)。
使用试验质粒X校准质粒的下列组合1.试验启动子70kD UE-ATP酶(pBVA-70/LUC)×CaMV d35S(pFFl9G)
2.标准启动子CamV35S(PcAMVLN)×CaMVd35S(pFFl9G)
表1a甜菜V-型H+-ATP酶(70kD UE ATP酶LUC×CaMVd35S/GUS)的70kD亚基启动子构建体的相对荧光酶活性计算值背景活性通过考虑阴性对照(绝对值-空白值(BV))的测定值校正从转化的细胞酶活性(LUC与β-GUS活性)的测定所获得的绝对值。LUC活性的空白值是103LU。GUS活性的空白值是6448LU。所表示的LU(光单位)涉及所使用的蛋白质抽提物的数量(此处20μl)。
转化效率内标CaMV d35S/GUS的最高测定值(GUS活性)，以及由此的最高转化效率在第3平板中获得。通过考虑各自的转化效率校正余下的转化批的LUC活性的值。
表lbCaMV 35S启动子(35S CamV/LUC×CaMV d35S/GUS)相对荧光素酶活性计算值；参见表1a的图例为了计算试验启动子的活性，通过考虑分子数量(复制因子)(参见以下)校正相对的荧光素酶活性的平均值(参见表1a)。
试验启动子的相对强度现在表示为试验启动子活性与标准的启动子活性之间的比。在本实施例中，0.49的值起因于甜菜V-型H+-ATP酶的亚基A启动子的相对启动子活性。
IV.构建供冲击转化的质粒构建体图2显示构建体pBVA-70/LUC的构建。为了获得荧光素酶构建体pBVA-70/LUC，经PstI/BglII消化质粒pBVA-70切下甜菜V-型H+-ATP酶亚基A基因的5′-调节区(1236bp)。随后，将基因组片段经由PstI/HindIII切割位点克隆进载体pCaMVLN BamHI/HindIII盒上游的载体pBluescript SKII+(Stratagene)中。所说的盒包含荧光素酶结构基因和nopalin合酶基因的聚腺苷酸化区。载体区(■)在BVA-70启动子/LUC/CaMV终止子盒中被特别强调。
图3显示构建体pBVA-16/LUC的构建。为了获得荧光素酶构建体pBVA-16/LUC，将基因组亚克隆pBVA-16/1(其在图2中描述)的PstI/BglII片段经由切割位点PstI/HindIII克隆进载体pCaMVLN BamHI/HindIII盒上游的载体pBluescript SKII+(Stratagene)中。参见图2的说明。
V.V-ATP酶启动子A，c1和c2的克隆的5-′缺失物的举例BVA/16-2启动子/LUC构建体的启动子缺失用于启动子缺失的起始构建体是启动子/前导序列荧光素酶pBVA/16-2/LUC。这一构建体包含具有1923bp的全部启动子区和另外的87bp前导序列(-1923套87＝2010bp)。借助“Exo Mung Bean缺失试剂盒”(Stratagene，1997)缺失ATP酶启动子，从5′-末端起始。
图4显示BVA/16-2启动子缺失。附图的前排显示具有前导序列直到翻译起始位点(ATG)的源基因组克隆pBVA/16-2的启动子区。转录起始位点显示为+1。单独的缺失克隆在下面图示出，并且给出了缺失克隆的数量。左边的数字显示余下的启动子的长度，在每一排右边的数字显示在启动子/荧光素酶构建体中缺失启动子和前导序列部分(在各种情况下是+87bp)的总长度。
为了阻止对载体的消化，选择载体左边的MCS中酶的限制切割位点，其既非在启动子中切割，也非在报道基因中切割。具有3′-突出端的限制酶不需要任何填补反应。在具有5′-突出端的限制酶的情况下，例如NotI，粘性末端在消化之后借助克列诺聚合酶用α-硫代dNTPs填补上。首先，借助SpeI消化(从5-末端起始)，启动子的5′-末端被缩短1121bp。在构建体的启动子/前导序列片段中，812bp的启动子加87bp的前导序列＝889bp保持。Spel消化导致5′-限制突出端。酶外切核酸酶III消化5′-限制突出端，其还没有由α-硫代-dNTPs填充上。在构建体以NotI消化之后，随后用α-硫代-dNTPs填充，然后以Spel消化，外切核酸酶III引起的启动子的5′-缺失可以开始(起始，选择10个缺失点)。构建体的载体末端仍然不变。在外切核酸酶III消化之后，余下的突出端以mung bean核酸酶消化。这产生两个平端，其可以连接和其后转化进大肠杆菌感受态细胞。在质粒分离和尔后的SacI×baI试验消化后，采用T3载体引物(有意引物)对所选择的质粒进行初始测序(TOPLAB)。从左边上的MCS开始到5′-缺失启动子，对载体pBluescript II SK+的突出端测序。将选择的缺失带用于冲击转化，其采用粒子枪4号，具有600bp启动子(687bp启动子+前导序列)，9号，具有541bp启动子(628bp启动子+前导序列)，17号，具有364bp启动子(451bp启动子+前导序列)，20号，具有294bp启动子(381bp启动子+前导序列)，19号，具有223bp启动子(310bp启动子+前导序列)和22号，具有180bp启动子(267bp启动子+前导序列)。
BVA 16-l启动子/LUC构建体的启动子缺失在尔后研究中，将甜菜V-型H+-ATP酶亚基C同种型2(BVA/16-2)的启动子与其它迄今已知的同种型启动子(甜菜V-型H+-ATP酶的同种型1亚基C，BVA 16-l)。这样，对启动子/前导序列荧光素酶构建体pBVA 16-lLUC(Lehr等，1999)也进行5′-启动子缺失(参见上述)。将这一启动子(BVA16-l)作为PstI/BglII片段克隆进载体pCLN(具有荧光素酶的结构基因)BamHI/HindIII盒上游的载体pBluescriptII SK+中。源构建体含有1126bp的完整启动子区和另外的131bp前导序列(-1126到131＝1257bp)。最后，也对缺失克隆进行初始测序。产生用作启动子缺失克隆对照的一种克隆，其中完成了针对前导序列的缺失。因此，这一克隆仅含有荧光素酶上游51 bp(+81到+131)的前导序列。最初，选择的缺失克隆用于用粒子枪的冲击转化164号，具有863bp启动子(994bp启动子+前导序列)，1号，具有662bp启动子(793bp启动子+前导序列)，34号具有361bp启动子(492bp启动子+前导序列)，55号，110bp启动子(241bp启动子+前导序列)和对照93号，具有51bp的前导序列，没有启动子。
图5显示BVA16-l启动子的缺失。
附图的前排显示具有前导序列直到翻译起始位点(ATG)的原基因组克隆pBVA/16-1的启动子区。转录起始位点显示为+1。单独的缺失克隆在下面图示出，并且给出了缺失克隆的数量。左边的数字显示余下的启动子的长度，在每一排右边的数字显示在启动子/报道基因构建体中缺失启动子和前导序列部分(在各种情况下是+131bp)的总长度。
V-ATP酶A启动子的缺失原构建体pBVA/70-LUC包含基于转录起始点的1035bp5′-上游序列，按照与C1和C2类似的方法产生下列缺失
表2pBVA/70-LUC的缺失构建体VI.在标准条件下，A，c1，c2以及CaMV35S的启动子活性比较图6显示在对照条件下不同启动子的活性比较。在利用冲击转化具有瞬时基因表达的这一实验中，各启动子的活性由荧光素酶活性间接确定。将三种V-型H+-ATP酶启动子BVA16-l，BVA/16-2和BVA/70与CaMV35S启动子比较。经采用构建体pFF19G的共转化，相互校正荧光素酶活性的最终值。图表显示具有标准偏差的校正的最终值。
表3最终值以及启动子强度(基于pCLN或16-2)在这种对照条件下的实验中，V-ATP酶BVA/16-l启动子比BVA/16-2启动子活性高大约5倍。启动子BVA/16-2和BVA/70显示可比较的活性(BVA/70的活性比BVA/16-2稍高)。与在构建体pCLN中的CaMV 35S启动子比较，V-ATP醇启动子BVA/16-2和BVA/70活性高约3倍，并且在这三个ATP酶启动子中最强的BVA16-1显示出比pCLN中的高14倍活性。
甜菜叶子中同种型cl与c2的V-ATP酶启动子的组成型活性的检测在田地种植的植物充分膨胀的叶子上经粒子轰击确定c2(全长启动子)和cl(5′-缺失d164)基因构建体的启动子/报道基因活性。为此，在每一种情况下，用粒子枪(1个爆发集落圆盘，900psi)轰击在潮湿滤纸上的培养皿中的2叶片(一片在另一片上面)盘(5cm)。
以0.5μg质粒(V-ATP酶启动子/pFF19G＝7.3)轰击。在进行轰击之后，叶片盘在培养皿中在水上飘浮的同时，在光中温育24小时。
表4在甜菜叶子中对同种型cl与c2的V-ATP酶启动子组成型活性的检测结果表4中的结果说明启动子c2与cl(d164)显示与CaMV 35S可比较的活性，即使是在充分膨胀的叶子中。平行地，Northern印迹分析揭示，如同cl已经显示的，c2同种型也在根、嫩叶子和老叶子中组成型表达，如所预期的。如已经对cl所描述的(Lehr等，1999)，植物的盐协迫导致增加量的转录物。
在甜菜中c2同种型表达的Northern印迹分析图7显示在甜菜中的c2同种型表达的Northern印迹分析。在每一种情况下，使用10μg总RNA，并且与3-UTR区的基因特异性探针杂交。在每一种情况下，使用两种对照植物的样品(左，中)以及一种盐处理的植物的样品(100mM，48小时；右)。
VII.与CaMV35S比较，启动子A，c1和c2的5′-缺失物的相对活性图8显示在对照条件下不同缺失启动子的活性比较。在这种借助冲击转化的瞬时基因表达实验中，各启动子的活性由荧光素酶活性间接确定。将缺失的V-型H+-ATP酶启动子BVA16-l和BVA/16-2与CaMV35S启动子比较。经采用构建体pFF19G的共转化，相互校正荧光素酶活性的最终值。图表显示具有标准偏差的校正的最终值。在各栏下面的数字指图4和5中的各种缺失片段。
与CaMV35S比较，V-ATP酶A启动子的各种5′-缺失体的启动子活性
表5在对照条件下，亚基A的V-ATP酶各种缺失启动子的活性的比较表5显示在对照条件下，亚基A的V-ATP酶各种缺失启动子的活性的比较。在这种借助冲击转化的瞬时基因表达实验中，各启动子的活性由荧光素酶活性间接确定。将BVA/70的缺失V-型H+-ATP酶启动子与CaMV35S启动子比较。经采用构建体pFF19G的共转化，相互校正荧光素酶活性的最终值。图表显示具有标准偏差的校正的最终值。启动子的数字指表3中的各种缺失片段。
VIII.在Beta细胞培养物生长期间，V-ATP酶c1启动子和CaMV 35S启动子的各种5′-缺失体的启动子活性表6显示在Beta细胞培养物生长期间，V-ATP酶c1启动子和CaMV35S启动子的各种5′-缺失体的启动子活性。在它们转移到新鲜培养基1.5，3.5，5.5和7.5天后，在Beta悬液细胞中测定所说的活性。转移 启动子活性(LUC)的天数 CaMV 35S d5/55(-l10) d3/34(-361) d0/164(-863)1.5 75141 51857 106816 1652523.5 75170 59147 132474 2192195.5 63916 44955 108072 1572187.5 18192 16954 31877 51930表6在Beta细胞培养物生长期间，V-ATP酶c1启动子和CaMV 35S启动子的各种5′-缺失体的启动子活性IX.NaCl(KCl)协迫对A，c1，c2和CaMV35S启动子活性的影响在Beta细胞培养物中，NaCl(KCl)协迫(125mM/48小时)对A启动子(d4/46[-682bp])5′-缺失体和cl启动子(d164[-863])5′-缺失体活性的影响在最后转移之后的1.5天，将细胞在滤纸盘上抽吸过滤，并且在具有对照培养基或添加有125mM NaCl(KCl)的培养皿上培养。在进行轰击之后，将它们进一步培养24小时。然后，测定LUC活性。启动子 对照 LUC活性+125mM NaCl +125mM KClCaMV35S 32527(100)8384(26) 4711(14)d164(cl)67841(100)51380(76) 22379(33)CaMV35S 20924(100)5036(24) n.d.d4/46(A)23165(100)9886(43) n.d.
表7NaCl或KCl协迫对V-ATP酶启动子活性的影响结果说明，V-ATP酶启动子的活性比CaMV35S启动子受细胞的NaCl或KCl协迫的影响小得多。对此，更多的信息可以在Lehr等，(1999)中找到。
图9显示，对c2启动子也观察到可比较的影响。所显示的数据是在暴露到125mM NaCl之后至少24小时的活性。图9在底下也显示，在Northern印迹分析中，在暴露到盐中后，V-APTase基因A，cl和c2的转录物数量与对照处理相比，全部得到提高。
X.磷酸盐缺陷对A，c1，c2和CaMV35S的启动子活性的影响Beta细胞培养物中磷酸盐缺陷(48小时)对A启动子(d4/46[-682bp])5′-缺失体和cl启动子(d164[-863])5′-缺失体活性的影响在最后转移1.5天后，将细胞抽吸过滤到滤纸盘上，在含有对照培养基或无磷酸盐培养基的培养皿上培养48小时。在进行轰击之后，将它们进一步培养24小时。然后，测定LUC活性。
表8Beta细胞培养物中磷酸盐缺陷(48小时)对A启动子(d4/46[-682bp])5′-缺失体和cl启动子(d164[-863]) 5′-缺失体活性的影响结果说明V-ATP酶启动子的活性与CaMV35S启动子的活性比较，显著地较少受到细胞磷酸缺陷的影响。
XI.蔗糖缺陷对A，c1，c2和CaMV35S的启动子活性的影响Beta细胞培养物中蔗糖缺陷(48小时)对A启动子(d4/46[-682bp])5′-缺失体和cl启动子(d164[-863])5′-缺失体活性的影响在最后转移1.5天后，将细胞抽吸过滤到滤纸盘上，在含有对照培养基或无蔗糖培养基的培养皿上培养48小时。在进行轰击之后，将它们进一步培养24小时。然后，测定LUC活性。
表9Beta细胞培养物中蔗糖缺陷(48小时)对A启动子(d4/46[-682bp])5′-缺失体和cl启动子(d164[-863])5′-缺失体活性的影响结果显示细胞蔗糖缺陷影响V-ATP酶启动子活性与影响CaMV35S启动子活性具有类似的程度。
XII.在Beta甜菜贮存组织中，V-ATP酶基因A，c1，C2和E的协调创伤诱导创伤之后V-ATP酶和V-PPi酶基因的表达为了从头，茎以及膜-完整区检测V-PPi酶与各种V-ATP酶亚基的稳态转录水平，在创伤之后及时在各种点采集样品。分离RNA后，进行Northern印迹，其中每个点上及时加入15μg RNA。采用不同的同源生物素标记的探针连续重复展开相同的印迹。
为了检测蛋白脂质C的两个同种型转录物，在与基因特异性c2探针杂交发生之前的检测后，从膜剥去基因特异性c1探针，如同从
图10所观察到的，c1探针不是完全剥去；同种型c1的稍大转录物的带仍然可以在同种型c2的信号上微弱识别出，然而，它说明同种型的mRNAs确实特异性地被检测出。由于在凝胶上V-PPi酶的A亚基的转录物也迁移类似的距离，因此在亚基A和V-PPi酶的mRNA检测之间膜被再一次地剥去。
甜菜的贮存根是这样组织，其需要大量的能源供应到液泡膜，以保持蔗糖贮存容量。
图10显示在空泡中实际的两种质子泵显示明显的基底表达，其可以在中性红染色后观察到。
图10显示用于在机械创伤后甜菜贮存薄壁组织细胞中检测V-ATP酶和V-PPi酶的基因表达的Northern印迹分析。在每一种情况下，使用15μgRNA。
在蛋白质水平上V-ATP酶的创伤诱导变化选择Western印迹分析来试验大量V-ATP酶基因的提高的转录水平(在Northern印迹中在创伤后观察到)是否也反映在提高的蛋白质数量上。通过在13％PAA凝胶上的电泳分级分离膜蛋白质和丰富的液泡膜组分，以及总的微粒体组分(所有这些在创伤之后0，10和72小时已经被分离)，并印迹在PVDF膜上。随后用抗K.daigremontiana V-ATP酶全酶抗血清展开膜。它说明在总的微粒体组分中观察到V-ATP酶亚基没有明显的数量变化(
图11B)。在富含液泡膜的组分中，亚基的蛋白质数量在创伤之后也仍然明显保持恒定，有一个例外的情况亚基C(其同种型在mRNA水平上也显示出最强的诱导作用)在创伤之后显著地增加。这种诱导在两种甜菜的富含液泡膜的组份(各自分别分离)中具有相同的强度。
图11显示采用多克隆的抗K.daigremontiana V-ATP酶全酶抗血清进行的Western印迹分析，并显示在甜菜的薄壁组织贮存中液泡膜上V-ATP酶的创伤诱导变化。A.在创伤之后，亚基C蛋白质数量作为时间的函数在富含液泡膜的组分上增加。B.在整个微粒体组分中，各亚基的数量仍然不变。在每一种情况下，使用5μg两种甜菜的分离的膜蛋白质，甜菜11，3和5道；甜菜22，4和6道。
在创伤之后降低的V-ATP酶H+-泵活性如同在上述段落中所描述的，对几种V-ATP酶基因发现mRNA水平的诱导，在创伤之后，通过Western印迹分析发现在液泡膜上提高的亚基C蛋白质水平。这导致产生这样一个问题这些变化是否也引起V-ATP酶提高的质子泵性能。为了研究这一点，在抑制剂钒酸盐(对P-ATP酶)和叠氮化物(对F-ATP酶)的存在下，通过荧光染料吖啶桔黄测定微粒体的分离的膜泡和富含液泡膜的组分的H+-泵活性。代之以蔗糖，泵介质含有250mM山梨糖醇，以排除H+蔗糖抗蛋白(antiporter)造成的影响。
如
图12中显示的，在微粒体组份中的V-ATP酶的H+-泵活性在创伤前后一样高。相反，在创伤之后的3天，富含液泡膜的组分的质子泵活性增加3.3倍。
因此，在液泡膜上蛋白脂质C的蛋白质水平(
图12)(其在创伤后提高)伴随着定位于那里的V-ATP酶的H+-泵活性的明显提高。
图12显示在100μM钒酸盐和1mM叠氮化物的存在下，在微粒体中和富含液泡膜的组份中V-ATP酶的H+-泵活性的创伤诱导改变。在将1mM MgATP添加到微粒体组份(40μg蛋白质)的囊泡中后，吖啶桔黄的荧光(F540)初始降低速率在创伤前后等高，富含液泡膜的组份(10μg蛋白质)显示出3.3倍的增加。所显示的数据是在每种情况下的3个单独的测定的平均值。
序列表110巴斯福股份公司120在组成型植物V-ATP酶启动子控制下的植物基因表达130 BASF-NAE 1074/99140141160 3170 PatentIn 2.1版210 1211 2090212 DNA213甜菜220223启动子亚基C同种型2220221启动子222(1)…(1923)400 1gatatcacac attcgtccat cgacgatttg cgaactttca aataggtacg taattcttt 60aatcttcaaa gttatttcac attagtcgac tattatgtag ttgaaaaaat ggagataata 120ggaattagtt gaaaagggtg tttatataat tagacttaaa tttgattcat tttcatatat 180ctgaaaacaa ggtatgtatg aaatttgatt catttatgac actgatgaaa aagttaacga 240tttagttctt ttttttaaaa ttccaatata aatttttgcc caaaactttt gcaaaatatc 300catgttcgga aataaatttt gaaaaacaaa acaatatcaa acctttttgc gaacaacttt 360tacaaaaatc cattttcaga aaaaaaaatt tacattaact tgcgaaatca aattgtgtat 420gaaaaattta aaatttcctt tcacctataa ttgaaactca aagtgttaaa atttagaaaa 480ggagaaaaat aaaaaatgac catttcatgc gaaatcaaat tgtgtatgaa aaacttaaaa 540ttttatttta aatataattg aaattcaaag tgttaaaatt tagaaaagga gaaaaattaa 600aatgaccatt tcattcaaaa tcagattgtg tatgaaaaat ttaaattttt atttcaaata 660taattgaaac tcaaagtgtg aacatttaga aaaggagaaa aattaaaatg atgaaaattt 720gtaaaacatc aatttgtgaa atcagaattt agaagttaga caaggaaaaa aaactgaatt 780gtcttatact tttcggttac aattttggga tcataaagaa attactgaaa tccatatcaa 840aaactattat aaattacaaa aatgaataaa accaaaaaaa gaagaacatg acgatatttc 900gtaaagaaca tcatactgat tataaaagaa catgcgcata ttagaattga gaaacaaaaa 960actattcaaa atcacaaaaa tggataacaa catacaaaga acatgaaaga atcttattca 1020caaaatggag gtgaacttaa atactaactt gcattttcag tttatttact acttagtatt 1080aggcctaaaa atatcatcgc acgcatcgcg tgcacaaaag actagtgtta agtatcacaa 1140gtcacaaact cacaactgat tttcatttag gctccatttg gtagggcgta aaacgttttc 1200ccggaacact atttttctcc atttttagtt ttacattgtt tggttgacaa aagagtgtaa 1260aaccgttttc ccttggggta aaattactct tccaatgatc gaaaaccatt ttcctttcaa 1320aatgaaggga aaactgtttt ccttatctct cttgttacac ttttctcact acctccttac 1380tttccctttt attttacttt catttcatca ttttctttgc atgaaaccaa acaacggaaa 1440actaattttg gaattgtgtt ttccattgta aattgttttc catgaaaatc attttacact 1500gaaaatgttt tacaccctac caaacagagc cttcgtgtgc catgaatgca tgaccgattt 1560caaattcgaa actggtgttt accgtttcct aattggtttc gagttcacaa ccaagtattc 1620aactatgttg ctcaccctaa agatgaatat ggtaaaacct tgaggtgggc tttggctaaa 1680aaaagtccca ccaagcccca attctaggct cccaaaacca cgaaatttcc tggtactatt 1740ccaaaacaaa aacaaacacc tcctgatcaa accagaaaaa ataaaacata tttttgtttt 1800ctcccaattt ttcattttaa tttatcacgg gaaagtacac aataattcaa tcaagggtaa 1860aaaaaataaa ataaaaagaa aagataagta taaacaaaag aaatttgtct tctctacatc 1920ctcatatttc atccacgctc tcttcttcct ctcctctcat ctcctttttc aattcccaga 1980tcggatcaag caattcatcg aacaccttcc gatcatcacc atcaaaaaaa atgtcaacag 2040tctttaacgg cgatgaaacg gcgccgttct tcggctttct gggtgctgct2090210 2211 1153212 DNA213甜菜220223启动子亚基C同种型2300302甜菜V-型H+-ATP酶亚基A和c同种型的cDNA和基因组克隆在植物发育期间协同表达和在高盐浓度诱导下协同诱导的证据303植物分子生物学304 1999305 39306 463-475400 2gggtgggggt gaagtggggg ctgcaggggt gggtgggggg ggctggtggc aggtattggt 60agtggtgcta ggtggtgatt atggaggaag aagggaaata gaagtggtta acaccgaaaa 120gtgagattaa gttttatctt gcaaaaataa tttatttttt ggtttgtttt cacaaagaat 180gctttattaa ggtttttttt tgcaaaaaac tgaactttta aaaggttttt tttgataaat 240tttcctaata ttaataaatg aaaatttttc taacatggga gatagcctgg acctataact 300agttgttata acttataaga agagaatttt gggcaactat gcggaaaata ggggaaattt 360tggaaaaaat aagtaaaaga ttttaggtgt aaacttgctt gttataagtt ataaacttga 420atttgttcta ttgatagtgt tggttaataa tgtgacaact aaatcgaaca taaaggttta 480ggaccctttc gacatcattg agagttagag gtgggcatga gccgggccag ttcgcgtgct 540ggaacggcca gttcgcgggc tggtacggcc aggcacgagc ccgatcaagg cacgacccgg 600cttgttgtcc gctacgtgga ccgtgggccc atcacggtca aaaaaaaata ttttaggctc 660gcaccagcac gagcccgcgt aggccagccc gcgggctgaa tgttcctttc ctttgttttt 720tagcctaaaa ctgtcataaa tacaaaaaga taacataaaa cacaggctag gccctcaata 780ggcacgagcc cgtggaaaaa atccgaaaat tccaagccta gctagttact cacaagctca 840gacccgattc gtcatttttc caaacccgtg ggccgagccg gtgaacaggc tcggcccggc 900tcatgtccag gtgacaggtc tactgagagt tatgagttgt ttccccatgg gctacttgac 960tacaaacctt ccatagttcc atgacacttc catctgagcc catgagataa aattaaggaa 1020tacaaacaca aaactcaaca accaacccga aatatcgatc ggacttgtta gcacgtgtta 1080tgttgggtcc catccaagaa actttctctc tcctcctcct tcataaaaaa accttctcac 1140tgatcccatc cag1153210 3211 1073212 DNA213甜菜220223启动子亚基A300302甜菜V-型H+-ATP酶亚基A和c同种型的cDNA和基因组克隆在植物发育期间协同表达和在高盐浓度诱导下协同诱导的证据303植物分子生物学304 1999305 39306 463-475400 3gaattctctg ctctggattc gacatcaaaa tttccaccgg gttactattc aaacagactg 60ctcaaatctc atttcttctc ttcgttctat ttcgacggtg cctcgctcta tctactggtc 120tgtatgccag attatgagtc taacaggaaa tcttcactgg tgttttctgc ttaaagtaaa 180ttgtcaaaaa gttcaaaagg cacaaaatgt ggctaagcta tgtgctcaaa tttgttgttt 240actacttgat ttgttttctt tctctttatg cctgtttttt ccccctttgt aaaaaaaaga 300tacaagtata gatgaaggga ttctttatat tggccccatg tgttcgttag ataattacat 360tgtacctcca attcctcatc ttccttgaag ttctacgtag taccattgtg gttgcataag 420caaatgataa tcatactttc atatcttagt taatgtacat cgtcacttgt gcttaacatg 480tcataaacta atttccttgg tttaatactg gttacattaa ctaaatcttt tattcttaaa 540tatttaagaa gtgtgcagta aattaagttt cttccaaatc ctcaataaga cattatactt 600agaaaacttc tataaagtta cttatcaact tacagataac gaccaaagaa tcatcaccaa 660aacagttatc gaaccacata gaagctgcat agcttttgaa aaaggtgaag gtacaatata 720aatctccaac aaatatagtg tatctactcc caaaagctat cctagtaata tccctatctc 780aaaaacatat cttttatcaa ctttttccca acacaaactc aattgttaaa aactacaagg 840aaacgttgtt taaccaatca ctatatttac attaaccata tttttaattt agttaaacct 900ctcaagtctc actacattct taaaaaaagt tggagataga gtcatcataa ttcatagaga 960aggaattgac aacatctaat aagaacgaat tacgaacgtg gcaaaatcac agacgaaaca 1020tagcaaaact taaccctgca aatctcaatc agatttaaat aatccttttg ctg107权利要求
1.一种DNA构建体，该构建体具有与异源基因有效连接的植物V-ATP酶启动子或其功能等同物。
2.如权利要求1所要求的DNA构建体，其中所说的植物V-ATP酶启动子是缺失的或杂种V-ATP酶启动子。
3.如权利要求1或2所要求的DNA构建体，其中所说的植物V-ATP酶启动子来源于双子叶植物。
4.如权利要求1或2所要求的DNA构建体，其中植物V-ATP酶启动子来源于单子叶植物。
5.如权利要求3或4所要求的DNA构建体，其中所说的植物V-ATP酶启动子来源于甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
6.如权利要求1或2所要求的DNA构建体，其中所说的植物V-ATP酶启动子是甜菜V-ATP酶亚基A启动子[SEQ ID No.3]，甜菜V-ATP酶亚基C同种型1启动子[SEQ ID No.2]，或甜菜V-ATP酶亚基C同种型2启动子[SEQ ID No.1]。
7.如权利要求1到6之任一所要求的DNA构建体，该构建体包含能以与第一启动子不同的方式调节的第二启动子。
8.如权利要求1到7之任一所要求的DNA构建体，其中至少一种另外的嘧啶骨架插入到启动子中。
9.如权利要求1到8之任一所要求的DNA构建体，其是表达盒。
10.如权利要求1到9之任一所要求的DNA构建体，其中所说的异源基因是选择标记或抗性介导基因或者具有医学的、农学的或其它用途的基因。
11.一种多核苷酸，其包含甜菜V-ATP酶亚基C同种型2启动子[SEQ ID No.1]或其功能等同物的序列。
12.如权利要求11所要求的多核苷酸，其包含的序列缺失的或杂种甜菜V-ATP酶亚基C同种型2启动子[SEQ ID No.1]或其功能等同物的序列。
13.一种重组载体，其包含如权利要求1至10之任一所要求的DNA构建体。
14.一种如权利要求13所要求的重组载体，其是穿梭载体。
15.一种如权利要求13或14所要求的重组载体，其是表达载体。
16.一种微生物，其是用如权利要求13到15之任一的重组载体转化的。
17.一种转基因植物细胞或原生质体，其基因组包含如权利要求1至10之任一所要求的DNA构建体。
18.一种如权利要求17所要求的转基因植物细胞或原生质体，其来源于单子叶植物。
19.一种如权利要求17所要求的转基因植物细胞或原生质体，来源于双子叶植物。
20.一种转基因植物，其基因组包含如权利要求1至10之任一所要求的DNA构建体。
21.一种如权利要求20所要求的转基因植物，其是单子叶植物。
22.一种如权利要求20所要求的转基因植物，其是双子叶植物。
23.一种如权利要求21或22所要求的转基因植物，其是甜菜，烟草，大麦，水稻，马铃薯，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
24.一种用于在植物细胞或原生质体中控制表达异源基因的方法，该方法包括以如权利要求1至10之任一所要求的DNA构建体转化细胞或原生质体，随后将转化的细胞或原生质体暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便已经借助DNA构建体转化了的异源基因的表达得到控制。
25.如权利要求24所要求的方法，其中所说的植物细胞或原生质体来源于单子叶植物。
26.如权利要求24所要求的方法，其中所说的植物细胞或原生质体来源于双子叶植物。
27.如权利要求25或26所要求的方法，其中所说的植物细胞或原生质体来源于甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
28.一种用于在植物中控制表达异源基因的方法，该方法包括使以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化的细胞或原生质体再生，产生转基因植物，随后将以这种方式转化的植物暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便已经借助DNA构建体转化了的异源基因的表达得到控制。
29.如权利要求28所要求的方法，其中所说的转基因植物是单子叶植物。
30.如权利要求28所要求的方法，其中所说的转基因植物是双子叶植物。
31.如权利要求25或26所要求的方法，其中所说的转基因植物是甜菜，烟草，大麦，水稻，马铃薯，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
32.一种用于产生重组蛋白质的方法，该方法包括以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化植物细胞或原生质体，随后将转化的细胞或原生质体暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便借助DNA构建体转化的重组蛋白质得到表达。
33.如权利要求32所要求的方法，其中所说的植物细胞或原生质体来源于单子叶植物。
34.如权利要求32所要求的方法，其中所说的植物细胞或原生质体来源于双子叶植物。
35.如权利要求33或34所要求的方法，其中所说的植物细胞或原生质体来源于甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
36.一种在植物中产生重组蛋白质的方法，该方法包括使以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化的细胞或原生质体再生，产生转基因植物，随后将产生的转基因植物暴露在这样一种生物或非生物协迫下，以便借助DNA构建体转化的重组蛋白质得到表达。
37.如权利要求36所要求的方法，其中所说的转基因植物是单子叶植物。
38.如权利要求36所要求的方法，其中所说的转基因植物是双子叶植物。
39.如权利要求37或38所要求的方法，其中所说的转基因植物是甜菜，烟草，大麦，水稻，马铃薯，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
40.如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体用于在植物细胞或原生质体中产生重组蛋白质的用途。
41.如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体用于在植物中产生重组蛋白质的用途。
42.一种重组蛋白质，其是用权利要求32到39之任一的方法制备的。
43.如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体用于在生物或非生物协迫下在植物中表达基因的用途。
44.植物V-ATP酶启动子用于在生物或非生物协迫下在植物中表达基因的用途。
45.如权利要求44所要求的用途，其中所说的植物V-ATP酶启动子是缺失的或杂种V-ATP酶启动子。
46.如权利要求45所要求的用途，其中所说的植物V-ATP酶启动子来源于双子叶植物。
47.如权利要求45所要求的用途，其中所说的植物V-ATP酶启动子来源于单子叶植物。
48.如权利要求46或47所要求的用途，其中所说的植物V-ATP酶启动子来源于甜菜，烟草，大麦，水稻，土豆，向日葵，大豆，番茄，Canola，小麦，油菜，高粱，胡萝卜，玉米，Mesembranthemum crystallinum或鼠耳芥。
49.按照权利要求44或45的用途，其中所说的植物V-ATP酶启动子是甜菜V-ATP酶亚基A[SEQ ID No.3]，甜菜V-ATP酶亚基C同种型1[SEQ ID No.2]，或甜菜V-ATP酶亚基C同种型2[SEQ ID No.1]的启动子。
50.如权利要求44到49之一所要求的用途，其中至少一种另外的嘧啶骨架插入到启动子中。
51.一种植物细胞或原生质体，其是以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化的，并且其对生物或非生物协迫具有抗性。
52.一种植物细胞或原生质体，其是以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化的，并且其对盐协迫具有抗性。
53.一种植物，其是以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化的，并且其对生物或非生物协迫具有抗性。
54.一种植物，其是以如权利要求1到10之任一所要求的DNA构建体转化的，并且其对盐协迫具有抗性。
全文摘要
为了表达选择基因和抗性基因,有可供使用的植物组成型启动子是合乎需要的,所说的启动子在尽可能多的植物组织或细胞类型中具有强的均一组成型活性,此外,在协迫条件下,其显示出更强的活性或不受阻抑。本发明提供了DNA构建体,该构建体包含与异源基因有效连接的植物V－ATP酶启动子。本发明还涉及表达盒,重组载体形式的这些构建体在转基因植物,植物细胞或原生质体中的用途。具体地说,本发明涉及甜菜V－ATP酶亚基C同种型2启动子。
文档编号A01H5/00GK1371425SQ00812106
公开日2002年9月25日 申请日期2000年8月10日 优先权日1999年8月26日
发明者E·杜维尼哥, T·劳施 申请人:巴斯福植物科学有限公司