专利名称：建立丛枝菌根真菌与番茄毛状根共生关系的方法
专利说明建立丛枝菌根真菌与番茄毛状根共生关系的方法 本发明涉及一种建立丛枝菌根真菌与番茄毛状根共生关系的方法。丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AM真菌)是一类能够与80％的植物种建立共生关系的土壤真菌。人们早已认识到，AM真菌可以明显地促进植物根系对矿质营养的吸收，增强植物对多种土传病害的抗性，从而改善植物的生长。因此，各国科学家一致认为AM真菌在大多数的农作物和园艺作物上有广阔的应用前景，并称之为“生物肥料”和“生物农药”(Scientia Horticulturae，1997，681-24)。目前，对于AM真菌的研究越来越广泛，也越来越深入，许多研究需要在无菌的条件下进行，或者需要获得无菌的AM真菌材料。然而，到目前为止，AM真菌仍然不能纯培养，必须与宿主植物建立共生关系后才能完成生命周期。正因为如此，我国目前的AM真菌繁殖主要采用基质栽培宿主植物的方式进行，这些基质主要包括土壤、河沙、蛭石、玻璃珠等，在这些培养条件下，无法获得无菌条件。对于丛枝菌根真菌的生物学特性、与土壤微生物的互作关系等方面的研究需要在无基质干扰、无菌的条件下进行，因此以前的AM真菌培养方法难以应用于此类研究。本发明的目的在于针对目前的AM真菌培养方法的局限性，提供一种在无菌培养基上与丛枝菌根真菌建立共生关系的方法，以获得无菌的AM真菌材料或在无菌条件下进行AM真菌的相关研究。
本发明所提供的在无菌培养基上与丛枝菌根真菌建立共生关系的方法，主要是以番茄种子、发根农杆菌、AM真菌为材料，通过诱导形成番茄毛状根，然后在无菌培养基上接种AM真菌孢子，待形成侵染之后即建立了番茄毛状根与AM真菌之间共生关系，具体操作方法如下1、番茄毛状根的诱导番茄种子用95％乙醇和10％次氯酸钠进行表面灭菌后，水洗后播种到2％的蔗糖琼脂培养基上，25℃暗黑条件下发芽7～10天后，在超净工作台上将幼苗分切成下胚轴、中胚轴和上胚轴3个部分，在107～108cfu/ml的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌悬液中浸泡20～30分钟，在无菌水中洗3-5次后，无菌滤纸吸去多余菌液，接种到2％的蔗糖琼脂培养基上，约7～15天后植物组织表面开始出现毛状根；待毛状根长至2～5cm后，用灭菌剪刀剪下毛状根，放置在含抗生素的MS培养基上，经过3-5次继代培养，直至没有发根农杆菌菌落出现；2、AM真菌的接种将番茄毛状根转移到M培养基上，在毛状根的表面和边上接种灭菌后的AM真菌(Gigaspora margarita)孢子；3、共生体系的建立接种后的培养皿在25℃暗黑条件下培养，1～5天后AM真菌孢子即可萌发，5-10天后发芽菌丝可以侵入根系，3周后可以见到外生菌丝在培养基表面生长，此时，表明共生体系已经建立；4、培养与继代共生体系建立以后可以在25℃暗黑条件下继续培养2-3周，以后若需要进行继代培养，即剪取一段含有外生菌丝的根段，转移到新的M培养基上，继代培养时间以1个月为宜。
上述方法中提到的MS培养基为植物组织培养的常用培养基，M培养基参考Becand G，FortinJA 1988在New Phytologist(108211-218)杂志上发表的文章，M培养基组成成分为
图1番茄毛状根与AM真菌共生体系模式图；图2AM真菌孢子的侵染(左)和外生菌丝(右)。
图1中，1-培养皿；2-AM真菌外生菌丝；3-番茄毛状根[具体实施方式
]实施例11、番茄毛状根的诱导取红宝石和丰顺番茄种子各10颗，放在水中充分吸胀12～24小时，用10％次氯酸钠消毒15～20分钟，无菌水洗涤5次后，播种在2％的蔗糖琼脂培养基上；培养皿放在25℃暗黑条件下培养7～10天后，在超净工作台上将幼苗分切成下胚轴、中胚轴和上胚轴3个部分，分别在107～108cfu/ml的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)R1000菌悬液中浸泡20～30分钟，取出后用无菌水洗涤5次，再用无菌滤纸拭干植物组织表面的水分，接种到2％的蔗糖琼脂培养基上，置于25℃暗黑条件下培养；培养期间，经常观察毛状根的形成，约7～15天后植物组织表面开始出现毛状根；待毛状根长至2～5cm后，用灭菌剪刀剪下毛状根，转移到添加250mg/L的氨苄青霉素的MS培养基上，以去除发根农杆菌；在含抗生素的MS培养基上培养2～3周后继代1次，继代3次后毛状根周围将没有发根农杆菌的菌落出现，此时已经完全除菌；将完全除菌的毛状根转移到毛状根专用的M培养基上培养7～10天后，毛状根恢复生长；2、AM真菌的接种湿筛法收集AM真菌孢子称取20-50g AM真菌菌剂放入1L的烧杯中，用手小心捏碎土壤颗粒后加入0.7L自来水，用玻璃棒猛烈搅动后静置1-3分钟后将悬浊液倒入叠在一起的筛网中(上部筛网的孔径为1mm，下部筛网的孔径为100μm)，向烧杯中剩余的沉淀物再加入0.5L自来水，玻璃棒搅动后静置1分钟左右，悬浊液在倒入前述的筛网中，反复多次直至悬浊液清澈为止；用自来水充分冲洗1mm筛网中的混合物，然后去除1mm筛网，再仔细冲洗100μm筛网中的混合物，并小心将混合物全部冲洗至一角，用洗瓶将混合物全部冲洗转移到100ml的烧杯中，用超声波清洁器震荡30s后重新倒入100μm筛网中，自来水仔细冲洗后小心转移到培养皿中，在20倍实体显微镜下将培养皿中的孢子用尖嘴吸管收集；在超声波清洁器中处理30秒以去除孢子表明的污物，用蒸馏水洗涤孢子后在2％的氯胺-T溶液中处理30分钟，再用混合抗生素(0.02％的链霉素和0.01％的庆大霉素)处理于4℃冰箱中12-18小时；在超净工作台上将灭菌的孢子接种到恢复生长的毛状根的表面和旁边；3、共生体系的建立接种后的培养皿在25℃暗黑条件下培养，每天用显微镜跟踪观察，一般接种1～5天后孢子开始萌发，5～10天后可以对毛状根形成侵染，3周后可以见到外生菌丝从毛状根出来，在培养基表面生长；此时，番茄毛状根与AM真菌的共生关系已经建立。
权利要求
1.一种建立丛枝菌根真菌与番茄毛状根共生关系的方法，其特征在于通过将发芽后的番茄细苗用发根农杆菌菌悬液浸泡后接种于蔗糖琼脂培养基上培养，诱导长出毛状根；然后将番茄毛状根转移到M培养基上，接种AM真菌孢子后置黑暗条件下培养，待发芽菌丝侵入根系，即表明已建立起AM真菌与番茄毛状根的共生关系。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程如下(1)番茄毛状根的诱导将番茄种子用95％乙醇和10％次氯酸钠进行表面灭菌，水洗后播种到蔗糖琼脂培养基上，黑暗条件下发芽7～10天后，在超净工作台上将幼苗分切成下胚轴、中胚轴和上胚轴3个部分，在发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌悬液中浸泡20～30分钟，在无菌水中洗5次后，无菌滤纸吸去多余菌液，接种到蔗糖琼脂培养基上，约7～15天后植物组织表面开始出现毛状根；待毛状根长至2～5cm后，放置在含抗生素的MS培养基上，经过3-5次继代培养直至没有发根农杆菌菌落出现；(2)AM真菌的接种将番茄毛状根转移到M培养基上，在毛状根的表面和边上接种灭菌后的AM真菌孢子；(3)共生体系的建立接种后的培养皿在暗黑条件下培养，1～5天后AM真菌孢子即可萌发，5-10天后发芽菌丝可以侵入根系，3周后可以见到外生菌丝在培养基表面生长，此时表明共生体系已经建立；(4)培养与继代共生体系建立以后可以在暗黑条件下继续培养2-3周，以后需要进行继代培养时即剪取一段含有外生菌丝的根段，转移到新的M培养基上。
3.权利要求2所述的方法，使用的蔗糖琼脂培养基的浓度为2％。
4.权利要求1或2所述的方法，发根农杆菌菌悬液的浓度为107～108cfu/ml。
5.权利要求1或2所述的方法，暗黑条件下培养的温度为25℃。
6.权利要求2所述的方法，AM真菌孢子的灭菌方法为将AM真菌孢子用2％的氯胺-T溶液中处理30分钟，再用混合抗生素(0.02％的链霉素和0.01％的庆大霉素)溶液4℃处理12-18分钟。
7.权利要求2所述的方法，继代培养的时间为1个月。
全文摘要
本发明涉及一种建立丛枝菌根真菌与番茄毛状根的共生关系的方法，首先通过将发芽后的番茄苗用发根农杆菌菌悬液浸泡后接种于蔗糖琼脂培养基上培养，诱导长出毛状根，然后将番茄毛状根转移到M培养基上，接种AM真菌孢子后置25℃黑暗培养，待发芽菌丝侵入根系后既表明已建立起番茄毛状根与AM真菌的共生关系。本发明成功地诱导了番茄毛状根，并与AM真菌在无菌的培养基上建立共生关系。通过本发明提供的系统，可以用于AM真菌的增殖以获得无菌的AM真菌材料，又可以用于无菌条件下进行AM真菌的相关研究。
文档编号A01G7/00GK1682584SQ200410026858
公开日2005年10月19日 申请日期2004年4月15日 优先权日2004年4月15日
发明者朱红惠, 姚青, 羊宋贞, 龙良鲲 申请人:广东省微生物研究所