一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属农业微生物应用领域，具体涉及一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
目前农业生产中，随着作物的长期重茬连作，土壤病菌长期积累，土传病害严重发生，加之化学农药、化肥的不当使用，导致土壤板结和盐碱化严重，农产品的产量大幅下降，甚至绝收，品质差，价格低，对农民影响很大。因此，如何发展和正确使用生物杀菌剂是发展有机、绿色农业的首选课题。现有技术公开了多种微生物杀菌剂，如中国申请200910016337. O公开了一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用，该申请所提供的哈茨木霉MDCGTH 18复合菌培养物是利用拮抗性微生物进行生物防治，同时又具有诱导植物抗病性及增产功能，对山杨根腐病、苹果轮纹病、柑橘黄龙病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、全蚀病、根腐病、纹枯病、黄瓜白粉病、霜霉病、蔬菜灰霉病、枯萎病等多种疫病具有一定的防治效果。然而实际应用过程中发现，单独使用哈慈木霉菌作为防治因子防治植物病害时，容易受到自然环境条件因素的干扰，造成田间防治效果不理想、不稳定。此外，本领域技术人员知道，生防菌与化学药剂混用，并非完全具有叠加作用。由于土壤生态的复杂性，在菌药互作过程中，化学药剂是否削弱了生防菌的定殖与存活，生防菌对化学药剂是否产生了加速分解作用，都将影响到二者防治效果的发挥，因此只有充分了解土壤、化学药剂、生防菌及病原菌之间的相互关系，才能明确菌药联合防治的作用机理。因此，如何找到一种理想的生防菌与化学药剂的复配方式，是本领域技术人员一直想要解决的技术难题。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容
为克服现有化学杀菌剂功效单一和长期施用致使病原菌抗性增强的缺点，本发明提供了一种复合微生物杀菌剂，所述复合微生物杀菌剂按重量份计由包括如下组分的原料制备而成复合菌剂10-20份；营养成分10-20份；酶活物质2_6份；杀菌剂载体54_78份。优选地，该复合微生物杀菌剂按重量份计由包括如下组分的原料制备而成复合菌剂15份；营养成分15份；酶活物质4份；杀菌剂载体66份。所述复合菌剂中主要含有生防促生菌和蛋白分解菌。所述复合菌剂中的生防促生菌为哈慈木霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌；所述蛋白分解菌为枯草芽孢杆菌；其中，所述复合菌剂中含有哈茨木霉4. 5-7. 5X108cfu/g、绿色木霉2_4X IO8Cfu/g、地衣芽孢杆菌1-3X 108cfu/g、枯草芽孢杆菌O. 5-1. 5X108cfu/g ;优选为所述复合菌剂中含有哈茨木霉6 X IO8亿cfu/g、绿色木霉3 X 108cfu/g、地衣芽孢杆菌2 X IO8亿cfu/g、枯草芽孢杆菌lX108cfu/g。本发明选择的四个菌种分别如下①哈茨木霉(Trichoderma harzianum)中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心 ACCC 31707 ；②绿色木霉(Trichoderma viride)中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心 ACCC30552 ；③枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心 ACCC10118 ； ④地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心ACCC10618。本发明的复合微生物杀菌剂，可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害。其主要有效成分为哈茨木霉菌，它广泛存在于自然界中。哈茨木霉菌是木霉菌中应用最早最广的一个菌种，哈茨木霉菌对植物根系的缠绕能力和定植能力强，对病害的防治能力强，可以在沙壤土和粘性土壤中良好的定植繁殖，应用更具适应性。本发明的复合微生物杀菌剂主要防治对象是立枯病、猝倒病和根腐病等真菌性根部病害，以及灰霉病等叶部病害。本发明产品使用方便，适用于各种作物的根系，同时也可以适用于作物叶面及收获储藏期。推荐采用苗床处理，可以采用浸种、蘸根、淋施，也可以随肥水灌溉或单独灌根使用，或者叶面喷雾处理；使用该产品可以避免和减少化学杀菌剂的用量，减少化学药剂对环境的污染，降低病原菌的抗药性，进而降低病害的投入成本，经济环保；在根部使用该产品可以持续3个月以上，在叶部喷施可以持续7-15天，减少用药次数和劳动投入，持效期长。本发明所述的复合微生物杀菌剂，所述营养成分包括氮、磷、钾养分，以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钥微量元素；优选所述营养成分是将尿素、磷酸二氢钾和硫酸钾以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钥即CTE，按照尿素磷酸二氢钾硫酸钾CTE=2. 83:3. 27:1.78:10的重量比例混合均匀制得。所述螯合微量元素(Chelatedtrace elements,缩写为CTE),是按照腐植酸钾(Potassium humate缩写成PHU):硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20):硫酸铜(CuSO4):硫酸锰(MnSO4 · H20):硫酸锌(ZnSO4 · 7H20):硼砂(Na2B4O7 · IOH2O) =20:1:1:1:1:0. 5的重量比例均匀混合制得。本发明所述的复合微生物杀菌剂，所述酶活物质为蛋白粉和活性酶，所述酶活物质是按照蛋白粉活性酶为300:1-100:1，优选200:1的比例混合均匀制成。其中，所述的蛋白粉和活性酶可采用现有技术公开的各种可用于复合微生物杀菌剂的蛋白粉和活性酶。作为最佳实施方式，本发明优选蛋白粉由安阳市得天力食品有限责任公司提供的含蛋白质(干基)％彡50，水分％ ( 9. 0，脂肪％ ( 2. O,细度100目筛上物彡1%的蛋白粉；活性酶即蛋白酶，优选由上海蓝基生物科技有限公司提供的蛋白酶。本发明所述的复合微生物杀菌剂，所述杀菌剂载体为膨润土和/或海泡石粉。本发明所述的复合微生物杀菌剂，其中的复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到
细菌混合孢子粉的制备将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液按1:3-4:5比例的重量进行混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉，优选上述两种发酵液的重量比为1:2 ;真菌混合孢子粉的制备将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌孢子粉；然后按照3:2-4:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉，优选上述两种孢子粉的重量比为2:1 ;
将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:5-1:2的重量比混合，从而制备得到复合菌剂，优选上述两种孢子粉的重量比为1:3。作为本发明的一种优选实施方式，所述复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到细菌混合孢子粉的制备①斜面培养将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29 土 1°C条件下培养36-48h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 5-7. O、温度为 30°C条件下，140-160r/min 摇床培养 36_48h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在ρΗ7· 5-8. O、罐压O. 5kg、温度为30°C、通风量I: O. 8-1. I条件下，培养48_56h后，菌数大于I. O X IOltVmL, 80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；④将步骤③中得到的发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；真菌混合孢子粉的制备①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1°C条件下培养48h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 5-6. 8、温度为 30°C条件下，160-200r/min 摇床培养 24h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6. 5-6. 8、罐压O. 5kg、温度为27-28 °C、通风量为I: O. 7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；④固体发酵产孢将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；⑥将上述步骤⑤中得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照2 1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉；将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:3的重量比混合，从而制备得到复合菌剂。上述细菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g ；步骤②中的液体培养基配方如下葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉 5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4O. 2g、水 IOOOmL ；步骤③中的发酵罐培养基配方如下玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2. 5kg、蛋白胨I. 7kg、加水至600kg ；上述真菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下葡萄糖 20g、土豆汁 200g、琼脂 20g、水 IOOOmL ；步骤②中的液体培养基配方如下白糖20g、酵母膏0. 5g、淀粉20g、磷酸二氢钾
0.5g、硫酸镁 0. 2g、氯化钠 0. 2g、水 IOOOmL ；步骤③中的发酵罐培养基配方如下淀粉12kg、豆饼粉I. 2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0. 3kg、硫酸镁0. 12kg、氯化钠0. 12kg、加水至600kg ；步骤④中的固体发酵培养基配方如下固体料棉籽壳25%、玉米粉10%、麸皮65% ；固体料与水的重量比为1:0.8。采用上述培养基，本发明能够准确快速获得稳定足额含量的孢子粉，保证本发明产品生产得以顺利进行。同时采用本培养基材料简单易行，成本低廉，技术容易操作。此外，本发明还提供一种制备上述复合微生物杀菌剂的制备方法。具体地是将按照重量份计的10-20份复合孢子粉、10-20份营养成分、2_6份酶活物质、54-78份杀菌剂载体混合搅拌均匀制备得到。优选地，其是将按照重量份计的15份复合孢子粉、15份营养成分、4份酶活物质、66份杀菌剂载体混合搅拌均匀制备得到。本发明还提供上述复合微生物杀菌剂在农作物生产中的应用。所述复合微生物杀菌剂为粉剂或颗粒剂。具体的制剂为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定。本领域技术人员可以预见采用本发明所述的复合微生物杀菌剂与合适的辅料可以制备出具有显著杀菌效果的粉剂或者颗粒剂。该复合微生物杀菌剂可在翻耕时拌土撒施，也可进行沟施、穴施，浸种、蘸根、淋施，也可以随肥水灌溉或单独灌根使用，或者叶面喷雾处理。本发明所述复合微生物杀菌剂能迅速在植物根围定植生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染，同时在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗生素和植物生长等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，特别是对重茬植地的根腐病、立枯病、霜霉病、枯萎病等土传病害有特效，同时具有促根催芽作用，促进农作物健康生长，从而提高产量，改善品质。采用上述技术方案，本发明的优点是I、本发明的微生物种类搭配合理，哈茨木霉和绿色木霉组合，在植物根围生长并形成“保护罩”，产生的拮抗、杀菌作用互补性更强；地衣芽孢杆菌能产生多种蛋白酶和拮抗物质以及细胞分裂素和脱落酸等；枯草芽孢杆菌和哈茨木霉搭配后，能增强产品的蛋白酶活性和拮抗农作物病原菌的能力，起到生防促生作用。2、本发明的有效菌制备方法先进科学，简便可行，孢子数含量高，存活时间长。加入酶活物质能使孢子在植物根际迅速定植生长，加入营养成分能为孢子在根际快速定殖提
供能量。3、本发明的复合微生物杀菌剂技术处在国际领先前沿。优势作用在于能在植物根围、叶围迅速生长，抢占植物体表面位点，形成一个“保护罩”。在与病原菌互作的过程中形成重寄生作用，分泌胞外酶溶解细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养，进而将病原菌杀死。同时分泌一部分抗生素和植物生长调节物质，增强植物的长势和抗病能力。4、本发明的复合微生物杀菌剂是粉状或颗粒状剂型，能溶于水。施用方法简便实用，即可翻耕时撒施，又可穴施、沟施，浸种，蘸根，淋施，也可以随肥水灌溉或单独灌根使用，或者叶面喷雾处理。5、本发明的复合微生物杀菌剂在生产上应用效果好用本发明的复合微生物杀菌剂对几种蔬菜进行处理，通过对蔬菜不同生育期的农艺性状、经济性状、产量和病害发展情况的考察，研究其生物防治效果及促生作用。结果表明，本发明的复合微生物杀菌剂对黄瓜枯萎病和黄瓜白粉病有很好的生物防治效果，并能有效控制芹菜病毒病的发展，且对供试植株安全；同时对蔬菜有显著的促生作用，能增加植株的株高、地茎、叶片数，有效提高蔬菜的品质和产量；灰霉病是草莓栽培中最普遍的一种病害，主要发生在果实、花瓣、萼片及枝叶等部位上，特别是保护地草莓，在果实趋成熟时最易发病。如果遇到连续阴雨天气，发病最为严重，造成严重损失。利用本发明的复合微生物杀菌剂防治保护地草莓灰霉病效果显著。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I复合微生物杀菌剂本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成
复合菌剂IOkg营养成分IOkg ;酶活物质2kg ;杀菌剂载体78kg。上述复合菌剂中含有哈茨木霉4. 5X108cfu/g ;绿色木霉2 X 108cfu/g ;枯草芽孢杆菌O. 5X 108cfu/g ;地衣芽孢杆菌IX 108cfu/g ;有效菌总含量彡8X 108cfu/g。其中，上述复合菌剂由以下步骤制得细菌混合孢子粉的制备①斜面培养将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29 土 1°C条件下培养48h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 5、温度为30°C条件下，160r/min摇床培养36h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH8. O、罐压O. 5kg、温度为30°C、通风量1:0. 8条件下，培养56h后，菌数大于I. OX IOkiAiL, 80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；在上述细菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼脂15g。
上述步骤②中的液体培养基配方如下葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉 5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4O. 2g、水 1000mL。上述步骤③中的发酵罐培养基配方如下玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2. 5kg、蛋白胨I. 7kg、加水至600kg。真菌混合孢子粉的制备①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29±1°C条件下培养48h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 6、温度为30°C条件下，160r/min摇床培养24h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养 基，在pH6. 6、罐压0. 5kg、温度为28°C、通风量为1:0. 7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；④固体发酵产孢将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢；⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照4. 5:2的重量比混合配制成真菌混合孢子粉。在上述真菌混合孢子粉的制备中，步骤①中选用的斜面培养基的配方如下葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水IOOOmL, pH自然。上述步骤②中的液体培养基配方如下白糖20g、酵母膏0.5g、。淀粉20g、磷酸二氢钾0. 5g、硫酸镁0. 2g、氯化钠0. 2g、水1000mL。上述步骤③中的发酵罐培养基配方如下淀粉12kg、豆饼粉I. 2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0. 3kg、硫酸镁0. 12kg、氯化钠0. 12kg、加水至600kg。上述步骤④中的固体发酵培养基配方如下固体料棉籽壳25kg、玉米粉10kg、麸皮65kg。固体料与水的重量比为1:0. 8。将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照I. 5:6. 5的重量比混合，从而制备得到复合微生物杀菌剂。本实施例中，酶活物质为蛋白粉和活性酶，具体为由安阳市得天力食品有限责任公司提供的含蛋白质(干基)%彡50，水分％ ( 9. 0，脂肪％ ( 2. 0，细度100目筛上物彡1%的蛋白粉；活性酶由上海蓝基生物科技有限公司提供。所述营养成分是将尿素、磷酸二氢钾和硫酸钾以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、猛和钥等(简称螯合微量元素Chelated trace elements,缩写为CTE),按照尿素磷酸二氢钾硫酸钾CTE=2. 83:3. 27:1. 78:10的重量比例混合均匀制得。所述螯合微量元素(Chelated trace elements,缩写为 CTE),是按照腐植酸钾(Potassium humate 缩写成PHU):硫酸亚铁(FeSO4WH2O):硫酸铜(CuSO4):硫酸锰(MnSO4-H2O):硫酸锌(ZnSO4WH2O)硼砂(Na2B407 · IOH2O) =20:1:1:1:1:0. 5的重量比例均匀混合制得。所述杀菌剂载体为膨润土和海泡石粉，二者用量的重量比为2:1。实施例2复合微生物杀菌剂的构成
与实施例I相比，区别点仅在于本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成为复合菌剂20kg ;营养成分20kg ;酶活物质4kg ;杀菌剂载体56kg。上述复合菌剂的构成哈茨木霉7. 5 X 108cfu/g ;绿色木霉4 X 108cfu/g ;枯草芽孢杆菌I. 5 X IO8亿cfu/g；地衣芽孢杆菌3X IO8亿cfu/g;有效菌总含量> 12X108cfu/g。其中，上述复合菌剂由以下步骤制得细菌混合孢子粉的制备
①斜面培养将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29 土 1°C条件下培养36h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在PH7、温度为30°C条件下，140r/min摇床培养48h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在PH7. 5、罐压O. 5kg、温度为30°C、通风量1:1. I条件下，培养48h后，菌数大于
I.O X IOkiAiL, 80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按4:5的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；真菌混合孢子粉的制备①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1°C条件下培养48h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 8、温度为30°C条件下，200r/min摇床培养24h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6. 8、罐压O. 5kg、温度为27°C、通风量为1:0. 7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；④固体发酵产孢将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%产孢；⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照4:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉。将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:2的重量比混合，从而制备得到复合微生物杀菌剂。实施例3与实施例I相比，区别点仅在于本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成为复合菌剂15kg ;营养成分15kg ;酶活物质4kg ;杀菌剂载体66kg。上述复合菌剂的构成哈茨木霉6X 108cfu/g ;绿色木霉3X 108cfu/g ;枯草芽孢杆菌I X IO8亿cfu/g;地衣芽孢杆菌2X IO8亿cfu/g;有效菌总含量> 12X 108cfu/g。其中，上述复合菌剂由以下步骤制得
细菌混合孢子粉的制备①斜面培养将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29 土 1°C条件下培养36h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 8、温度为30°C条件下，150r/min摇床培养42h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH7. 8、罐压O. 5kg、温度为30°C、通风量I: I条件下，培养48h后，菌数大于I. OX 101°/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；④将步骤③中得到的枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉；真菌混合孢子粉的制备 ①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1°C条件下培养48h ；②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 6、温度为30°C条件下，180r/min摇床培养24h ；③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6. 6、罐压O. 5kg、温度为27°C、通风量为1:0. 7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；④固体发酵产孢将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%产孢；⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液；⑥将上述步骤⑤得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照2:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉。将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:3的重量比混合，从而制备得到复合微生物杀菌剂。实施例4与实施例3相比，区别点仅在于本实施例所述复合微生物杀菌剂的组成为复合菌剂20kg ;营养成分20kg ;酶活物质6kg ;杀菌剂载体54kg。上述复合菌剂的构成哈茨木霉7. 5X108cfu/g ;绿色木霉4X108cfu/g ;枯草芽孢杆菌I. 5X108亿cfu/g;地衣芽孢杆菌3X 108亿cfu/g;有效菌总含量> 12X108cfu/g。为了进一步验证本发明所述的复合微生物杀菌剂的优越性能，发明人对此展开了一系列研究试验，篇幅所限，此处仅例举个别实施例的试验数据，本领域技术人员能够理解以本发明其他实施例重复下述试验，也能够得到相同或相近的试验结论。试验例I复合微生物杀菌剂防治番茄茎基腐病效果试验生物防治作物病虫害，既保护了环境，维护了生态平衡，又避免了因使用农药对农产品造成的污染，促进了生态农业的可持续发展，因而已经成为现代农业发展的总趋势。本发明所述的复合微生物杀菌剂(即HT安德克，下同)中的木霉菌是一种有益微生物，广泛存在于土壤中。如何更好地利用它，是目前值得探讨的课题之一。发明人2009年在浏阳市生态农业园的保护地番茄上进行了 HT安德克防治茎基腐病效果试验，现将试验情况总结如下一、供试材料I.试验地试验地设在浏阳市农业科技园邱锡光的日光温室内。该温室全年种植秋延迟、早春两茬番茄，已连续种植5年，目前番茄茎基腐病发生频繁，为害严重，一般年份减产10%以上，严重年份达到30%。2.试验药剂供试药剂本发明实施例I (又名HT安德克制剂)(有效菌总含量彡8X108cfu/g);由湖南泰谷生物科技股份有限公司生产；对照杀菌剂50%福美双可湿性粉剂，由济南艾格福生产实业有限公司生产。 二、田间设计与试验方法设HT安德克制剂(即实施例I)、福美双、清水对照共3个处理组，随机区组排列，重复3次，小区面积为10m2。每个小区定植株数为45株。番茄共留3穗果，打顶。试验方法一是育苗期将HT安德克制剂与番茄种子按重量比I : 5进行拌种，50%福美双稀释100倍液拌种；二是在番茄定植时穴施，HT安德克制剂每穴施I克，50%福美双可湿性粉剂用300倍液灌根；三是在番茄生长期间，将HT安德克制剂与追肥一起补施于田间，每667m2用HT安德克制剂3_5kg+尿素5_7kg+细黄土 10_20kg，充分混匀施入。50%福美双可湿性粉剂用500倍液灌根。对照清水均采取灌根处理。三、结果与分析I.病情调查调查出苗率、成苗率及感病指数。每个小区固定10株，分别记载每级病株数。O级无病斑；1级茎基部病斑占总面积的1% 30% ；2级茎基部病斑占总面积的31% 50% ；3级茎基部病斑占总面积的50%以上。最后统计病情指数。2.试验结果①不同处理组对出苗率和成苗率的影响。在番茄育苗试验中，采用HT安德克制剂处理的番茄出苗率高达95. 2%，比清水对照组提高21. 4%，幼苗叶片浓绿，茎杆粗壮，成苗率达100% ;采用福美双处理组的出苗率为93. 4%，成苗率为89. 5%ο移栽后成苗死亡率采用HT安德克处理组的为O. 39%，用50%福美双可湿性粉剂处理组的为17. 4%，而清水对照为34. 2% (详见表I)。表I不同处理组对番茄苗期的影响
处理组出苗率％~ 成苗率％~ 移栽后死亡率％
HT 安德克9^2100039
福美双9^489. 54 ΤΛ
清水对照WlTA~23H②对番茄根系的影响。在番茄第二穗果膨大时，挖根调查，采用HT安德克处理组的植株，不定根数量明显增多，从定点调查的10株来看，单株不定根的总量平均是清水对照的9. 6倍，且不定根粗壮、有光泽，而清水对照不定根数量少且细、颜色暗淡。③对茎基腐病发病率的调查。番茄打顶后用HT安德克处理的小区，植株生长旺盛，没有出现早衰现象，定点调查10株，茎基腐病发病率仅为8. 15%，感病指数为I. 92，采用福美双处理的发病率、感病指数分别为52. 8%,38. 9，而清水对照发病率、感病指数则分别为71%、54. I (详见表 2)。表2不同处理组成株发病率
权利要求
1.一种复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合微生物杀菌剂按重量份计由包括如下组分的原料制备而成 复合菌剂10-20份； 营养成分10-20份； 酶活物质2-6份； 杀菌剂载体 54-78份。
2.根据权利要求I所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中含有生防促生菌以及蛋白分解菌；所述生防促生菌为哈茨木霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌；所述蛋白分解菌为枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中含有哈茨木霉4. 5-7. 5X 108cfu/g、绿色木霉2-4X 108cfu/g、地衣芽孢杆菌1-3X 108cfu/g、枯草芽孢杆菌O. 5-1. 5X108cfu/g ;优选为所述复合菌剂中含有哈茨木霉6 X IO8亿cfu/g、绿色木霉3X 108cfu/g、地衣芽孢杆菌2X IO8亿cfu/g、枯草芽孢杆菌IX 108cfu/g。
4.根据权利要求I所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述营养成分包括氮、磷、钾养分，以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钥微量元素；优选所述营养成分是将尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾以及用腐植酸钾螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钥即CTE，按照尿素磷酸二氢钾硫酸钾CTE为2. 83:3. 27:1. 78:10的重量比例混合均匀制得。
5.根据权利要求I所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述酶活物质为蛋白粉和活性酶，所述酶活物质是按照蛋白粉活性酶为300:1-100:1的比例均匀混合制成；优选地所述酶活物质是按照蛋白粉活性酶为200:1的比例均匀混合制成。
6.根据权利要求I所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂载体为膨润土和/或海泡石粉。
7.根据权利要求I所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到 细菌混合孢子粉的制备 将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液按1:3-4:5的重量比进行混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉； 真菌混合孢子粉的制备 将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌孢子粉；然后按照3:2-4:1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉； 将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:5-1:2的重量比混合，从而制备得到复合菌剂。
8.根据权利要求7所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由包括如下步骤的方法制备得到 细菌混合孢子粉的制备①斜面培养将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在29 土 1°C条件下培养36-48h ； ②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 5-7. O、温度为 30°C条件下，140-160r/min 摇床培养 36_48h ； ③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在ρΗ7· 5-8. O、罐压O. 5kg、温度为30°C、通风量1:0. 8-1. I条件下，培养48_56h后，菌数大于I.O X KT/mL，80%菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液； ④将步骤③中得到的发酵液按1:2的重量比混合，经过浓缩干燥制备成细菌混合孢子粉； 真菌混合孢子粉的制备 ①将哈茨木霉、绿色木霉的原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±1°C条件下培养48h ； ②摇床培养将上述步骤①培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6. 5-6. 8、温度为 30°C条件下，160-200r/min 摇床培养 24h ； ③发酵罐培养将上述步骤②培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6. 5-6. 8、罐压O. 5kg、温度为27-28°C、通风量为1:0. 7，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢； ④固体发酵产孢将上述步骤③经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养48h，90%菌体转成芽孢； ⑤将上述步骤④中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液； ⑥将上述步骤⑤中得到的哈茨木霉孢子悬浮液、绿色木霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然后，按照2 1的重量比混合配制成真菌混合孢子粉； 将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照1:3的重量比混合，从而制备得到复合菌剂。
9.根据权利要求8所述的复合微生物杀菌剂，其特征在于，所述细菌混合孢子粉的制备中 步骤①中选用的斜面培养基的配方如下葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水lOOOmL、琼脂 15g ； 步骤②中的液体培养基配方如下葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4O. 2g、水 10OOmT,； 步骤③中的发酵罐培养基配方如下玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2. 5kg、蛋白胨I. 7kg、加水至600kg ； 所述真菌混合孢子粉的制备中 步骤①中选用的斜面培养基的配方如下葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水10OOmT,； 步骤②中的液体培养基配方如下白糖20g、酵母膏0. 5g、淀粉20g、磷酸二氢钾0. 5g、硫酸镁0. 2g、氯化钠0. 2g、水IOOOmL ； 步骤③中的发酵罐培养基配方如下淀粉12kg、豆饼粉I. 2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏O. 3kg、硫酸镁O. 12kg、氯化钠O. 12kg、加水至600kg ； 步骤④中的固体发酵培养基配方如下固体料棉籽壳25%、玉米粉10%、麸皮65% ;固体料与水的重量比为1:0. 8。
10.权利要求1-9任一项所述的复合微生物杀菌剂在农作物生产中的应用，其特征在于，所述复合微生物杀菌剂为粉状或颗粒状剂型。
全文摘要
本发明提供一种复合微生物杀菌剂及其制备方法和应用。所述的复合微生物杀菌剂按重量份计由复合菌剂10-20份、营养成分10-20份、酶活物质4-6份及杀菌剂载体54-78份组成。所述复合菌剂中含有生防促生菌和蛋白分解菌，所述生防促生菌为哈茨木霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌；所述蛋白分解菌为枯草芽孢杆菌。本发明还提供一种上述复合微生物杀菌剂的制备方法。本发明提供的复合微生物杀菌剂能迅速在植物根围定植生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染，并在与病原菌互作和重寄生过程中产生抗生素和植物生长等物质，能显著预防、拮抗或直接杀死农作物多种病害，同时具有促根催芽作用，促进农作物健康生长，从而提高产量，改善品质。
文档编号C05G3/00GK102964178SQ201210453530
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者曹典军, 唐八生, 彭群, 林炜, 郭帅, 蔡浩 申请人:湖南泰谷生物科技股份有限公司