利用叶片培植体通过基因枪得到转基因茶叶的制作方法

专利名称：：利用叶片培植体通过基因枪得到转基因茶叶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过基因枪来制备转基因茶叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)。
背景技术：
：茶是一种具有抗癌活性的含有咖啡因的流行饮料(Jankun，J.，Selman，S.H.，Swiercz，R.Whydrinkinggreenteacouldpreventcancer.Nature5561；1997)。在世界所有的茶叶产区，茶叶还是一种重要的职业来源，并是一种主要的外汇来源(Wilson，K.C.BotanyandPlantImprovementInWilsonR.C.，ed.Coffea，CocoaandTea.CABIPublishing，Wallingford，UK167-173；1999)。但是，茶叶的总产量并不能完全满足国内和国际市场的需要(Kabra，G.D.Teastatisticsfor1999InTeatime，Vol.VIII，No.3Sep-Nov99，30-31；1999)。由于不同的生物(真菌、虫害以及病毒)和非生物(霜冻、冰雹、寒冷、干旱、以及营养缺乏等)灾害，茶叶的产量以及质量进一步降低(Wilson，K.C.BotanyandPlantImprovementInWilsonR.C.，ed.Coffea，CocoaandTea.CABIPublishing，Wallingford，UK167-173；1999)。尽管对于多数农作物来说，单位面积的高产量是最为重要的，但是对于茶叶来说，其主要目的是增加产量同时使之具有更好的适应性以及口感性质。此外，世界市场对于来自世界不同部分的茶叶具有严格的标准，为获取较高的商业价值，产品必须符合该标准。因此，具有强灾害抗性并同时具有高产量以及好口感的茶叶作物就尤其重要(Barua，D.N.TheteaplantofcommerceInBarua，D.N.，ed.Scienceandpracticeinteaculture，TeaResearchAssociationCalcutta；53-68；1989)。农作物改良计划的目的之一是后代植物的形态学一致性。常规茶树种植计划中的主要局限性在于，在近10年的长生命周期中，伴随着高程度的自身非亲和性以及同系繁殖退化(Barua，D.N.TheteaplantofcommercehiBarua，D.N.，ed.Scienceandpracticeinteaculture，TeaResearchAssociationCalcutta；53-68；1989)。克服上述局限性的重要、有效的替代方法是利用Agrobacteriumtutnefaciens或者基因枪来进行遗传转化，其中可将所需的基因直接引入植物基因组中。已经成功将基因枪用于多年生木本的基因改良，尤其用于当所述植物具有长生命周期或者当植物遗传的基本信息缺乏时。因此，当叶子作为初始的离体叶片时，在茶叶中利用基因枪进行遗传转化具有极大的潜力。此外，尽管离体叶片对作物改良具有极大的潜力，但该离体叶片对Agrobacteriumtumefaciens-介导的转化高度抵抗，这可能是由于某种酚的存在而造成的(BiaoXi，ToruK，JianXu，YongyanBEffectofpolyphenolcompoundsinteatransformations.Abstr.no.314.InAmericanSocietyofPlantPhysiologists，PlantBiology1998)。尽管已经鉴别出一些高产率、高质量的茶树克隆，但是这些茶树可能具有疱疫病。由于诸如子叶培植体等异种组织将导致遗传变异，丧失所需的高产率以及高质量的特性，因此在这些克隆中需要采用诸如叶片移植等利用同种组织的生物技术手段。因此，采用叶片培植体是很重要的。但是，已知利用Agrobacteriumtumefaciens进行叶的转化是无效的，这是由于其中所含的某种多酚的高含量所致。已经认识到，为了成功进行转基因过程，主要需要如下三个因素(i)增加表面积以使最多的粒子穿过，(ii)最小程度的细胞伤害/损伤，以及(iii)最大程度的再生效率。据此，开发出一种利用叶片培植体通过基因枪介导的转基因方法来生产茶叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)的方法，在该方法中，为了进一步获得所选优异特性的基因改良，考虑到了上述的三种因素。首先在茶树叶细胞中通过Agrobacteriumtumefaciens进行了遗传转化(MatsumotoSandFukaiM1998Agrobacteriumtumefaciensmediatedgenetransferinteaplant(Camelliasinensis)cells.JapanAgriculturalResearchQuarterly，32287-291；MatsumotoSandFulcaiM1999EffectofacetosyringoneapplicationonAgrobacteriummediatedgenetransferinteaplant(Camelliasinensis)，BulletinoftheNationalResearchInstituteofvegetables，ornamentalplantsandtea，Shizuoka，Japan，149-15)，其中利用500uM的乙酰丁香酮来制备转化的叶片的愈伤组织，然后用200ug/ml的卡那霉素进行选择。这些转化的愈伤组织利用nptII引物进行PCR扩增。最主要的缺点在于转基因植物不能自这些转化的叶片愈伤组织中进行再生。甚至对叶片上的愈伤组织进行诱导也需要高剂量的昂贵的化学物质乙酰丁香酮。Biao也试图通过Agrobacteriumtumefaciens来进行遗传转化(BiaoXi，TomIZ，JianXu，YongyanBEffectofpolyphenolcompoundsinteatransformations.Abstr.no.314.InAmericanSocietyofPlantPhysiologists，PlantBiology1998)，其对叶和子叶进行了实验。该研究的缺点在于，由于大量的酚类(主要是儿茶酚)的存在，使得叶片培植体不能被Agrobacteriumtumefaciens有效感染，因而不能被转化。发明目的本发明的主要目的在于提供一种利用叶片培植体通过基因枪来生产转基因茶叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)的方法，该方法克服了上述的缺陷。本方法的新颖性在于它是第一个利用基因枪来高频转化茶树叶片培植体从而成功制备转基因植物的方法。本发明的另一目的在于其在增加表面积以使最多的粒子穿过、最小程度的细胞伤害/损伤、及最大程度的再生效率上取得了成果。本发明的又一目的在于开发影响基因枪的参数的不同组合(354)，从而达到(i)增加表面积以使最多的粒子穿过，(ii)最小程度的细胞伤害/损伤，以及(iii)最大程度的再生效率的目的。本发明的另一目的在于克服了采用基因枪的某些步骤中遇到的一些问题。本发明又一目的在于制备对生物和非生物灾害具有抗性的转基因茶叶。本发明的另一目的在于制备具有高产量和良好杯中质量的茶叶植物。本发明的再又一目的在于对优质茶叶植物进行遗传转化从而改进质量和产率。本发明的又一目的在于制备脱咖啡因的茶叶植物。本发明的再又一目的在于利用诸如索马甜和植物血凝素等基因来制备具有甜味茶树叶的转基因茶叶植物。本发明详细描述本发明涉及利用基因枪通过用于制备转基因茶叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)的360参数的新结合来制备转基因茶叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)。本发明的方法包括(a)在将360种组合用于叶片培植体之前，将叶片培植体用选自单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇组合物等不同浓度(0.25-0.75M)的不同渗透剂以及液态基础MS培养基进行处理(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497；1962)，其中培养基中添加了维生素样的维生素B1-HCl(0.1mg/l)、维生素B6-HCl(0.5mg/l)、以及尼克酸(0.5mg/l)，并添加了氨基乙酸(2.0mg/l)，处理时间在2至8小时之间变化；(b)在透明聚乙烯膜上画直径在2.0-9.0cm范围内变化的同心圆，其中最外层圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同；(c)排列叶片培植体，使近轴表面在再生培养基上部，用于轰击；(d)在9.0cm培养皿的同心圆内(2.0-5.0cm)的再生培养基上排列叶片培植体，使BioRad制造的被pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹以最大速度发射；(e)分别用70％乙醇和蒸馏水洗涤3次，对金粒进行消毒；(f)用0.5-1.5ml蒸馏水悬浮60ug金粒；(g)在1.5ml的Eppendorf管中分散25-60ul的上述悬浮液，用于每次的轰击；(h)将50ul的金悬浮液与10ul不同浓度的pRT99GUS质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-50ul的1.5-3.5MCaCl2和10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐进行混合，并不时震荡搅拌，然后在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮；(i)在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使10ul金粒悬浮液和DNA进行包被；(j)360种组合的形成，其包含间隔距离或在破裂盘和大载体之间的距离(单独为1/4-3/8英寸，及其组合)、大载体飞行距离或大载体和停止屏之间的距离(6-16mm)、以及靶距离或微射弹停止屏和靶组织之间的距离(6-12cm)，所述距离用于增加最大粒子穿透的表面积，从而达到最小细胞损伤/伤害以及最大再生效率；(k)用基因枪对叶片培植体进行轰击，所述基因枪诸如DuPont、Genebooster，但尤其是Helium动力粒子传输系统，PDS-1000/He(Bio-Rad)在小室压力为22-28英寸汞柱下，具有金粒(0.6-1.6um)，还具有1、2和4ug/ul浓度的DNA以及上述的360种组合，其中通过增加靶距离来优化粒子分散从而避免由于气体震荡和高度的粒子分散导致的组织损伤，同时通过降低间隔距离来克服由于微射弹飞行距离的中心错位飞行而导致的组织损伤；(l)通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次；(m)在再生培养基上旋转轰击后的培植体，其包括叶、细胞胚芽、合子胚、以及胚胎发育形成的愈伤组织，使之上下倒转，背轴面向上，从而使轰击表面与再生培养基相接触；(n)在培养室中在25±2℃的条件下，于暗处培养两天；(o)对轰击的叶片进行GUS表达的检测，该检测是按照Jefferson的方法进行的，在该方法中，GUS(5-溴，4-氯，3-吲哚，β-D葡萄糖苷酸)化学物质与转化的叶片培植体反应生成蓝色的“反应产物”，显示BioRad的pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹进入到了移植组织的细胞内(JeffersonRA1987，AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405)；(p)按照SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S于2001年提交的专利.′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中的方法，两天后在培养室中52umolm-2s-1的冷荧光条件下于正常的16h光周期将轰击后的叶片培植体转移至再生培养基；(q)最后，每15天后，在含有卡那霉素(250-1100ug/ml)的选择培养基中选择假定的转化株；(r)按照SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S于2001年提交的专利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中公布的方法，使3-5月大的完全卷曲、半开放或完全伸展的叶片培植体的体外培养物出芽；(s)按照SandalI，BhattacharyaA，AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1)75-80(2001)中的方法在液态介质中使转基因的芽进行生长繁殖(t)按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行分子鉴定。在一个实施方案中，利用上述的基因枪方法对不同培育植物(Chinary，Cambod以及Assamica)的诸如叶、细胞胚芽、合子胚、以及胚胎发育形成的愈伤组织等不同的培植体进行遗传转化。在另一个实施方案中，利用不含激素的液态基础MS培养基和不同的渗透剂来处理体外培养植物的叶片培植体，其中，在用基因枪轰击前，最简单和最便宜的MS培养基是最有效的。在另一个实施方案中，利用不含激素的液态基础MS培养基和诸如单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的组合等不同范围的渗透剂来处理体外培养的植物的叶片培植体，其中不含激素的全浓度MS培养基是最有效的。在又一个实施方案中，利用不含激素的液态基础MS培养基和不同的渗透剂来对叶片培植体处理2-8小时的不同时间，其中利用不含激素的液态基础MS培养基处理4小时是最有效的。在一个实施方案中，用无菌水配制50-70ug的金粒，直接使用并储藏，从而克服当DNA上样到大载体时产生残留甘油的抑制作用。在又一个实施方案中，在一透明的聚乙烯膜上画直径在2.0-9.0cm变化的同心圆，其中最外圈圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同。在一个实施方案中，排列培植体，使近轴表面在再生培养基上部，用于轰击。在另一个实施方案中，为了优化pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹，(BioRad)将培植体排列在再生培养基上9cm培养皿的2.0-5.0cm的不同同心圆内，并采用Jefferson(JeffersonRA1987，AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405)的GUS检测方法。在一个实施方案中，分别用70％乙醇和无菌水洗涤0.5-1.5ml的金粒3次，用于消毒。在另一个实施方案中，将25-60ul的悬浮液分散于1.5ml的Eppendorf管中，用于每次轰击。在另一个实施方案中，将40-60ul的金悬浮液与5-15ul不同浓度的pRT99GUS质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-60ul的1.5-3.5MCaCl2以及10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐混合。在又一个实施方案中，不时震荡搅拌悬浮液，然后在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮。在又一个实施方案中，在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使5-15ul金粒悬浮液和DNA进行包被。在又一个实施方案中，用基因枪对叶片培植体进行轰击，所述基因枪诸如DuPont、Genebooster，和Helium动力粒子传输系统，PDS-1000/He(Bio-Rad)但优选Helium动力粒子传输系统，小室压力为22-28英寸汞柱的PDS-1000/He(Bio-Rad)。在另一个实施方案中，形成360种组合，其包含间隔距离或在破裂盘和大载体之间的距离(单独为1/4-3/8英寸，及其组合)、大载体飞行距离或大载体和停止屏之间的距离(6-16mm)、以及靶距离或微射弹停止屏和靶组织之间的距离(6-12cm)，所述距离用于增加最大粒子穿透的表面积，从而达到最小细胞损伤/伤害以及最大再生效率；在另一个实施方案中，采用上述的360种组合，与0.6-1.6um粒度范围内的金粒，以及1、2和4ug/ul浓度的DNA，其中优选1.0um金粒的组合，脉冲压1100psi，靶距离(9cm)，间隔距离(3/8″+1/4″和1/4″)，大载体飞行距离(16mm)，以及1ug/ml的DNA具有最佳转化频率。在另一个实施方案中，通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次。在另一实施方案中，将轰击后的培植体在再生培养基上上下倒转，背轴面向上。在另一实施方案中，优选将轰击后的培植体在25±2℃的条件下，在培养室中于暗处培养两天，然后利用SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S.于2001年提交的专利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中描述的再生培养基中进行培养。在另一实施方案中，轰击6天后，利用JeffersonRA(1987)AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405中的GUS检测方法，检测轰击后的培植体中的瞬时表达。在另一实施方案中，每15天后，在含有卡那霉素的选择培养基中选择来源于叶片的愈伤组织。在另一实施方案中，采用250-1100ug/ml范围内的卡那霉素来选择转化株，几乎没有“野生”机会的转化株。在另一实施方案中，种植1.0cm长的健康转基因植株，并在SandalI，BhattacharyaA，AhujaP.S.的不含卡那霉素的液态繁殖培养基上进行繁殖。用于茶叶芽繁殖的一种有效的液体培养系统如PlantCellTissueOrganCulture65(1)75-80(2001)中所述。在另一个实施方案中，按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行分子鉴定。在本发明的另一个实施方案中，对不同的培植体，诸如细胞胚芽以及胚胎发育形成的愈伤组织采用上述参数进行轰击。在本发明的再一实施方案中，利用来源于离体植株(invitro)和植株外(exvitro)的植物的叶片培植体的不同的栽培变种来进行轰击。(i)用不含激素的液态基础MS培养基(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497；1962)以及不同浓度的渗透剂，诸如单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的组合等的处理不同的时间(2-8小时)。(ii)在透明聚乙烯膜上画出直径同心圆，其中最外层圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同。(iii)在9.0cm培养皿的不同同心圆内(2.0-5.0cm)的再生培养基上排列叶片培植体，使DNA包被的微射弹以最大速度发射。(iv)分别用70％乙醇和蒸馏水洗涤3次对金粒进行消毒后，将0.5-1.5ml的金粒悬浮于无菌蒸馏水中。(v)在1.5ml的Eppendorf管中分散上述悬浮液(25-60ul)，用于每次的轰击。(vi)将50ul的金悬浮液与10ul不同浓度的质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-50ul的1.5-3.5MCaCl2和10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐进行混合。(vii)不时震荡搅拌上述悬浮液，在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮。(viii)在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使10ul金粒悬浮液和DNA进行包被。(ix)形成354组合，其包含(a)间隔距离或在破裂盘和大载体之间的距离(单独为1/4-3/8英寸，及其组合)，(b)大载体飞行距离或大载体和停止屏之间的距离(6-16mm)，(c)靶距离或微射弹停止屏和靶组织之间的距离(6-12cm)，破裂圆盘的脉冲压(650-1350psi)用于增加最大粒子穿透的表面积，从而达到最小细胞损伤/伤害以及最大再生效率。(x)用Helium动力粒子传输系统PDS-1000/He(Bio-Rad)对叶片培植体进行轰击，小室压力为25英寸汞柱，具有金粒(0.6-1.6um)，以及1、2和4ug/ul浓度的DNA以及上述的354组合。(xi)通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次。(xii)将轰击后的培植体在再生培养基上上下倒转，背轴面向上，从而使轰击后的表面与再生培养基接触，快速愈合。(xiii)在培养室的条件下将轰击后的叶片培植体于暗处培养两天。(xiv)利用JeffersonRA(1987)AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405中的GUS检测方法，检测轰击后的培植体中的瞬时表达，籍此检测粒子穿透的最大传播。(xv)按照SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S于2001年提交的专利.′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中的方法，两天后在正常光周期的培养室条件下将轰击后的叶片培植体转移至再生培养基。(xvi)按照SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S于2001年提交的专利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中公布的方法，使轰击后的叶片培植体中出现了萌芽再生。(xvii)每15天后，在含有卡那霉素(250-1100ug/ml)的选择培养基中选择假定的转化株。(xviii)利用SandalI，BhattacharyaA，AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1)75-80(2001)SandalI，BhattacharyaA，AhujaP.S.2001中的液态培养基使假定的转化株的萌芽生长和繁殖。(xix)按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行鉴定。茶叶培植体的最大瞬时表达的参数的优化如表1所示。为了通过基因枪来成功制备转基因产品，有必要使影响基因枪的所有不同参数最佳组合，从而(a)增加最大粒子穿透的表面积，(b)达到最小细胞损伤/伤害，以及(iii)使再生效率最大化。已经在几种农作物中报道了根据组织的质地(坚硬或柔软)以及物质来源(属或种)采用一种或两种参数来生长转基因产品。但是，本发明的新颖性在于开发出了一种能影响基因枪成功的包含所有参数的检测台，它能被广泛应用。在检测台的这些354种组合的帮助下(包含破裂盘的脉冲压、大载体飞行距离、靶距离和间隔距离的组合)，可成功进行任何的转化试验而无需考虑种、作物、或者组织。采用渗压剂(osmoticum)预处理以及浓缩DNA能够进一步增加转化效率。以不含激素的液态基础MS(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497；1962)培养基或者0.25M山梨糖醇预处理4小时不仅能使茶叶培植体的质地坚韧，因而能够使它们在再生培养基上平展从而能够为轰击提供更大的表面积同时具有最小的损伤，而且还能够使由于粒子穿透造成的损伤愈合。一般地，由于在轰击前用渗透剂进行处理能够使靶细胞胞浆溶解，因此能够明显增加瞬时表达。胞浆溶解阻止了原生质从细胞中的挤出，进一步降低了接下来轰击过程中粒子穿透造成的细胞伤害VainP，McMullenM.D.，FinerJ.J，1993Osmotictreatmentenhancesparticlebombardmentmediatedtransientandstabletransformationofmaize.PlantCellRep12，84-88。组织预处理增加了DNA复制，结果使DNA高水平插入至基因组中。金粒从停止屏来回移动至靶组织的路径通常为圆锥形。因此，为使金粒最大分散，需要使该圆锥体的基底表面积与排列待轰击的培植体的再生培养基上的同心圆相重合。因此设计了一种在透明聚乙烯膜上画具有不同直径(2.0-9.0cm)的同心圆的方法，其中最外层圆的直径与9.0cm的培养皿的直径相同。通过将含有靶组织的培养皿放置于这些圆上并通过在轰击后通过GUS检测瞬时表达，发现直径2.0cm的同心圆具有最佳效果。这就是为什么当茶叶培植体置于该区域内能够达到最大粒子穿透的原因。当增加了破裂盘的脉冲压时，由于气体震动以及高粒子分散，因而使得微射弹速度增加了组织损伤，从而得到低瞬时基因表达。该缺陷可通过增加靶距离或者在粒子分散时使组织与停止屏保持较远距离来避免。在说明书的附图中图1a.b.c.代表茶叶植物的叶片培植体；图1d-r代表不同的转化叶片培植体表现的gus表达。下面提供的实施例用于解释本发明，而并非对本发明做出限制。具体实施例方式实施例1体外培养植物的叶片培植体用基础MS(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497；1962)培养基和诸如单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的组合等不同浓度的渗透剂处理不同时间(2-8小时)。排列处理后的培植体，使近轴表面在9.0cm培养皿不同同心圆(2.0-5.0cm)内的再生培养基的上部，从而优化DNA包被的微射弹的传播模式。为了轰击，将0.5-1.5ml金粒分别用70％乙醇和无菌水洗涤3次后，取0.5-1.5ml金粒悬浮于无菌蒸馏水中，然后将25-60ul的悬浮液分散于1.5ml的Eppendorf管中。为制备DNA混合物取50ul金悬浮液，与10ul不同浓度的质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-50ul的1.5-3.5MCaCl2以及10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐混合。不时震荡搅拌悬浮液，然后在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮。在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使10ul金粒悬浮液和DNA进行包被。然后用Helium动力粒子传输系统PDS-1000/He(Bio-Rad)对叶片培植体进行轰击，小室压力为25英寸汞柱，具有354种组合、0.6-1.6um的金粒以及1、2和4ug/ul浓度的DNA，通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次。将轰击后的培植体在再生培养基上上下倒转，背轴面向上。在培养室的条件下将轰击后的叶片培植体于暗处培养两天，按照JeffersonRA(1987)AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405.中的方法检测GUS的表达，然后在SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S.于2001年提交的专利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′所公开的再生培养基上继续培养。最后，每15天后，在含有卡那霉素(250-1100ug/ml)的选择培养基中选择源于愈伤组织的叶。按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行鉴定。实施例2体外培养植物的叶片培植体用不同浓度的渗透剂处理，然后按照上述方法利用基因枪进行遗传转化。实施例3不同栽培变种(Clzinary，CambodandAssamica)植物的叶片培植体用不同浓度的渗透剂处理，然后按照上述方法利用基因枪进行遗传转化。实施例4按照上述方法利用基因枪对诸如细胞胚芽、合子胚、以及胚胎发育形成的愈伤组织等不同的培植体进行遗传转化。本方法的新颖性在于发展出了含有354种组合的检测板，其保证了基因枪介导的转基因产品的成功，而无需考虑组织、培植体、或者物种的不同。本发明方法所具有的一些新特性如下所述1.本发明首次使用不含激素的基础MS(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497；1962)来代替渗压剂(osmoticum)，这避免了已知在渗透剂中需要的繁重、昂贵的预处理步骤。2.在一透明的聚乙烯膜上画不同直径(2.0-9.0cm)的同心圆，其中最外圈圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同，这样使得在轰击前放置靶组织的精确面积就是已知的。而且，这使得粒子穿透的面积最大化。3.首次用水而不是用甘油来悬浮金粒，从而克服了将DNA上样到大载体上时残留甘油的抑制作用。4.由于轰击后通过将叶上下翻转，因此粒子穿透造成的损伤能够快速愈合。这使得损伤位点与培养基相接触，并导致快速的再生反应。5.反应性叶片培植体，即，所形成的叶愈伤组织采用高浓度的、即500或1000ug/ml的卡那霉素进行选择，以避免任何的“野生”并保证高比率的稳定转化株(95-100％)。本发明首次报道了采用高至1000ug/ml的卡那霉素来选择转化株。6.本方法还保证了健康转化茶叶萌芽的产生。本发明的主要优点在于1)利用基因枪产生的转基因优化植物对诸如疱疫病等真菌疾病具有抗性，从而避免了50％的作物损失。2)利用基因枪产生的转基因优化植物对诸如细菌芽病(bacterialshoot)等细菌性疾病具有抗性。3)利用基因枪产生的转基因优化植物对病毒性疾病具有抗性。4)利用基因枪产生的转基因优化植物对诸如昆虫、牧草虫以及螨虫等茶叶抗性害虫具有抗性。5)利用基因枪产生的转基因优化植物对诸如草柑膦、2，4-D百草枯以及敌草隆等除草剂和诸如阿特拉津及oxyflurfon等出土前施用的除草剂具有抗性。6)利用基因枪产生的转基因优化植物通过(i)过度表达能增加氧自由基捕捉的酶的基因，(ii)增加诸如甘露醇、脯氨酸、果聚糖、糖胶-甜菜碱(gycine-betaine)等(Bonhertetal.，1996；Hayashietal.，1997)渗透剂的成分，(iii)增加细胞膜的弹性，以及(iv)对诸如LEA蛋白、脱水蛋白、防冻蛋白(AFPs)、热休克蛋白(HSPs)等应激诱导蛋白以及诸如VHb蛋白等低氧和缺氧诱导蛋白的表达进行操纵，从而对不同的应力具有抗性。7)产生对诸如青草以及阔叶草等杂草具有抗性的转基因茶叶。8)产生很少或没有冬眠的转基因茶叶。9)在特定启动子的控制下生成表达APETALA或者LEAFY等基因的转基因植物，从而使之产生更多的具有生长力的萌芽。10)在适宜启动子的作用下生成编码RUBPcase的转基因茶叶基因，从而促进光合作用的速率。11)通过表达光敏色素基因生成转基因茶叶使之能够密集种植并具有易于采摘的良好茶叶平台。11)生成具有更高产率和好的杯中品质的茶叶植物。12)利用基因枪产生的转基因优化植物在提高质量和产率方面的改进。13)脱咖啡因转基因茶叶植物的生成。14)利用诸如索马甜以及植物血凝素等基因来制备具有甜味茶树叶的转基因茶叶植物。15)提供了一种基因枪介导的遗传转化方法，该方法具有高比率的转基因产物，而无需考虑种属、作物种类、组织、以及培植体等等。16)克服了基因枪介导的遗传转化步骤中的一些问题。表1茶叶叶片移植物中最大瞬间时表达的参数优化·对上述每27种组合检测了6种缺口距离(3/8”，”，1/8”，3/8”+1/4”，3/8”+1/8”，3/8”+1/8”+1/4”)权利要求1.利用基因枪制备转基因茶叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)的360种参数的新结合，其包括(r)在将360种组合用于叶片培植体之前，将叶片培植体用选自单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的组合等不同浓度(0.25-0.75M)的不同渗透剂以及液态基础MS培养基进行处理(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497；1962)，其中培养基中添加了维生素样的维生素B1-HCl(0.1mg/l)、维生素B6-HCl(0.5mg/l)、以及尼克酸(0.5mg/l)，并添加了氨基乙酸(2.0mg/l)，处理时间在2至8小时之间变化；(s)在透明聚乙烯膜上画直径在2.0-9.0cm范围内变化的同心圆，其中最外层圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同；(t)排列叶片培植体，使近轴表面在再生培养基上部，用于轰击；(u)在9.0cm培养皿的同心圆内(2.0-5.0cm)的再生培养基上排列叶片培植体，使BioRad制造的被pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹以最大速度发射；(v)分别用70％乙醇和蒸馏水洗涤3次，对金粒进行消毒；(w)用0.5-1.5ml蒸馏水悬浮60ug金粒；(x)在1.5ml的Eppendorf管中分散25-60ul的上述悬浮液，用于每次的轰击；(y)将50ul的金悬浮液与10ul不同浓度的pRT99GUS质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-50ul的1.5-3.5MCaCl2和10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐进行混合，并不时震荡搅拌，然后在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮；(z)在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使10ul金粒悬浮液和DNA进行包被；(aa)360种组合的形成，其包含间隔距离或在破裂盘和大载体之间的距离(单独为1/4-3/8英寸，及其组合)、大载体飞行距离或大载体和停止屏之间的距离(6-16mm)、以及靶距离或微射弹停止屏和靶组织之间的距离(6-12cm)，所述距离用于增加最大粒子穿透的表面积，从而达到最小细胞损伤/伤害以及最大再生效率；(bb)用基因枪对叶片培植体进行轰击，所述基因枪诸如DuPont、Genebooster，但尤其是Helium动力粒子传输系统，PDS-1000/He(Bio-Rad)在小室压力为22-28英寸汞柱下，具有金粒(0.6-1.6um)，还具有1、2和4ug/ul浓度的DNA以及上述的360种组合，其中通过增加靶距离来优化粒子分散从而避免由于气体震荡以及高粒子分散导致的组织损伤，同时通过降低间隔距离来克服由于微射弹飞行距离的中心错位飞行而导致的组织损伤；(cc)通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次；(dd)在再生培养基上旋转轰击后的培植体，其包括叶、细胞胚芽、合子胚、以及胚胎发育形成的愈伤组织，使之上下倒转，背轴面向上，从而使轰击表面与再生培养基相接触；(ee)在培养室中在25±2℃的条件下，于暗处培养两天；(ff)对轰击的叶子进行GUS表达的检测，该检测是按照Jefferson的方法进行的，在该方法中，GUS(5-溴，4-氯，3-吲哚，β-D葡萄糖苷酸)化学物质与转化的叶片培植体反应生成蓝色的“反应产物”，显示BioRad的pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹进入到了移植组织的细胞内(JeffersonRA1987，AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405)；(gg)按照SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S于2001年提交的专利.′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中的方法，两天后在培养室中52umolm-2s-1的冷荧光条件下于正常的16h光周期将轰击后的叶片培植体转移至再生培养基；(hh)最后，每15天后，在含有卡那霉素(250-1100ug/ml)的选择培养基中选择假定的转化株(r)按照SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S于2001年提交的专利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中公布的方法，在体外培养物中使来自3-5月大的完全卷曲、半开放或完全伸展的叶片培植体出现萌芽再生(s)按照SandalI，BhattacharyaA，AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1)75-80(2001)中的方法在液态介质中使转基因的芽进行生长繁殖(t)按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行分子鉴定。2.权利要求1的方法，其中利用上述的基因枪方法对不同培育植物(Chinary，Cambod以及Assamica)的诸如叶、细胞胚芽、合子胚、以及胚胎发育形成的愈伤组织等不同的培植体进行遗传转化。3.权利要求1的方法，其中利用不含激素的液态基础MS培养基和不同的渗透剂来处理体外培养植物的叶片培植体，其中，在用基因枪轰击前，用最简单和最便宜的MS培养基是最有效的。4.权利要求1的方法，其中利用不含激素的液态基础MS培养基和诸如单独的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的组合等不同范围的渗透剂来处理体外培养植物的叶片培植体，其中不含激素的全浓度MS培养基是最有效的。5.权利要求1的方法，其中利用不含激素的液态基础MS培养基和不同的渗透剂来对叶片培植体处理2-8小时的不同时间，其中利用不含不含激素的液态基础MS培养基处理4小时是最有效的。6.权利要求1的方法，其中用无菌水配制50-70ug的金粒，直接使用并储藏，从而克服将DNA上样到大载体上时残留甘油的抑制作用。6.权利要求1的方法，其中在一透明的聚乙烯膜上画直径在2.0-9.0cm变化的同心圆，其中最外圈圆的直径与9.0cm培养皿的直径相同。7.权利要求1的方法，其中排列培植体，使近轴表面在再生培养基上部，用于轰击。8.权利要求1的方法，其中为了优化pRT99GUS质粒DNA包被的微射弹(BioRad)并采用Jefferson(JeffersonRA1987，AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405)的GUS检测方法，将培植体排列在再生培养基上9cm培养皿的2.0-5.0cm的不同同心圆内。10.权利要求1的方法，其中分别用70％乙醇和无菌水洗涤0.5-1.5ml的金粒3次，用于消毒。11.权利要求1的方法，其中将25-60ul的悬浮液分散于1.5ml的Eppendorf管中，用于每次轰击。12.权利要求1的方法，其中将40-60ul的金悬浮液与5-15ul不同浓度的pRT99GUS质粒DNA(0.5-5ug/ul)、40-60ul的1.5-3.5MCaCl2以及10-50ul的0.5-2.0M不含亚精胺的磷酸盐混合。13.权利要求1的方法，其中不时震荡搅拌悬浮液，然后在500-1100rpm离心5-20秒，接下来移去上清，用70％乙醇洗涤，最后用50-100ul的100％乙醇悬浮。14.权利要求1的方法，其中在无菌大载体(BioRad)上通过迅速震荡使10ul金粒悬浮液和DNA进行包被。15.权利要求1的方法，其中用基因枪对叶片培植体进行轰击，所述基因枪诸如DuPont、Genebooster，Helium动力粒子传输系统，PDS-1000/He(Bio-Rad)，但优选Helium动力粒子传输系统，小室压力为22-28英寸汞柱下的PDS-1000/He(Bio-Rad)。16.权利要求1的方法，其中形成360种组合，其包含间隔距离或在破裂盘和大载体之间的距离(单独为1/4-3/8英寸，及其组合)、大载体飞行距离或大载体和停止屏之间的距离(6-16mm)、以及靶距离或微射弹停止屏和靶组织之间的距离(6-12cm)，所述距离用于增加最大粒子穿透的表面积，从而达到最小细胞损伤/伤害以及最大再生效率。17.权利要求1的方法，其中采用上述的360种组合，与0.6-1.6um粒度范围内的金粒，以及1、2和4ug/ul浓度的DNA，其中优选的组合为1.0um金粒，脉冲压1100psi，靶距离(9cm)，间隔距离(3/8″+1/4″和1/4″)，大载体飞行距离(16mm)，以及1ug/ml的DNA具有最佳转化频率。18.权利要求1的方法，其中通过将培养盘旋转180℃而改变其方向后，对每一圆盘轰击两次。19.权利要求1的方法，其中将轰击后的培植体在再生培养基上上下倒转，背轴面向上。20.权利要求1的方法，其中优选将轰击后的培植体在25±2℃的条件下，在培养室中于暗处培养两天，然后利用SandalI，BhattacharyaA，SharmaM，AhujaP.S.于2001年提交的专利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中描述的再生培养基中进行培养。21.权利要求1的方法，其中轰击6天后，利用JeffersonRA(1987)AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem，PlantMolBiolRep5389-405中的GUS检测方法，检测轰击后的培植体中的瞬时表达。22.权利要求1的方法，其中每15天后，在含有卡那霉素的选择培养基中选择来源于叶片的愈伤组织。23.权利要求1的方法，其中采用250-1100ug/ml范围内的卡那霉素来选择，几乎没有“野生”机会的转化株。24.权利要求1的方法，其中种植1.0cm长的健康转基因植株，并在不含卡那霉素的液态繁殖培养基上进行繁殖，该液体培养基如SandalI，BhattacharyaA，AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1)75-80(2001)中所述。25.权利要求1的方法，其中按照常规的PCR和Southern杂交方法对采用250-1100ug/ml卡那霉素选择出的转基因植物的GUS阳性组织进行分子鉴定。全文摘要本发明涉及通过基因枪来制备转基因茶叶(camelliasinensis(L.)O.Kuntze)。文档编号A01H1/00GK1685045SQ03804828公开日2005年10月19日申请日期2003年1月21日优先权日2002年1月22日发明者因德拉·桑达尔,阿米塔·巴塔查里亚,帕拉姆维尔·辛格·阿胡贾申请人:科学与工业研究委员会