专利名称：增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物杀虫剂及其制备方法和应用，特别是涉及一种通过增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒而制成的生物杀虫剂及其该杀虫剂在防治蜀柏毒蛾病虫危害方面的应用。
背景技术：
蜀柏毒蛾俗称柏毛虫，是柏木林区危害十分严重的食叶害虫，尤其是我省川中、川北的柏木林区。1989年我们在四川省金堂县采集到一批自然病死虫，经分离、鉴定、室内毒力生物测定和林间初步应用表明该病毒是一株蜀柏毒蛾新毒株，经中国科学院武汉病毒所鉴定为蜀柏毒蛾核型多角体病毒(paroceneria orient Nuclear PolyedrosisVirus，简称PoNPV)，有关论文已刊登在《中国病毒学》1991年(第6卷)第4期，且该毒株也被中国科学院武汉病毒保贮中心收藏。
该毒株具有以下生物学特征1、核型多角体的形态及大小在光学显微镜下低倍观察，可见很多折光性强的颗粒，高倍镜下，可见其四边形、五边形的轮廓。将提纯的多角体用电镜观察，多角体呈明显的四边形和五边形，边角钝圆，有的呈圆形，其大小为1.06-3.3u；2、应用5种限制性内切酶对蜀柏毒蛾核型多角体病毒基因组DNA进行的酶切分析该株病毒经热处理的多角体蛋白仅有一条，分子量为31.5KD，不经热处理的多角体蛋白有三条带，分子量分别为31.5KD、29.1KD、28.6KD。病毒粒子包含有25种结构的多肽，分子量范围在17.6-114.6KD之间。多角体DNA经Bam HI、EcoRI、HindIII、PstI、XhoI酶切分析产生9、12、12、12和14条片段。基因组大小平均为124.6Kb；3、病毒粒子的形态大小将提纯的多角体用0.05mol/L Na2CO3-O.1mol/L NaCl碱解液在常温下碱解，分别在碱解30分钟、40分钟、50分钟和60分钟时取样，用2％PTA负染，JEM-100C电镜观察。多角体在30分钟被部分碱解，60分钟时，病毒粒子基本上被释放出来。电镜下病毒粒子呈杆状，两端钝圆，大小为385×40nm；4、蜀柏毒蛾核型多角体病毒毒力将提纯的多角体，制成多角体含量分别为为1.67×108/ml、1.67×10710/ml、1.67×10610/ml、1.67×10510/ml、1.67×104/ml浓度病毒悬液进行生物测定，用2-3龄健康属柏毒蛾幼虫在室内饥饿12小时后，以小型电动喷雾器将病毒液均匀喷洒在新鲜干净枝桠，晾干后，插入盛水瓶内，饲喂蜀柏毒蛾供试幼虫，72小时后更换新鲜无毒枝桠，并进行观察记载。饲毒3-4天后幼虫取食量减少，开始呈现感病症状，在室温29℃条件下，12天后死亡率可达90.50％、78.00％、60.70％、45.40％、46.10％，以中间三个浓度计算该病毒对2-3龄蜀柏毒蛾幼虫的半致死时间分别为7.66天、9.70天核12.41天，致死中浓度为7.15×104包涵体/摩尔；5、蜀柏毒蛾核型多角体病毒种类鉴定根据人工感染该病毒后幼虫所表现的病状、多角体和病毒粒子的形态及大小，根据国际病毒分类与命名系统，即所分离的是一种核型多角体病毒，属杆状病毒科(Baculoviridae)，杆状病毒属(Baculovirus)，取名蜀柏毒蛾核型多角体病毒(paroceneria orient Nuclear Polyedrosis Virus，简称PoNPV)。
传统的蜀柏毒蛾防治主要以大量使用化学农药为主，化学防治虽然对抗灾有较大的作用，但却存在着一些不可避免的矛盾和缺陷，如污染环境、易使目标害虫产生抗性、杀伤天敌，特别是影响桑蚕业的发展，因此急需一种毒力强、持续效果好、对人畜及家蚕绝对安全的特种生物杀虫剂。通过蜀柏毒蛾活体增殖技术制成的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂及其该杀虫剂在防治蜀柏毒蛾病虫危害方面的应用到目前为止尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂及其制备方法和该杀虫剂在防治蜀柏毒蛾病虫危害方面的应用。该生物杀虫剂毒力强、持续效果好、对人畜及家蚕无害，不污染环境、成本低廉。
本发明的技术方案如下本发明杀虫剂的主要组成为活性杀虫成分蜀柏毒蛾核型多角体病毒(PoNPV)，此外为5％以下的其他惰性成分。
本发明所述的杀虫剂为复合制剂，包括水剂和可湿性粉剂，该复合制剂每100毫升中蜀柏毒蛾核型多角体病毒的含量不低于1000亿包涵体(PIB)，惰性成分吐温80为0.01克、双抗为1000万单位、羧甲基纤维素10克、荧光素钠钠1克、甘油10克。
本发明所述的杀虫剂为绿色，颗粒大小大于150目，静置48小时有一定的分层现象。
本发明所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒是通过对蜀柏毒蛾进行活体增殖所得，包括以下三种增殖方法A、围栏增殖法a、增殖林地选择选择地势平坦，交通方便的柏木林地，要求林木高2～4米，枝叶繁茂。铲除林下杂丛，在树间空隙中将17～18个/米2空酒瓶埋于土中，瓶内灌水，再剪枝叶繁茂的约1米长枝条插入盛水瓶内。按1.0米左右宽度分行钉桩，再围以塑料薄膜成栏。
b、虫源收集采集4～5龄活幼虫，放于柏木枝丫上，批量集运到增殖点，集运工具用箩筐，再底部支垫粗柏亚，粗柏丫上放细柏枝，柏枝上放虫，一层虫隔一层粗柏丫，每筐虫量不超过5千克，筐口用布围盖扎紧，以尽量减少活虫死亡。
c、喷毒以病毒增殖用药在无雨、无露水时用喷雾器以1×107PIB/ml浓度均匀喷洒，直到鳞叶润湿，如遇下雨则补喷第二次，待鳞叶干后放虫。
d、放虫取活幼虫均匀释放于栏内树木和枝条上，放虫密度尽可能大，以增加栽虫量，以5×10米范围放5千克虫或单株放0.5千克虫计。
e、收虫喷毒放虫后，视温度和降水情况，在日最高气温25～29℃无雨天气条件下，3～5天幼虫开始出现症状。待大多数虫体缩短、身体变色，不食不动，中肠液体变褐，少数开始死亡，5～7％幼虫倒悬时，集中收集所有带毒幼虫，以50千克塑料桶盛装、贮藏。
f、保存按每公斤幼虫加480和800万单位兽用青、链霉素，置于阴凉处或冰柜内。
B、林间投虫增殖法选择交通方便，地势较平坦，树高不超过3米、成片的柏木林，株数按每株0.5千克虫来计量，按上述围栏增殖法收集健康蜀柏毒蛾，收集的健康的5龄幼虫按每株柏木载虫0.5千克计量，将虫体投放在柏木上，用工农-16型将浓度为107PIB/ml的蜀柏毒蛾核型多角体病毒液均匀地喷洒在投放有虫体的树株上，喷洒程度以鳞液湿润为止，如喷药后下雨，应补喷1次，按上述围栏增殖法人工采收柏木枝上的感病虫体。
C、林间增殖法选择交通方便，林木相对集中成片，林木均高4～5米，虫口基数特大的林分(最好虫量200头以上/株)，于晴天以机动喷雾器用2.0×107～3.0×107PIB/ml浓度病毒用药对增殖林木进行全面施药，喷药方式为低量喷雾，第一次喷药后在虫量特大、收虫方便或第一次喷药质量不高的重点地段进行第二次重点喷药，同时可用手动喷雾器对低矮林进行选择性喷药，待大多数幼虫虫体开始收缩，体毛变伸，身体变色，取食活动降低，中肠变褐，少数幼虫死亡(3～5％倒挂)时，开始收虫。
本发明所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的制备方法包括原料贮存、磨浆、粗滤、精滤、含量检测、复合制剂的配制、产品贮存，其具体工艺步骤如下A、在原料贮存工序中，是指将收集的带毒蜀柏毒蛾幼虫以存放于冷冻冰柜中为最好，冷冻条件不够时，也可将原料放在塑料桶或铁桶内密闭，其容量为容器的2/3，置于室内阴凉处，存放一年后，经镜检多角体含量，数量和质量均无明显变化。
B、在磨浆工序中，是指将增殖的原料虫尸解冻，以高速磨浆机磨浆，磨浆时按虫尸重量的2倍加水，并充分搅拌打磨。
C、在粗滤工序中，是指以40目的尼龙网过滤，滤渣加其重量一倍水充分搅拌后再过滤，反复2～3次。
D、在精滤工序中，是指将粗滤液以100目尼龙网再次过滤成基本液。
E、在含量检测工序中，是指取基本液样品稀释10倍后将其滴于血球计数板上，静止1分钟后置于显微镜下计数，以每小格4～5个多角体为宜，按对角线方位取左上、右下、右上、左下、中部100个小格计数，重复三次求平均。
F、在复合制剂的配制工序中，其中水剂的配制工序是指在经含量检测后的基本液中，按其重量的1.2‰加表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，1％的荧光素钠钠作防光剂，10％的羧甲纤维素作粘着剂，10％的精甘油作保护剂，再加400万单位/10升双抗作防腐剂，经充分加工搅匀后制成。
可湿性粉剂的配制工序是指将含水量尽可能少的基本液以500rpm、3000rpm差速离心浓缩多角体或加活性炭自然沉降后，用喷雾器在滑石粉或活性炭上，以50℃左右干燥后磨细过100目筛网制得。
G、在产品贮存工序中，是指将生产加工的产品成品置于室内阴凉干燥处，半年内无明显变化，存放一年后，多角体含量仍可保持在原右的75～80％水平。
本发明所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂经林间应用浓度、林间施药方式、林间应用条件及安全试验，证实该杀虫剂对蜀柏毒蛾病虫危害具有有效的防治作用。
本发明所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的使用方法为每亩使用24毫升该病毒杀虫剂，按300倍稀释，对1～3龄幼虫进行低量喷雾。
在蜀柏毒蛾4～6龄期，选择蜀柏毒蛾严重危害的林分，用机动喷雾器，将浓度为1×106～1×107PIB/ml的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂喷洒上述林分，喷洒后第5天开始收集虫体。
本发明所述的生物杀虫剂毒力强、持续效果好、对人畜及家蚕无害，能满足柏木林区蜀柏毒蛾生物防治生产的需要，且不污染环境、成本低廉。
具体实施例方式实施例1围栏增殖法a、材料和设备塑料薄膜(数量按5×10米面积围栏需要用50米计算)、工农-16型喷雾器1台、编织绳(直径4～5厘米)两包、长1～1.5米木桩(数量按每个5×10米大小围栏30根计量)、兽用青霉素80万单位(数量按每千克640万单位计量)、兽用硫酸链霉素(数量按每千克800万单位计量)、漏斗2个。
b、增殖场地的选择和围栏的制作选择地面平坦、避风状况良好、荫凉的场地，每个围栏投放5千克虫。在所定的场地，每个围栏面积为5×10米，沿长、宽边钉木桩，每隔1米钉1根，木桩内侧围以高0.38米塑料薄膜，薄膜同木桩接触处用编织绳扎紧，塑料薄膜拉直、拉紧，与地面接触处用细泥土铺压，围栏内的地面用塑料薄膜铺满。用剪刀剪成啤酒或白酒瓶底大小的孔，数量为每平方米17～18个。瓶子深埋入土中，直至瓶口低于地面0.5～1厘米为宜。用漏斗将清水注入瓶中，用枝剪剪去长1米、鳞枝较嫩、桠枝和鳞叶较多、主枝稍细于瓶口的柏桠，小心插入瓶底。
c、蜀柏毒蛾核型多角体病毒液的喷洒早晨无雨天气，用工农-16型喷雾器均匀地向围栏中的鳞叶喷洒浓度为107PIB/ml的蜀柏毒蛾核型多角体病毒液，喷洒到鳞叶湿润为止；如遇隔天下雨，应补喷1次。待鳞叶干后，投放虫体。
d、健康蜀柏毒蛾幼虫的收集和投放在高虫口地区，发动群众采收5龄幼虫。收集运输时用箩筐，底部支垫用粗的柏枝；每个箩筐虫量不超过5千克。筐口用布围盖，用绳扎紧。将健康的五龄幼虫按5米×10米的面积投放5千克计。
e、病(死)虫的收集虫体取食4、5天后，可适量再放些新鲜柏桠。五龄幼虫取食4～5天后便有死亡现象，当有5～7％的虫体死亡呈倒悬或“V”字型时，便可收虫。虫体取食带有蜀柏毒蛾核型多角体病毒的鳞叶后，其取食量减少，活动性减弱，虫体的“手感”很软，无正常虫体的“膨胀感”。
f、虫尸的保存收集的虫尸应马上集中装入塑料桶中，每千克虫尸加入480万单位兽用青霉素和800万单位兽用硫酸链霉素。塑料桶内的虫尸不宜装得过满，桶口用薄膜封盖并用绳扎紧。
实施例2林间投虫增殖法选择交通方便，地势较平坦，树高不超过3米、成片的柏木林，每株投放0.5千克虫。按上述围栏增殖法收集健康蜀柏毒蛾，将收集的健康的5龄幼虫按每株柏木载虫0.5千克将虫体投放在柏木上。用工农-16型将浓度为107PIB/ml的蜀柏毒蛾核型多角体病毒液均匀地喷洒在投放有虫体的树株上，喷洒程度以鳞液湿润为止；如喷药后下雨，再补喷1次。最后人工采收柏木枝上的感病虫体并封装入容器。
实施例3林间增殖法选择虫口平均密度在200头以上、虫龄以五龄为主，0.2公顷、树株较低的成片的林地。在下午5点以后，用3MF-4型喷雾器向树株喷洒浓度为107PIB/m的1药液。对于较高的林间树株，用3MF-4型超低量喷洒敌马油剂，使虫体触毒掉下来收集感病虫体。
实施例4林间应用浓度试验按多角体用量为50、80、110、140、160、180、240、300、360亿PIB/亩浓度梯度分别在四川遂宁射洪和四川南充蓬安进行不同浓度病毒杀虫剂对蜀柏毒蛾的林间防治效果试验，蓬安作低量喷雾，射洪作常量喷雾，结果表明不同浓度的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的杀虫效果(校正死亡率)分别为28.30％、52.05％、65.70％、69.72％、74.95％(越冬代30天后)和81.05％、81.23％、83.52％、84.29％(第一代30天后)。可见，随着使用浓度的增高，该杀虫剂的杀虫效果迅速增高，但多角体用量在108亿PIB/亩以上时，杀虫效果随浓度增长变化缓慢，且用量在100亿PIB/亩以上即可达到较好的防治效果，而多角体用量为180亿PIB/亩时的效果已非常理想，因此生产防治浓度以1 80亿PIB/亩即可，但考虑到柏木林区林木疏散，药剂施用有一定浪费，有的地方又常用于防治较高虫口林区，因此将生产销售药剂标准用量定在240亿PIB/亩。
实施例5林间施药方式试验以240亿PIB/亩用量分别作常量喷雾(用水量100千克/亩)和低量喷雾(用水量2.4千克/亩)对比试验，结果表明将每亩用水量从100千克降到2.4千克，每台机组人员从4人降到2人，施药效率每台机组20亩/天上升到50亩/天，杀虫效果仍然相当(P＜0.05)。因此确定采用人工投入少，功效高，操作方便的低量喷雾方式进行生产防治。
实施例6林间应用条件试验由于蜀柏毒蛾从第4龄幼虫开始大量取食，而蜀柏毒蛾核型多角体病毒感染发病潜伏期一般要5天左右，因此确定2～3龄幼虫为蜀柏毒蛾核型多角体病毒生产防治的最适虫龄。加之该蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂配有粘着剂，因此防治后除遇大雨外，中小雨天气没有明显影响，最好是无雨阴天或晴天；同时，该杀虫剂还配有防光剂，可吸收紫外线，因此盆地内任何光照均不会造成影响。
实施例7蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂对小白鼠急性经口毒性试验(LD50)按四川省卫生杀虫药剂安全性地方标准DB51/78-91，用实际无毒级10000mg/Kg计量，用浓度为9.6×106PIB/ml(林间防治使用浓度)蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂对16只雄性小白鼠进行灌胃，另选10只作对照组，连续观察17天后，处理组生长发育正常，没有死亡和任何异常现象。证明该杀虫剂急性经口毒性试验是安全的，属实际无毒级。
实施例8蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂对小白鼠的微核测定试验根据成都市卫生防疫站依据的卫生杀虫药剂安全性国家标准GB15193.5-94和该杀虫剂的LD50，将林间使用浓度9.6×106PIB/ml的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂设为937.5mg/Kg、1875mg/Kg、3750mg/Kg和7500mg/Kg四种剂量作处理组，同时用0.85％生理盐水作阴性对照，30mg/Kg环磷酰胺作阳性对照，分别对10只昆明种小白鼠进行骨髓嗜多染红细胞微核率的测定。结果表明四种处理剂量的微核率依次为1.40‰、1.60‰、1.7‰和1.50‰。与阴性对照微核率1.65‰比较，无显著性差异(P＞0.05)；而与阳性对照的微核率16.36‰比较则有极显著差异(P＜0.01)，说明该杀虫剂不能引起昆明种小白鼠骨髓细胞染色体损伤，从遗传角度说明该杀虫剂对哺乳动物是安全的。
实施例9蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂对家蚕的安全性试验选健康4龄家蚕，设三个重复处理，一个对照，各100条。以林间使用浓度9.6×106PIB/ml蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂杀虫剂浸湿桑叶，晾干后喂养处理家蚕，清水作对照。观察家蚕取食、脱皮、死亡和结茧情况，并在喂食的第14天和茧期，取样作消化道、丝腺，脂肪体解剖观察、抽取血液作显微观察和脂肪体的组织切片观察。结果表明处理组幼虫的平均死亡率为7.66‰，对照为8.00％，处理组平均结茧率79.66％，对照结茧率82.00％，两者无显著性差异。解剖处理幼虫内脏各器官均未发现任何病变和病灶，血液中也无蜀柏毒蛾核型多角体病毒，其脂肪组织切片细胞正常，没有任何损坏，细胞内也无蜀柏毒蛾核型多角体病毒存在。可见，蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂对家蚕绝对安全。
权利要求
1.一种增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂，其特征在于主要组成为活性杀虫成分蜀柏毒蛾核型多角体病毒(PoNPV)，此外为5％以下的其他惰性成分。
2.根据权利要求1所述的增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂，其特征在于所述的杀虫剂为复合制剂，包括水剂和可湿性粉剂，该复合制剂每100毫升中蜀柏毒蛾核型多角体病毒的含量不低于1000亿包涵体(PIB)，惰性成分吐温80为0.01克、双抗为1000万单位、羧甲基纤维素10克、荧光素钠钠1克、甘油10克。
3.根据权利要求1或2所述的增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂，其特征在于所述的杀虫剂为绿色，颗粒大小大于150目，静置48小时有一定的分层现象。
4.根据权利要求1或2所述的增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂，其特征在于所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒是通过对蜀柏毒蛾进行活体增殖所得，包括以下三种增殖方法A、围栏增殖法B、林间投虫增殖法C、林间增殖法
5.根据权利要求1或2所述的增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的制备方法，其特征在于包括原料贮存、磨浆、粗滤、精滤、含量检测、复合制剂的配制、产品贮存，其具体工艺步骤如下A、在原料贮存工序中，是指将收集的带毒蜀柏毒蛾幼虫存放于冷冻冰柜中或将原料放在塑料桶或铁桶内密闭。B、在磨浆工序中，是指将增殖的原料虫尸解冻，按虫尸重量的2倍加水后快速磨浆。C、在粗滤工序中，是指以40目的尼龙网过滤后的滤渣，加其重量一倍水充分搅拌后再过滤，反复2～3次。D、在精滤工序中，是指将粗滤液以100目尼龙网再次过滤成基本液。E、在含量检测工序中，是指取基本液样品稀释10倍后于显微镜下计数。F、在复合制剂的配制工序中，其中水剂的配制工序是指在经含量检测后的基本液中，按其重量的1.2‰加表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，1％的荧光素钠钠作防光剂，10％的羧甲纤维素作粘着剂，10％的精甘油作保护剂，再加400万单位/10升双抗作防腐剂，经充分加工搅匀后制成。可湿性粉剂的配制工序是指将含水量尽可能少的基本液以500rpm、3000rpm差速离心浓缩多角体或加活性炭自然沉降后，用喷雾器在滑石粉或活性炭上，以50℃左右干燥后磨细过100目筛网制得。G、在产品贮存工序中，是指将生产加工的产品成品置于室内阴凉干燥处。
6.权利要求1或2所述的增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂在防治蜀柏毒蛾病虫危害方面的应用。
7.根据权利要求1或2所述的增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂，其特征在于所述的杀虫剂的使用方法为每亩使用24毫升该病毒杀虫剂，按300倍稀释，对1～3龄幼虫进行低量喷雾。在蜀柏毒蛾4～6龄期，选择蜀柏毒蛾严重危害的林分，用机动喷雾器，将浓度为1×106～1×107PIB/ml的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂喷洒上述林分，喷洒后第5天开始收集虫体。
全文摘要
本发明公开了一种通过增殖的蜀柏毒蛾核型多角体病毒而制成的生物杀虫剂及其该杀虫剂在防治蜀柏毒蛾病虫危害方面的应用，其主要组成为活性杀虫成分蜀柏毒蛾核型多角体病毒(PoNPV)，此外为5％以下的其他惰性成分，该杀虫剂为复合制剂，包括水剂和可湿性粉剂；本发明所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒是通过对蜀柏毒蛾进行活体增殖所得，包括以下三种增殖方法围栏增殖法，林间投虫增殖法，林间增殖法；所述的蜀柏毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的制备方法包括原料贮存、磨浆、粗滤、精滤、含量检测、复合制剂的配制、产品贮存；本生物杀虫剂毒力强、持续效果好、对人畜及家蚕无害，能满足柏木林区蜀柏毒蛾生物防治生产的需要，且不污染环境、成本低廉。
文档编号A01N63/00GK1568705SQ0313541
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者周建华, 郭亨孝 申请人:四川省林业科学研究院森林保护研究所