专利名称：耐盐性番茄植株培育方法
技术领域：
本发明涉及一种耐盐性番茄植株培育方法，用于番茄、茄子、辣椒等茄果类新品种培育，属于农作物育种技术领域。
背景技术：
番茄为严格的自花授粉植物，长期的人工驯化和有性杂交，使其基因背景越来越窄，一些耐逆境基因已很难在其栽培种中找到。
虽说作物品种间的耐盐性存在一定差异，但其耐盐性还远远不能适应对大面积的盐碱地和占全球水量97.3％的海水的开发利用要求。植物育种家、生理学家和土壤学家正在开展协作研究，从不同的途径提高作物品种的耐盐性。
随着植物细胞全能性得到证实，通过细胞与组织培养获得完整植株的种类日益增多，同时也证明植物离体培养存在自发的变异，推测这是产生体细胞无性系变异(somaclonal variation)的基础，许多研究者认为从组织培养中可得到丰富的遗传变异系。因此，利用培养的植物细胞或愈伤组织，在采用或不采用诱变剂的情况下，通过选择压力的影响，可有目的地选择所期望的抗逆特性，故细胞与组织培养技术与传统的育种技术以及遗传工程一样被视为进行植物改良提高耐逆境能力，特别是耐(抗)盐能力的主要途径之一。利用细胞培养技术获得耐盐细胞系已有许多报道，涉及到12个科，24属，至少有30个种。到目前为止，有关番茄离体筛选耐盐突变体的研究都用单一盐类NaCl作为选择压力，培育的耐盐植株不一定适合海水灌溉或在主要成分为SO-4(硫酸根离子)的次生盐渍化土壤和主要成分为HCO-3(碳酸氢根离子)我国大西北大面积的盐碱地。(Tal M.In vitro methodology for increasing salt tolerance in crop plants.Acta Horticulturae，1993，336，69～78)，(徐乃瑜.培养抗性植物的细胞/组织培养途径.武汉植物学研究，1987，5(3)，299～302)。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种新的耐盐性番茄植株培育方法，方法简单易行，能有效提供作物品种的耐盐性，适应于开发利用海水的要求，满足生产及人们生活的需求。
为实现这样的目的，本发明的技术方案中，利用植物组织培养技术过程存在的广泛变异，以1/3人工复配海水和1/2人工复配海水为选择压力定向选择耐盐变异，并通过7-8代的无胁迫培养，以排除生理适应细胞，最后通过AFLP(amplified fragments length polymorphism)(扩增片段长度多态性)分子标记验证本发明创造的变异发生在DNA水平上。同时创建了番茄耐盐新种质，并进行稳定性筛选。
本发明的方法包括如下具体步骤①无菌苗体系的建立种子浸种24小时后，进行表面消毒，再用无菌水冲洗。在无菌条件下，萌动48小时后，接种于1/2MS(Murashige and Skoog的基本培养基)培养基上获得无菌苗。
②耐盐细胞系的建立苗龄10～12天时，取其下胚轴作为外植体，接种于MS+BA(苄基腺嘌呤)2.0mg/L+IAA(吲哚乙酸)0.2mg/L+30g/L蔗糖+6.5-7.0g/L的琼脂培养基上，在25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，14小时光/10小时暗的光周期下培养。每15天继代1次，将继代2次的愈伤组织培养物接种于附加1/3人工复配海水的培养基中，每升全浓度人工海水组成为CaCl2(氯化钙)510mg、MgCl2(氯化镁)3420mg、MgSO4(硫酸镁)2100mg、KCl(氯化钾)750mg和NaCl(氯化钠)26.75mg，即配置培养基时所用的溶剂为2份重蒸水和1份人工复配海水。约20天后，大部分的培养物在1/3人工复配海水的胁迫下逐渐褐化死亡，个别褐化的培养物会存有小绿点。在1/3人工复配海水胁迫下存活的细胞，可能为耐盐细胞，也有可能为离体培养过程中的生理适应，为了排除生理适应的细胞，将呈绿色的愈伤组织接种于无海水的培养基，继代7～8代后，再转入附加1/3人工复配海水和1/2人工复配海水的培养基，以建立耐1/3人工复配海水和耐1/2人工复配海水的细胞系。
③耐盐植株的获得在无海水培养基恢复培养7-8代，在附加1/2人工复配海水的培养基上仍然存活的愈伤组织即为真正的耐盐愈伤组织，而非生理适应细胞系。将已证明耐盐的愈伤组织转至不含海水的分化培养基上，得到再生苗。再生小苗盆栽，并用1/3人工复配海水作为灌溉水，进行耐盐性筛选，获得耐盐植株。
④耐盐植株的分子验证本发明获得的番茄植株可用AFLP分子标记证实在DNA水平上发生了突变。同时证实了本发明的有效性。
本发明的耐盐番茄植株培育与传统育种技术相比，有一定优势利用培养的植物细胞或愈伤组织，在采用或不采用诱变剂的情况下，通过选择压力的影响，可有目的地选择所期望的抗逆特性；植物组织在规定的培养基上用精确的选择压力处理，并在严格控制的条件下生长，能够获得较明确的结果，且可以不受季节、时间的限制等。本发明与现代基因工程育种相比，具有成本低、技术易掌握、安全性隐患低等明显的优点，培育的作物品种显著提高了耐盐性，可适应于开发利用海水的要求，满足生产及人们生活的需求。
具体实施例方式以下通过一个具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1以上海主要栽培品种的亲本材料‘鲜丰’(Lycopersicon esculentum‘xianfeng’)为诱变对象，以清水于室温条件下浸种24小时后，浸入70％酒精20秒，然后用10％～13％漂白粉饱和溶液表面消毒20分钟，再用无菌水冲洗4～5次。在无菌条件下，萌动48小时后，接种于1/2MS培养基上获得无菌苗。
苗龄12天时，将其下胚轴切成6～8mm长的切段(去掉子叶、茎尖和胚根)作为外植体，接种于MS+BA(苄基腺嘌呤)2.0mg/L+IAA(吲哚乙酸)0.2mg/L+30g/L蔗糖+6.5-7.0g/L的琼脂培养基上，在25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，14小时光/10小时暗的光周期下培养。约15天后出愈率可达100％。每15天继代1次，继代2次的愈伤组织培养物接种于附加1/3人工复配海水(每升全浓度人工海水含CaCl2510mg、MgCl23420mg、MgSO42100mg、KCl750mg和NaCl26.75mg)的培养基。约20天后，大部分的培养物在1/3人工复配海水的胁迫下逐渐褐化死亡，个别褐化的培养物会存有小绿点。将呈绿色的愈伤组织接种于无海水的培养基，继代7～8代后，再转入附加1/3人工复配海水和1/2人工复配海水的培养基，以排除生理适应细胞，建立耐盐细胞系。
将在附加1/2人工复配海水的培养基上鉴定证明保持耐盐性的愈伤组织，转至不含海水的MS+ZT(玉米素)1.0mg/L+IAA0.2mg/L分化培养基上，得到12株再生苗。再生小苗盆栽，并以1/3人工复配海水为选择压力定向选择耐盐变异，即用1/3人工复配海水作为灌溉水，进行耐盐性筛选，获得8株耐盐植株，并用AFLP分子标记证实在DNA水平上发生了突变。但只有2株能正常开花结子。
根据综合农艺性状的考察，将其中的一株作为选育对象。将选种圃设置于上海崇明岛上海上实集团土壤盐度达0.8％的地区，并用海水灌溉。各个世代以及对照品种‘鲜丰’，在定植以后的整个生长期用海水灌溉进行耐盐性稳定性筛选。一直到F5代出现3个脐腐病发病率为0％的群体，而对照的脐腐病发病率为100％。由于考虑到崇明岛的海水含盐量不稳定，接着又通过基质栽培并利用含1/2人工复配海水进行灌溉选择，并在田间筛选的同时，用侧枝扦插(1/3人工复配海水进行灌溉选择)进行单株耐盐性的重复鉴定，筛选到农艺性状基本整齐的耐盐群体1个。获得的耐盐群体除作一般栽培番茄用外，可望在沿海农场、海军基地、土壤盐渍化严重的大棚、温室、地区等栽培使用，或可用1/3～1/2的海水灌溉。
权利要求
1.一种耐盐性番茄植株培育方法，其特征在于包括1)无菌苗体系的建立种子浸种24小时，表面消毒后用无菌水冲洗，在无菌条件下萌动48小时后，接种于1/2MS培养基上获得无菌苗；2)耐盐细胞系的建立苗龄10～12天时，取其下胚轴作为外植体，接种于MS+苄基腺嘌呤2.0mg/L+吲哚乙酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5-7.0g/L的培养基上，在25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，14小时光/10小时暗的光周期下培养，每15天继代1次，将继代2次的愈伤组织培养物接种于附加1/3人工复配海水的培养基中，每升全浓度人工海水组成为CaCl2510mg、MgCl23420mg、MgSO42100mg、KCl750mg和NaCl26.75mg，20天后，将呈绿色的愈伤组织接种于无海水的培养基，继代7～8代后，再转入附加1/3人工复配海水和1/2人工复配海水的培养基，以建立耐1/3人工复配海水和耐1/2人工复配海水的细胞系；3)耐盐植株的获得将上述培养基上仍然存活的已证明耐盐的愈伤组织转至不含海水的分化培养基上，得到再生苗，再生小苗盆栽，并用1/3人工复配海水作为灌溉水，进行耐盐性筛选，获得耐盐植株；4)耐盐植株的分子验证将获得的番茄植株用扩增片段长度多态性分子标记证实在DNA水平上发生了突变。
全文摘要
一种耐盐性番茄植株培育方法，取无菌苗下胚轴作为外植体，接种培养，将继代2次的愈伤组织培养物接种于附加1/3人工复配海水的培养基中，再将呈绿色的愈伤组织接种于无海水的培养基，继代7～8代后转入附加1/3和1/2人工复配海水的培养基，以建立耐盐细胞系，再将已证明耐盐的愈伤组织转至不含海水的分化培养基上，得到再生苗盆栽后用1/3人工复配海水作为灌溉水，进行耐盐性筛选，获得耐盐植株。本发明与现代基因工程育种相比，具有成本低、技术易掌握、安全性隐患低等明显的优点。
文档编号A01H4/00GK1491537SQ0315078
公开日2004年4月28日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者陈火英, 张建华 申请人:上海交通大学