专利名称：高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术的植株再生，以及未分化的人类、动物或植物细胞技术领域，具体涉及到高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法。
背景技术：
喜树碱(Camptothecin，CPT)是我国特有的树种喜树(Camptotheca acuminateDecne)中所含的一种生物碱，是继紫杉醇后又一很有发展前途的植物性抗癌药，是迄今为止发现的唯一一种专门通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的抗癌药物。
传统的喜树碱提取方法采用喜树根皮、果实和叶来提取喜树碱，以根皮为原料需大量砍伐喜树，以果实为原料受季节限制，而且消耗很大而产出很少，不利于喜树资源的有效利用。
早在20世纪50年代，人们就发现离体培养的高等植物细胞具有合成并积累植物产品(次生代谢物)的潜力，随着植物细胞培养技术的发展，使得用此方法来生产植物产品成为可能。现在已有60多种药用植物可通过组织培养技术生产其内含的药物，有30多种药用植物细胞培养物积累的药物等于高于其原来植物的含量，后者包括人参皂甙、迷迭香酸、蒽醌、小檗碱等。随着人们对喜树碱抗癌药物需求的增加，单纯靠从喜树中提取喜树碱已不能满足人们的需要，国内外的许多学者希望通过细胞和组织培养来获得喜树碱，利用植物细胞培养的方法生产喜树碱是一个有益的新探讨。在这方面，日本的Sakato、美国的HelmutWiedenfeld、韩国的Song等人率先进行了研究，取得了一些进展，但上述工作都是以幼茎或幼根为外植体，而且喜树愈伤组织中喜树碱含量很低；我国学者张冬艳等人首次用喜树叶作为外植体，在76种培养基上诱导愈伤组织，经高效液相检测，仅在SH基本培养基上诱导的愈伤组织中含有喜树碱，且由此得到的喜树碱含量约为原植物中喜树碱含量的1/20。目前，在以MS为基本培养基上诱导出含有喜树碱的愈伤组织尚未见报道。如何提高喜树碱含量成为喜树组织培养中亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述喜树愈伤组织培养方法的缺点，提供一种高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法以及适应该方法所用的培养基。
解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括如下步骤(1)外植体制备材料消毒在超净工作台上将取下的喜树叶或喜树叶柄在70％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗2次，每次5分钟，置入0.1％HgCl2溶液中灭菌3～7分钟，用无菌水冲洗3～5次，每次5分钟，无菌滤纸上吸干；(2)愈伤组织诱导将(1)处理好的喜树叶片切成0.5×0.5～1.0cm2的切块，喜树叶柄切成0.5～1.0cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，该诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20～40g琼脂粉5.4～7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25～3.0mg6-(苄胺基)嘌呤0.5～3.0mgpH为6.0，配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于温度为22～26℃、光照强度为2000～3000lx的温室中培养，每天光照12～14小时，培养15～20天，待喜树愈伤组织形成叶后，继续培养30～50天，至喜树愈伤组织褐化。
本发明培养方法中所用的优选诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 25～35g琼脂粉 5.8～6.8g2，4-二氯苯氧乙酸0.8～2.8mg6-(苄胺基)嘌呤 0.6～1.5mg本发明培养方法中所用的最佳诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖 30g琼脂粉6.5g2，4-二氯苯氧乙酸 2.0mg6-(苄胺基)嘌呤1.0mg本发明培养方法采用喜树叶或叶柄为外植体，在MS基本培养基中加入蔗糖、琼脂粉、2，4-二氯苯氧乙酸、6-(苄胺基)嘌呤的培养基中组织培养，得到喜树愈伤组织。采用本发明组织培养方法以及使用的培养基所培养的褐化喜树愈伤组织，经高效液相法测定，测试结果表明褐化喜树愈伤组织中喜树碱的含量为0.8‰以上，远远高于喜树叶中喜树碱的含量和喜树种皮中喜树碱的含量。采用本法所获得的喜树愈伤组织中喜树碱的含量高于现有报道的各种喜树愈伤组织中喜树碱的含量。本发明培养方法以及所采用的培养基，可用于喜树愈伤组织的培养。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1(1)外植体制备材料消毒在超净工作台上将取下的喜树叶或喜树叶柄在70％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗2次，每次5分钟，置入0.1％HgCl2溶液中灭菌3～7分钟，用无菌水冲洗3～5次，每次5分钟，无菌滤纸上吸干。
(2)愈伤组织诱导将(1)处理好的喜树叶片切成0.5cm×0.5cm的切块，叶喜树柄切成0.5cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织。本实施例诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 30g琼脂粉 6.5g2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg6-(苄胺基)嘌呤 1.0mgpH为6.0，配制好的愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟。将培养瓶置于温度为22～26℃、光照强度为2000～3000lx的温室中培养。每天光照12～14小时，培养15～20天，叶切块明显增厚，体积膨大，叶切块切口周围先形成喜树愈伤组织，叶柄切段两端先形成喜树愈伤组织，整个切段形成喜树愈伤组织。喜树愈伤组织质地疏松，绿色略带红，继续培养30～50天，喜树愈伤组织褐化。实验结果表明，叶片的诱导率为87.9％，叶柄的诱导率为84.8％。
实施例2在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例3在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例4在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例5在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉 5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤 3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例6在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例7在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例8在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉 5.4g
2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤 3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例9在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例10在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例11在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例12在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉 5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤 0.5mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例13在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例14在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤3.0mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例15在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 3.0mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg
在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例16在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20g琼脂粉7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例1相同。
实施例17在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 40g琼脂粉5.4g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25mg6-(苄胺基)嘌呤0.5mg在本实施例中其它培养步骤与实施例1相同。
实施例18在以上实施例1～17，愈伤组织诱导工艺步骤中，将喜树叶片切成1.0×1.0cm2的切块，喜树叶柄切成1.0cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，所用的诱导愈伤组织培养基与相应的实施例相同。
为了验证本发明培养方法的可行性以及愈伤组织培养基的最佳配比，发明人进行了大量研究和实验室实验，并采用本发明实施例1培养方法和诱导愈伤组织培养基在实验室诱导出的喜树愈伤组织中喜树碱的含量进行了对比实验，各种实验情况如下实验材料喜树叶、喜树种子、喜树碱标准品、MS基本培养基、奈乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-(苄胺基)嘌呤、玉米素、琼脂粉、蔗糖、甲醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)，奈乙酸实验时名称为NAA，2，4-二氯苯氧乙酸实验时名称为2，4-D，6-(苄胺基)嘌呤实验时名称为6-BA，玉米素实验时名称为ZT。
材料提供单位喜树叶和喜树种子由西安植物园提供，MS基本培养基按照《植物组织培养》一书MS基本培养基配方由陕西师范大学生命科学院中药材组培快繁实验室配制，奈乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸由北京市双旋微生物培养基制品厂生产，6-(苄胺基)嘌呤、玉米素由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，琼脂粉由北京奥博星生物技术责任有限公司生产，蔗糖、甲醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)市售，喜树碱标准品购自sigma公司。
实验仪器超净工作台、锥形瓶、日本日立高效液相色谱仪(HITACHIL-7000)，色谱柱Varian C-18(4.6×250mm)；超声波清洗仪KQ5200，由昆山市超声仪器有限公司生产实验方法与实验结果1、喜树愈伤组织诱导实验将喜树的叶片和喜树叶柄分别接种在1升MS基本培养基中加入蔗糖30g、琼脂粉6.5g及不同种类和不同浓度激素的培养基上，30天后统计喜树愈伤组织诱导率，实验结果见表1。
表1 喜树愈伤组织诱导率表激素(mg/L) 愈伤组织诱导率 愈伤组织的形态2，4-D NAA6-BA ZT 叶片 叶柄0.51.0 +++- +++- 疏松，灰白1.01.0 +++- +++- 疏松，红2.01.0 ++++ ++++ 疏松，略红，易褐化0.51.0 ---- ----1.01.0 ---- ----2.01.0 +--- +--- 紧密，深绿0.1 0.1---- ----*愈伤组织诱导率用+号多少表示，++++表示诱导率在85％以上，+++-表示诱导率在60～85％之间，++--表示诱导率在40～60％之间，----表示诱导率在10％以下。
实验结论用喜树叶片和喜树叶柄做外植体，可诱导出喜树愈伤组织。
2、MS基本培养基中加入不同激素配比对喜树愈伤组织中喜树碱含量的影响分别取实验1中所得到的几种喜树愈伤组织，自然风干，用高效液相色谱仪检测其中喜树碱的含量。
测试方法将采用本发明实施例1组培方法以及诱导愈伤组织培养基所得到的褐化喜树愈伤组织，自然风干，待测。用高效液相色谱仪采用高效液相色谱法。色谱条件色谱柱为C18柱，15cm×0.46cm；流动相甲醇∶水为6∶4，流速0.5ml/min，检测波长254nm。线性关系精密称取4.4mg喜树碱标准品，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，分别精密吸取此标准溶液1、2、3、4、5ml置10ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，分别加入配制的喜树碱标准品溶液10μl，测定峰面积。以稀释过的喜树碱标准品的进样量对峰面积回归得回归方程为Y＝0.000001884A+0.007670586，r＝0.9968。将自然风干的褐化的喜树愈伤组织粉碎，过60目筛，取1g，置50ml锥形瓶中，加70％乙醇20ml，称重，室温下用超声提取15min，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，静置，取上清加样。
实验结果实验结果见表2.
表2 不同激素配比对喜树愈伤组织中喜树碱含量的影响表序号 不同激素配比(mg/L)愈伤组织的形态 喜树碱量(‰)1 2，4-D0.5，6-BA1.0疏松，灰白 0.0152 2，4-D1.0，6-BA1.0疏松，红0.0223 2，4-D2.0，6-BA1.0疏松，略红，易褐化 0.8274 NAA 2.0，6-BA1.0 紧密，深绿 0实验结论在以1升MS基本培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg、6-(苄胺基)嘌呤1.0mg、蔗糖30g、琼脂粉6.5g的诱导愈伤组织培养基，诱导出的褐化的喜树愈伤组织中喜树碱含量最高，为0.827‰。
3、喜树不同组织和喜树愈伤组织中喜树碱含量的测定取喜树老叶、喜树嫩叶、喜树种皮以及采用实施例1培养方法和诱导愈伤组织培养基诱导出的褐化的喜树愈伤组织，用高效液相色谱仪采用2中的测试方法，分别对喜树老叶、喜树嫩叶、喜树种皮以及喜树愈伤组织中喜树碱的含量进行了对比测试实验。
测试结果测试结果见表3。
表3 喜树不同组织和喜树愈伤组织中喜树碱的含量表不同组织部位 喜树碱含量(‰)老叶 0.067嫩叶 0.927种皮 0.220喜树愈伤组织 0.827实验结论喜树愈伤组织中喜树碱含量较高，达0.827‰，略低于喜树嫩叶中喜树碱的含量，高于喜树老叶和种皮中喜树碱的含量，高于喜树中喜树碱的平均含量。
权利要求
1.一种高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法，其特征在于它包括如下步骤(1)外植体制备材料消毒在超净工作台上将取下的喜树叶或喜树叶柄在70％酒精中浸泡10～30秒，无菌水冲洗2次，每次5分钟，置入0.1％HgCl2溶液中灭菌3～7分钟，用无菌水冲洗3～5次，每次5分钟，无菌滤纸上吸干；(2)愈伤组织诱导将(1)处理好的喜树叶片切成0.5×0.5～1.0cm2的切块，喜树叶柄切成0.5～1.0cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，该诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 20～40g琼脂粉 5.4～7.2g2，4-二氯苯氧乙酸 0.25～3.0mg6-(苄胺基)嘌呤0.5～3.0mgpH为6.0，配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于温度为22～26℃、光照强度为2000～3000lx的温室中培养，每天光照12～14小时，培养15～20天，待喜树愈伤组织形成叶后，继续培养30～50天，至喜树愈伤组织褐化。
2.按照权利要求1所述的高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法，其中诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 25～35g琼脂粉 5.8～6.8g2，4-二氯苯氧乙酸 0.8～2.8mg6-(苄胺基)嘌呤0.6～1.5mg
3.按照权利要求1所述的高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法，其中诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖 30g琼脂粉6.5g2，4-二氯苯氧乙酸 2.0mg6-(苄胺基)嘌呤1.0mg
全文摘要
一种高含量喜树碱的喜树愈伤组织培养方法，其步骤包括(1)按常规方法制备外植体；(2)愈伤组织诱导将(1)处理的喜树叶片切成0.5×0.5～1.0cm
文档编号A01H4/00GK1454466SQ03134208
公开日2003年11月12日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者王喆之, 强小利, 田宇红, 李发荣 申请人:陕西师范大学