专利名称：双转基因耐盐植物的培育方法
技术领域：
本发明涉及双转基因耐盐抗旱植物的培育方法，更具体地说双转基因烟草、西红柿、油菜等耐盐抗旱植物的培育方法。
背景技术：
土地的盐碱化已严重制约了现代农业的发展，为了培育出具有耐盐特性的农作物新品种，世界各地科学家进行了大量研究。结果表明，盐胁迫对植物造成的伤害，主要是植物细胞渗透压的变化引起细胞失水以及过量的盐分阻扰了植物细胞中主要的化学代谢途径。在天然的耐盐植物(halophyte)细胞内含有大量的盐分，但是从这些植物细胞中提取出的各种酶类却对盐离子十分敏感(Flowers 1977；Glenn et al.1999)，表明这些植物能够通过某种方式将吸收的盐离子同细胞液隔离。耐盐植物的耐盐机理主要是渗透调节作用，主要包括合成有机物质和积累无机盐两种方式。耐盐植物在盐生环境下，有机物合成增加，使细胞渗透势等于或低于环境渗透势，从而保证了植物体从环境中吸收足够水分，同时维持细胞正常膨压势，保持细胞正常生长。Sharma等1986年报道了小麦耐盐品种在一定的盐浓度下有机酸含量较不耐盐品种高，Hanson1985的研究认为禾本科植物在盐胁迫下，细胞内可以大量积累甜菜碱，其积累水平与植物抗盐胁迫的能力成正比，McDonnc于1988年，Asharfl于1990年等均报道了甜菜碱在细胞内积累能提高细胞的渗透调节能力，稳定细胞内大分子蛋白质和细胞膜的结构及功能。张士功等人的研究证明在盐胁迫下，小麦幼苗体内可溶性糖含量增高，外源甜菜碱能提高盐胁迫下小麦幼苗体内游离脯氨酸、可溶性糖、蛋白质等物质的含量，限制根对Na+的吸收，并阻止其向地上部位运输，同时提高K+的含量及向上运输的效率，从而提高植物体对盐胁迫的适应能力。外源甜菜碱还能在一定程度上提高小麦幼苗内SOD和POD等细胞保护酶的活性，降低活性氧自由基对质膜的伤害和脂膜过氧化作用的水平，维持了细胞质膜的稳定性和完整性。由此可见，在盐胁迫下，植物体内合成和积累大量的有机物是其抵抗盐胁迫的主要方式，甜菜碱不仅自身是一种渗透调节剂，而且还能促进其它渗透剂的合成；同时它还能改善植物体其它抵抗不良环境伤害的功能。另外，植物体在盐胁迫下，可以通过在液泡中积累无机盐离子进行渗透调节。实验证明，在盐胁迫下，小麦原生质体中的绝大多数Na+都集中在液泡中，在相同条件下，抗盐品种比不抗盐品种液泡中盐离子的含量高出20％左右。Sanrma等1981年报道，不同品种的小麦在同一盐浓度下，耐盐性强的品种较不耐盐的品种Na+和Cl-含量要小的多，这说明耐盐品种对盐离子透性小，它主要依靠质膜的选择透性或利用其它方式将盐离子拒之于门外，从而减轻了盐胁迫对植物体的伤害程度。
综上所述，植物大致通过以下三种方式使细胞内的盐离子维持在相对较低的水平一是植物在生长过程中不吸收盐离子，将其排斥在体外，这类植物被称为拒盐型植物；另一类是植物将吸收到体内的盐离子进行区域化，聚集在细胞器中(如液泡等)，这类植物被称为聚盐型植物；第三类为植物将吸收到体内的盐离子再通过一定的结构如盐腺分泌到体外，该类植物为排盐型植物(Wang et al.2003)。
以上所述的第一种方式没有多少农业应用研究价值，因为植物不吸收土壤中的盐份，大量的盐份仍保留在土壤内，从而土地无法脱盐；第二种机理涉及植物体的形态、结构及生理代谢，十分复杂，植物体主要是采取直接或间接的保护机制来提高自身的抗盐性，即利用小分子渗透调节物质的代谢以及过量表达可清除活性氧自由基的基因来提高植物对盐胁迫的耐受性。在植物体内这些渗透保护物质主要是多元醇、脯氨酸、季胺类化合物等，目前已经克隆了同这些渗透物质积累相关的一些基因，如脯氨酸合成酶(proA)基因、山菠菜碱脱氢酶(BADH)基因、磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD)基因、胆碱氧化酶(codA)基因、胆碱脱氢酶(betA)基因及磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因等，将这些基因在受体植物中过量表达后，转基因植株的耐盐性明显高于非转基因对照植株。另外，在受到盐胁迫时，植物细胞离子均衡受到破坏，通过降低由此产生的高Na+的毒害，调节细胞内的K+/Na+比率，维持其高K+低Na+的离子平衡，如过量表达可以调节植物细胞内离子平衡的UAL1基因，也可以提高转基因植株的耐盐性；以上第三种机理最具有应用研究价值，植物要在高盐环境中生存，除了通过无机盐离子进行渗透调外，最主要的是必须把过量的盐离子驱离细胞液(Glenn et al.1999)。通过位于细胞膜上的氢离子钠离子交换泵(Na+-H+Antiport)的作用，可以将细胞内的盐离子排到体外(Blumwald et al.2000；Shi et al.2000)。在植物细胞中还存在大量的液泡，位于液泡膜上的Na+/H+Antiport可以有效地将钠离子区域化到液泡内(Zhang & Blumwald 2001；Apse et al.1999；Blumwald & Poole 1985；Blumwald & Gelli 1997；Frommer et al1999)。
前期的研究工作表明，将脯氨酸合成酶基因(proA)、山菠菜碱脱氢酶(BADH)基因、磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD)基因、胆碱氧化酶(codA)基因、胆碱脱氢酶(betA)基因及磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因等在受体植物中过量表达后，转基因植株的耐盐性明显高于非转基因对照植株。将胆碱氧化酶(codA)基因导入拟南芥菜后，转基因植株获得了耐盐性(Hayashi et al 1997)；脯氨酸在植物体内的含量直接同植物的耐盐性相关，表达Na+/H+Antiport基因的转基因西红柿及油菜在受到盐胁迫时，其细胞内的脯氨酸含量明显增高(Zhang et al 2001；Zhang & Blumwald 2001)。近年来从细菌、酵母以及植物中相继克隆到了多个氢离子钠离子交换泵(Na+/H+Antiport)基因(Munro et al 1991；Ramirez et al 1998；Gaxiola et al 1999)。其编码的蛋白为Na+/H+交换泵，该蛋白定位在植物细胞内的液泡膜上，功能是将细胞液中的钠离子转移到液泡中，同时把液泡内的氢离子交换到液泡外的细胞液中，从而使植物吸收的大量盐分(Na+)“区域化”到液泡内，细胞液中Na+的含量保持在相对较低的水平，各种生理代谢活动可以正常进行，表达该基因的转基因植株也就获得了抗盐特性。转基因植物把吸收到细胞内的盐分聚集在液胞内，不仅可以免除盐离子在细胞液中的毒害，同时还可以借助于盐离子将水分吸入细胞内以维持渗透平衡。同渗透物质积累相关的基因以及清除活性氧自由基的基因主要是通过直接或间接的保护机制来提高植物对盐胁迫的耐受性；Na+/H+交换蛋白基因则是通过对植物吸收的大量盐分(Na+)进行“区域化”来提高植物的耐盐性，二者作用机理不同。
发明内容
本发明的目的是用转基因技术使作用机理不同的两类耐盐基因同时在受体植物中表达，从而获得抗盐性高于转单基因的双转基因抗逆植物新品种。
因此，本发明一方面提供了一种培育抗逆性提高的植物品种的方法，该方法包括a)将与小分子渗透调节物质的合成相关的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na+/H+交换蛋白基因或其具有生物活性的片段或类似物转化到所述植物细胞中，并使所述基因在所述植物细胞中表达；b)从步骤a)获得的所述植物细胞再生出植物，并选出抗逆性提高的植物品种。
本发明另一方面提供了一种植物细胞，它被与小分子渗透调节物质的合成相关的或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na+/H+交换蛋白基因或其具有生物活性的片段或类似物转化。
附图简述
图1显示了植物表达载体pHXZ/BADH的结构图，图中NOS-proNOS启动子；NOS-terNOS终止子；CaMV 35S proCaMV 35S启动子；RB和LB左右边界；BADH山菠菜碱脱氢酶基因；NPT II(Kanr)新霉素磷酸转移酶。
图2显示了植物表达载体pHXZ/MGX4的结构图，图中NOS-proNOS启动子；NOS-terNOS终止子；CaMV 35S proCaMV 35S启动子；RB和LB左右边界；MGX4红树Na+/H+交换蛋白基因；Hpt潮霉素磷酸转移酶。
图3显示了在100mg/L卡那霉素的选择压力下的再生出的烟草植株，其中A，野生型正对照；B，再生的抗性苗；C，野生型负对照(未感染)。
图4显示了在50mg/L的潮霉素的选择压力下的再生的烟草植株，其中A，野生型正对照；B，再生抗性苗；C，野生型负对照(未感染)；D，野生型负对照(未感染，C的底面)。
图5显示了在100mg/L卡那霉素和150mM NaCl的选择压力下的再生的烟草植株，其中左图表示两周后的烟草植株，右图表示一个月后的烟草植株；其中CK+为野生型非转基因烟草在不含有卡那霉素及NaCl的MS培养基上的生长情况，CK-为野生型非转基因烟草在含有100mg/L卡那霉素及150mM NaCl的MS培养基上的生长情况，TG为转基因烟草在含有100mg/L卡那霉素及150mM NaCl的MS培养基上的生长情况。
图6显示了对转基因植株的PCR分析结果，其中1，pHXZ/BADH质粒；2，空白对照(水)；3，野生型烟草总DNA；4、5，不同的转BADH基因株系总DNA(B-5、B-8)；6，双转基因株系BM-12总DNA(BADH基因引物)；7，pHXZ/MGX4质粒；8，空白对照(水)；9，野生型烟草总DNA；10、11，不同的转MGX4基因株系总DNA(M-6、M-16)；12，双转基因株系BM-12总DNA(MGX4基因引物)；13，1kbDNA标记。
图7显示了转基因植株在100毫克/升卡那霉素、50毫克/毫升潮霉素以及0、100、200、300mM NaCl的选择压力下的耐盐性试验结果。其中WT为野生型非转基因烟草，B为只表达BADH基因的转基因烟草，M为表达MGX4基因的转基因烟草，B+M为同时表达BADH及MGX4基因的双转基因烟草。
图8显示了将野生型烟草、单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草、同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草种子播种在MS0培养基上的萌发及成活情况，它们都能够萌发并成活。其中左上为野生型烟草；右上为单独表达BADH基因的单转基因烟草；左下为单独表达MGX4基因的单转基因烟草；右下为同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草。
图9显示了将野生型烟草、单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草、同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草种子播种在含有250mM NaCl的MSO培养基上的萌发及成活情况。其中左上为野生型烟草；右上为单独表达BADH基因的单转基因烟草；左下为单独表达MGX4基因的单转基因烟草；右下为同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草。
图10显示了将野生型烟草、单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草、同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草幼苗(长出3-4片真叶)进行耐旱试验(每周保持3天干旱处理)的结果，双转基因烟草的生长情况明显优于野生型烟草以及单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草。其中A为野生型烟草；B为单独表达BADH基因的单转基因烟草；C为单独表达MGX4基因的单转基因烟草；D为同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草。
具体实施方案本发明一方面涉及一种培育抗逆性提高的植物品种的方法，该方法包括a)将与小分子渗透调节物质的合成相关的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na+/H+交换蛋白基因或其具有生物活性的片段或类似物转化到所述植物细胞中，并使所述基因在所述植物细胞中表达；b)从步骤a)获得的所述植物细胞再生出植物，并选出抗逆性提高的植物品种。
在本发明所用的术语中，“目的基因”即指同小分子渗透调节物质的合成(积累)相关的基因以及可以清除活性氧自由基的基因(下文简称“目的基因A”)、Na+/H+交换蛋白(Na+/H+Antiport)基因(下文简称“目的基因B”)。在植物体内渗透调节物质主要是指多元醇、甜菜碱、脯氨酸、季胺类化合物等，同小分子渗透调节物质的合成(积累)相关的基因是指脯氨酸合成酶(proA)基因、胆碱氧化酶(codA)基因、山菠菜碱脱氢酶(BADH)基因、磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD)基因、胆碱脱氢酶(betA)基因及磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因、Δ1二氢吡咯-5-羧酸盐合成酶(Δ1Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase，P5CS)基因、UAL1基因等。Na+/H+交换蛋白基因是指任何编码具有Na+/H+交换蛋白功能(活力)的基因，例如MGX4基因。
本发明的术语“基因”的含义不仅涵盖了全长基因，而且所述基因的片段和类似物也包括在该术语的范围内。“类似基因”系指任何同“目的基因”编码序列中的任何区域同源性在40％以上、较佳的在60％以上、更佳的在80％以上、还要佳的在90％以上的基因，或其编码的氨基酸序列同“目的基因”氨基酸编码序列中任何区域有40％以上、较佳的在60％以上、更佳的在80％以上、还要佳的在90％以上的同源性的基因。在较佳的实施方案中，所述“类似基因”编码的氨基酸序列与所述“目的基因”编码的氨基酸序列相比有1-20个、更佳的有1-10个氨基酸发生插入、缺失或置换。所述“类似基因”可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在体外扩增的。
术语“基因片段”的含义是指长度在300个碱基对(bp)以上的同“目的基因”或“类似基因”DNA序列中的任何域区同源性在40％以上、较佳的在60％以上、更佳的在80％以上、还要佳的在90％以上的任何DNA片段，或任何编码100个氨基酸以上的DNA片段，其编码的氨基酸序列同“目的基因”或“类似基因”编码的氨基酸序列中的任何区域同源性在40％以上、较佳的在60％以上、更佳的在80％以上、还要佳的在90％以上。该基因片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。
本领域技术人员应当理解，任何“基因片段”或“类似基因”均能适用于本发明，只要所述基因片段或类似基因具有所需的生物活性即可。在此处，对于基因的片段或其类似物而言，“具有生物活性”即指所述基因片段或基因类似物所编码的氨基酸序列具有与所述基因所编码的氨基酸序列相同或基本上相同的生物活性。
另外，在整篇说明书中，“转基因”系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。
本文所用的术语“植物”或“受体植物”系指整个植物界，包括低等植物、高等植物、藻类以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻类、厥类、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、粮食作物、油料作物、药用植物、苗木、花卉)等。在具体实施方案中，所述植物选自蔬菜、粮食作物、油料作物、药用植物，例如烟草、西红柿、油菜等作物。然而，本领域技术人员应当能够明了，本发明的方法可以适用于任何其它植物。
术语“抗逆植物”，指任何具有抗盐、抗旱、抗寒、抗热、抗虫等特性的植物。
本发明者通过将两种作用机理不同的基因(目的基因A和B)分别或同时转化到受体植物中，使其同时在受体植物中大量表达，从而获得了耐盐性显著高于单个基因(即目的基因A和B)的受体植物。尽管不愿意受理论的束缚，本发明人认为所述显著耐盐特性的获得可能是基于以下原因一方面受体植物细胞内小分子渗透调节物质的含量提高，其维持渗透平衡的能力得以增强；另一方面，受体植物细胞内Na+/H+交换蛋白的含量大幅度提高，将细胞液中的钠离子“包装”到液泡内，从而使双转基因植株的耐盐特性进一步提高。本发明者发现这两种不同的作用机理的组合导致了植物抗逆性有了出乎意料的显著增加，双转基因植株的种子可以在含有高盐浓度的培养基上萌发并存活，而单独表达目的基因A或B的单转基因植株不能在含有高盐浓度的培养基上萌发并存活。本发明的方法不仅使受体植物的抗盐能力达到最高点，还使其对其他相关逆境因子(如寒冷、干旱等)的耐受性也同时得以提高。
具体而言，本发明的方法包括以下步骤1.构建可以在植物中大量表达的基因表达载体，将目的基因A、目的基因B分别装配于具有不同筛选标记的基因表达载体上，置于强力组成型表达强力启动子(如CaMV35S)或其他类型的启动子(如可诱导型启动子)之下，构建成可以在植物中表达的二元载体。或将目的基因A、目的基因B装配到同一个表达载体上，置于强力组成型表达强力启动子(如CaMV35S)或其他类型的启动子(如可诱导型启动子)之下，构建成可以在植物中表达的三元载体。
2.将上述基因表达载体导入受体植物中，并在启动子的带动下，使目的基因在转基因受体植物中大量表达；根据基因表达载体上的筛选标记筛选具有双抗性的再生植株。可用本领域已知的任何方法来生产转基因的植物，这些方法包括但不局限于，根癌农杆菌介导的DNA转移(较佳的用去臂的T-DNA载体)、化学转化(如PEG转化)、电穿孔、直接DNA转移、花粉管法和粒子轰击等技术。例如，一种熟知的方法是根癌农杆菌介导DNA转移入植物组织，然后进行选择和体外生长，随后将转化的植物组织再生成植物。本发明的目的基因A和B可籍由同一表达载体或不同表达载体分别导入植物细胞中。较佳的是，所述表达载体还可携带抗生素(如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博来霉素等)有抗性的标记基因。这些标记基因的存在使人能选出在含有某些抗生素的培养基中生长的成功转化的植物细胞。
通过植物转化技术衍生获得的转化的植物细胞，包括上述那些，可培育再生成具有转化基因型的全植物，从而具有所需的表型(如对盐的耐受性)。从植物细胞再生转基因植株的技术虽然对于本发明而言很重要，但是它是本领域中熟知的常规技术。例如，从培养的原生质体再生植物的方法在Evans，等人，《原生质体分离和培养，植物细胞培养手册》124-176页，Macmillan Publishing Company，New York，1983中有所描述。另外，还可从植物胼胝体、外植体、器官或其部分再生植物。如果已经将可选择的标记(如抗生素抗性标记)导入细胞内，那么可将选择试剂掺入再生培养基中，以进一步确认再生的小植株是转基因植株。所述再生培养基中例如可以是含有植物生长素和细胞分裂素的MS培养基。
3.对第一代双抗性再生植株进行DNA(Southern Blots)，RNA(Northern Blots)及蛋白(Western Blots)杂交分析，并检测其抗盐性及其他相关的抗逆性；4.对上述蛋白分析呈阳性的第一代个体进行继代繁殖，并分析其后代(F1，F2，F3，F4)中目的基因的含量(表达水平)及个体的抗盐性及其他相关的抗逆性；
5.对转基因后代进行中试及大田试验，并申请通过国家相关部门的品种鉴定。
本发明另一方面还提供了一种植物细胞，其特征在于，它被与小分子渗透调节物质的合成相关的或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na+/H+交换蛋白基因或其具有生物活性的片段或类似物转化。在较佳的实施方案中，所述植物是烟草，所述与小分子渗透调节物质的合成相关的或清除活性氧自由基的基因是山菠菜碱脱氢酶基因，所述Na+/H+交换蛋白基因是MGX4基因。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中所述条件)实施，或按照制造厂商所建议的条件。
将从山菠菜中克隆的参与甜菜碱合成的山菠菜碱脱氢酶(BADH)基因、从红树中克隆的MGX4基因(Na+/H+Antiport)基因在烟草中分别及共同表达后，双转基因烟草的耐盐性明显高于表达单个基因(BADH或Na+/H+Antiport)的转基因烟草，并且双转基因烟草的种子可以在含有高盐浓度(200mM NaCl)的培养基上萌发并存活，而单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草不能在含有高盐浓度的培养基上萌发并存活(图8，9)。将BADH基因、MGX4基因，分别装配于强力组成型表达的花椰菜花叶病毒35S强力启动子(CaMV35S)之下，构建成可以在植物中表达的载体，通过农杆菌介导的转化方法，使该目的基因在转基因植株内大量表达，具体操作如下1)、植物表达载体pHXZ/BADH、pHXZ/MGX4的构建将具有卡那霉素筛选标记的二元植物表达载体pBI121首先用限制性内切酶SstI消化后，用T4DNA聚合酶切成平头，再用限制性内切酶Xba I切割，将载体上原有的GUS基因切去，将载体纯化后回收；同时，将BADH抗盐基因(Jia et al，2002)用Xba I和SmaI酶切，然后将其回收后同载体连接，得到具有卡那霉素筛选标记的植物表达载体pHXZ/BADH(
图1)。将具有潮霉素筛选标记的二元植物表达载体pGPTV35S-HPT首先用限制性内切酶SstI消化后，用T4DNA聚合酶切成平头，再用限制性内切酶Xba I切割，将载体上原有的GUS基因切去，将载体纯化后回收；同时，将MGX4基因(红树Na+/H+交换蛋白基因)用Xba I和SmaI酶切，将其回收后同载体连接，得到具有潮霉素筛选标记的植物表达载体pHXZ/MGX4(图2)。
2)、烟草的遗传转化将植物表达载体pHXZ/BADH、pHXZ/MGX4分别导入农杆菌LBA4404中(Zhang & Zeevaart 1999)，用含有pHXZ/BADH的农杆菌培养液感染野生烟草叶切片，在共生培养基(MS+1毫克/升6-BAP(苄基氨基嘌呤)、0.1毫克/升NAA(萘乙酸))上共培养2天后，转移到再生培养基上(MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、100毫克/升卡那霉素、200毫克/升氨苄霉素)；如图3所示，在100mg/L的卡那霉素的选择压力下，可以从经过农杆菌侵染的烟草叶片外植体上再生出烟草植株。大约三周后，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上(MS+0.1毫克/升NAA、50毫克/升卡那霉素、100毫克/升氨苄霉素)，诱导生根；两周后将已生根的幼苗转移到土壤中培养，将收获的T1种子播种在含有100毫克/升卡那霉素的MS培养基上，筛选出纯合体，对其进行分子鉴定后用于二级转化。
用含有pHXZ/MGX4的农杆菌培养液感染表达BADH基因的转基因烟草叶片，在共生培养基MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、100毫克/升卡那霉素)上共培养2天后，转移到再生培养基上(MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、100毫克/升卡那霉素、50毫克/升潮霉素、200毫克/升氨苄霉素)。如图3所示，在100mg/L的卡那霉素、50毫克/升潮霉素的选择压力下，可以从经过农杆菌侵染的烟草叶片外植体上再生出烟草植株。
大约三周后，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上(MS+0.1毫克/升NAA、50毫克/升卡那霉素、50毫克/升潮霉素、200毫克/升氨苄霉素)，诱导生根。两周后将已生根的幼苗转移到土壤中培养，将收获的T1种子播种在含有50毫克/升潮霉素的MS培养基上，筛选出纯合体，对双转基因植株进行分子鉴定和耐盐试验。
如图4所示，在50mg/L的潮霉素的选择压力下，只有经过转化的具有潮霉素抗性的烟草再生植株可以生根。假阳性(箭头所示)可以在进一步的筛选中筛除。
在100mg/L的卡那霉素和150mM NaCl的选择压力下，对卡那抗性植株做进一步的选择，经过两周和一个月的筛选、观察，只有转基因的再生植株(TG)可以正常生根，而野生型的烟草一直到一个月后都难以生根(图5)。对转基因植株进行PCR分析，结果表明，转基因植株中已经整合了外源基因(图6)。对转基因植株的耐盐性试验，实验结果表明，在100mg/L的卡那霉素、50mg/L的潮霉素和不同浓度NaCl(0、100、200、300mM)的选择压力下，野生型烟草在选择培养基上萌发后，不能长出真叶。而转基因烟草的种子在选择培养基上可以萌发且正常生长。经过抗性筛选后，转基因植株的根比对照有极明显的伸长(图7)。
将双转基因烟草的种子培养在含有高盐浓度(200mM NaCl)的MS培养基上可以萌发并存活，而单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草不能在含有高盐浓度(200mM NaCl)的MS培养基上萌发并存活(如图8，9所示)。
另外，对野生型烟草、单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草、同时表达BADH和MGX4基因的双转基因烟草幼苗(长出3-4片真叶)进行耐旱试验(每周保持3天干旱处理)，结果如
图10所示，双转基因烟草的生长情况明显优于野生型烟草以及单独表达BADH或MGX4的单转基因烟草。
在本发明前面以及下文提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献Apse，M.P.，Aharon，G.S.，Snedden，W.S.& Blumwald，E.Salt tolerance conferred byoverexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis.Science 285，1256-1258(1999).
Blumwald，E.& Poole，R.J.Na+/H+antiport in isolated tonoplast vesicles from storagetissue of Beta vulgaris.Plant Physiol.78，163-167(1985).
Blumwald，E.& Gelli，A.Secondary inorganic ion transport in plant vacuoles.Adv.Bot.Res.25，401-407(1997).
Blumwald，E.，Aharon，G.S.& Apse，P.Sodium transport in plant cells.Biochim.Biophys.Acta 1465，14-151.(2000)Flowers，TJ，Troke，PF and Yeo，AR The mechanism of salt tolerance in halophytes.Ann Rev Plant Physiol 28183-121(1977)Frommer，W.B.，Ludewig，U.，Rentsch，D.EnhancedTaking Transgenic Plants with aPinch ofSalt.Science 2851222-1223(1999)Gaxiola，R.A.，Rao，R.，Sherman，A.，Grisafi，P.，Alper，S.L.，& Fink，G.R.TheArabidopsi s proton transporters，AtNhx1 and Avp1，can function in cation detoxification inyeast.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1480-1485(1999)Glenn，E.，Brown，J.J.& Blumwald，E.Salt Tolerance and Crop Potential ofHalophytes Crit.Rev.Plant Sci.18，227-255.(1999)G.-X.Jia，Z.-Q.Zhu，F.-Q.Chang，Y.-X.Li Transformation of tomato with the BADH genefrom Atriplex improves salt tolerance Plant Cell Reports 21(2)14l-146.(2002)Munro，A.W.，Ritchi，G.Y.，Lamb，R.M.，Douglas，R.M.，& Booth，I.R.The cloning andDNA sequence of the gene for the glutathion-regulated potassium-efflux system KefC ofEscherichia coli.Mol.Microbiol.5，607-616(1991).
Ramirez，J.，Ramirez，O.，Saldana，C.，Coria，R.，& Pena，A.A Saccharomycescerevisiae mutant lacking a K+/H+exchanger.J.Bacteriol.180，5860-5865(1998).
Shi，H.，Ishitani，M.，Kim，C.& Zhu，J.-K.The Arabidopsis thaliana salt tolerancegene SOS 1encodes a putative Na+/H+antiporter Proc.Natl.Acad.Sci.USA97，6896-6901.(First Published May 23，2000；10.1073ypnas.120170197)(2000)Wang，W.X.，Vinocur，B.，Altman，A.Plant response to drought，salinity and extremetemperaturestowards genetic engineering for stress tolerance.Planta 218(1)10-14(2003)Zhang，H.X.and Blumwald，E Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate saltin foliage but not in fruit.Nature Biotechnology.19(8)765-768(2001)Zhang，H.X.，Hodson，J.N.，William，J.P.& Blumwald E.Engineering salt tolerantBrassica plantsCharacterization of yield and seed oil quality in transgenic plants withincreased vacuolar sodium accumulation.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 98(22)12832-12836(2001)
权利要求
1.一种培育抗逆性提高的植物品种的方法，其特征在于，该方法包括a)将与小分子渗透调节物质的合成相关的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na+/H+交换蛋白基因或其具有生物活性的片段或类似物转化到所述植物细胞中，并使所述基因在所述植物细胞中表达；b)从步骤a)获得的所述植物细胞再生出植物，并选出抗逆性提高的植物品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与小分子渗透调节物质的合成相关的基因选自脯氨酸合成酶基因、胆碱氧化酶基因、山菠菜碱脱氢酶基因、磷酸甘露醇脱氢酶基因、胆碱脱氢酶基因、磷酸山梨醇脱氢酶基因、Δ1二氢吡咯-5-羧酸盐合成酶基因或UAL1基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，与小分子渗透调节物质的合成相关的基因或清除活性氧自由基的基因，以及Na+/H+交换蛋白基因籍由同一表达载体导入所述植物细胞中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，与小分子渗透调节物质的合成相关的基因或清除活性氧自由基的基因，以及Na+/H+交换蛋白基因籍由具有不同筛选标记的不同表达载体分别导入所述植物细胞中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物选自光合水生物、藻类、厥类、裸子植物或被子植物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化方法选自农杆菌介导、PEG转化、基因枪或花粉管法。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗逆性为耐盐性和抗旱性。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与小分子渗透调节物质的合成相关的基因是山菠菜碱脱氢酶基因，所述Na+/H+交换蛋白基因是红树Na+/H+交换蛋白基因。
9.一种植物细胞，其特征在于，它被与小分子渗透调节物质的合成相关的或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na+/H+交换蛋白基因或其具有生物活性的片段或类似物转化。
全文摘要
本发明提供了一种培育抗逆性提高的植物品种的方法，其特征在于，该方法包括a)将与小分子渗透调节物质的合成相关的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或类似物，以及Na
文档编号A01H4/00GK1727490SQ200410053340
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月30日 优先权日2004年7月30日
发明者张洪霞, 杨磊, 贾同春 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 山东中盛生物工程有限公司