专利名称：一种植物脱病毒快速繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及一种无性繁殖植物脱病毒快速繁殖的方法，具体地说，涉及一种诱导植物进入种子繁殖阶段，形成种子或未成熟种子(胚)，检验其是否带毒，取无病毒种子胚进行组培扩大，然后进行快速繁殖的方法。
背景技术：
无性繁殖植物病毒病的发生相对普遍和严重，所有的植物病毒无一例外均可以通过无性繁殖方式(扦插、嫁接和)垂直传播。该类植物由于没有种子繁殖过程，因此其病毒表现逐渐累积和终身带毒的特点。病毒的长期大量累积，造成无性繁殖植物的种质退化。同时，普遍带毒(几乎所有木本和块茎块根繁殖的植物都100％携带病毒)的植物在自身的生命力下降的同时，引发病毒扩散，可能使周边农作物和经济作物遭受病毒的危害，因此，对无性繁殖植物进行病毒检测是一项非常有价值得工作，尤其是当植物材料来自外地、外国销售品和需要异地扩散时，病毒检测和无病毒繁殖体的采用尤为重要。通过组织培养脱除病毒，获得纯净的植物繁殖体，不仅可以恢复植物生长活力，获得“复壮”效果，同时还能够大大提高植物产品的环境安全性，保障产品销售环节畅通。组织培养获得的无病毒苗，由于可以从一株母体上获得遗传基础和外观、品质形状均一的繁殖体和产品，对于形成植物产品品牌具有无与伦比的优势。
组培与脱病毒苗生产的关键是脱毒技术。获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、芽尖培养脱毒和茎尖微芽嫁接脱毒以及其组合方法。普遍采用的较好的方法是芽尖培养脱毒法，具体的步骤是通过植物顶端分生组织切取小块(0.2mm以下分生组织)，用各部位器官和组织的培养去分化诱导愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株得到脱毒苗是目前通常采用的方法。相关的技术已有许多的专利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用芽尖组织作为外植体，用消毒剂消毒处理后进行组织培养，得到脱毒苗的方法。WO00/78128公开了培养球茎或块茎叶基部分的园顶形组织，获得无毒植物的方法。JP5130816A、JP5084028A公开了一种采用叶芽或苗尖作为外植体在含有6-BA、激动素等激素的固体培养基上培养，获得无病毒人工草莓的方法。
但是这种分生组织脱毒法存在二个问题1)但由于植物愈伤组织中病毒浓度降低的原因目前还存在着争议，获得的脱毒苗不一定完全脱毒，因此需要对大量样品进行病毒检测，而病毒检测往往存在灵敏度的问题；2)需要切取小块顶端分生组织，具有一定难度，切取组织越小，成活率越低，同时，容易造成污染；3)切取组织越小越容易导致变异发生。
因此，农业生产中仍就需要一种更好的脱毒方法。
针对现有技术的不足，本发明者进行了深入细致的研究，结果发明，通过诱导植物种子胚形成，检验其是否带毒，取无病毒种子胚(一种未成熟种子形式)进行组培扩大，然后进行快速繁殖的方法，于是完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的脱病毒方法，它包括如下步骤，通过诱导植物进入种子繁殖阶段，形成种子或未成熟种子(胚)，检验种子胚是否带毒，取无病毒种子胚进行组培扩大，获得大量获得低病毒负荷量的繁殖体，然后进行快速繁殖的方法。
本发明中所述的植物是指在自然条件下不易产生种子的植物，例如，兰科、天南星科、旋花科和姜科植物等，优选兰科、天南星科、旋花科植物。
兰科植物可以是例如兰科药用植物如石斛、金线莲、天麻、兰科花卉植物如中国兰、大花蕙兰，优选兰科药用植物石斛如铁皮石斛、金线莲、天麻，兰科花卉植物如兰花。
天南星科植物可以是例如半夏、魔芋、芋头、海芋、象耳芋、万年青，优选半夏、魔芋、芋头。
本文中所述的种子繁殖阶段形成的是例如未成熟种子胚、未成熟种子和种子，优选未成熟种子胚。
所述的无病毒种子胚可以是上述的未成熟种子胚，也可以取自长在种子或未成熟种子之中种子胚。
本文中所述的病毒指RNA病毒、类病毒、DNA病毒和植物菌原体，优选是RNA病毒。
本发明方法中，通过激素处理所获得的低病毒负荷量繁殖体的随后快速繁殖采用常规的方法进行，例如，组培脱毒前，将整株植物经过茉莉酸类似物处理。
与现有的各种植物脱毒方法相比，本发明的方法具有脱毒成功率更高的优点。无病毒半夏比野生半夏在2年的栽培试验对比中，产量增加至138％～400％，品质明显改观。
实施例本发明通过下文的非限定性实施例进行说明。
实施例1掌叶半夏选取品质上乘的掌叶半夏(Pinellia cordata)40个种球进行盆栽，在43d～60d内开始出现花蕾，用不同株进行人工授粉杂交，25天内获得未成熟种籽，通过未成熟种籽的培养去分化诱导愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，获得新生植株。分别用DsMV基因组的3′末端序列，5 ′-α-32P作标记制备DNA探针，对新的植株进行病毒RNA点杂交检测，确定99％的植株确定不携带该病毒。以不携带DsMV病毒的掌叶半夏珠芽，进行消毒组培，获得组培苗，形成新的无病毒优质种苗。
实施例2盾叶半夏选取个体均一、品质优良的盾叶半夏(Pinellia ternata)30个种球进行盆栽，在36～55内进入开花期，开花前期采用异株人工授粉杂交，37天内获得种籽，无菌水浸种处理生芽，再在无菌条件下切取新芽顶端分生组织接种在MS培养基上，附加一定的植物生长调节剂组合，诱导产生新芽，获得新植株。分别用DsMV基因组的3′末端序列及为模板制备DNA探针，对新的植株进行病毒RNA点杂交检测，确定98％的植株确定不携带该病毒。以不携带DsMV病毒的盾叶半夏珠芽，进行消毒组培，获得组培苗，形成新的无病毒优质种苗。
实施例3芋头选取品质上乘的芋头30个种球进行盆栽，在连续短日照处理30d；每天3h强光照，其余时间暗处理，48天获得开花，异株人工授粉杂交，获得种子，无菌水浸种处理生芽，再在无菌条件下切取新芽顶端分生组织接种在MS培养基上，附加一定的植物生长调节剂组合，诱导产生新芽，获得新植株。分别用DsMV基因组的3′末端序列及为模板制备DNA探针，对新的植株进行病毒RNA点杂交检测，确定98％的植株确定不携带该病毒。以不携带DsMV病毒的盾叶半夏珠芽，进行消毒组培，获得组培苗，形成新的无病毒优质种苗。
对照实施例盾叶半夏将盾叶半夏单个的幼嫩块茎(直径1厘米)分割成50个切片叶片，经75％的酒精浸泡0.5～1min，再用2％的次氯酸钠水溶液消毒15min，或用0.1％氯化汞水溶液消毒10min，然后在无菌条件下用无菌水冲洗，再在无菌条件下切段(块)接种在适宜的培养基上，基础培养基为MS，蔗糖3％，琼脂0.7％，PH5.8，附加一定的植物生长调节剂组合，诱导半夏愈伤组织生成和器官分化。培养温度25±2℃，光强1500LX，光照时间10～12h/d。热处理，茎尖培养(0.5～0.2mn)，愈伤组织诱导成苗。
虽然，在本文中对本发明原理及方法作了详尽的说明，但可以理解，本领域技术人员在本发明基础上可以做出改进或变化，这些内容也属于本发明的范围。
权利要求
1.一种植物脱病毒方法，它包括如下步骤诱导植物进行种子繁殖阶段，形成种子、未成熟种子或种子胚，检验其是否带毒，取无病毒种子胚进行组培扩大，然后进行快速繁殖的方法。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述的无病毒种子胚是未成熟种子胚。
3.根据权利要求1或2的方法，其中，所述的植物选自兰科、天南星科、旋花科和姜科。
4.根据权利要求3的方法，其中，所述的植物选自兰科和天南星科。
5.根据权利要求4之的方法，其中，所述的植物材料选自铁皮石斛、金线莲、天麻、半夏、魔芋和芋头。
6.根据权利要求1-5之任一的方法，其中，所述的病毒选自RNA病毒、类病毒、DNA病毒和植物菌原体。
7.根据权利要求5的方法，其中，所述的病毒为RNA病毒。
全文摘要
本发明涉及一种无性繁殖植物脱病毒快速繁殖的方法，具体地说，涉及一种诱导植物进行进入种子繁殖阶段，形成种子、未成熟种子或种子胚，检验其是否带毒，取无病毒种子胚进行组培扩大，然后进行快速繁殖的方法。
文档编号A01H4/00GK1473464SQ02125978
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月7日 优先权日2002年8月7日
发明者陈集双, 陈洁云, 杜志游, 柴立红, 刘文洪, 施利新, 谷庆琪 申请人:浙江大学, 北京金长河科技发展有限公司