专利名称：水葫芦生物抑制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及天然植物源除草剂，具体是关于水葫芦生物抑制剂及其制备方法。
背景技术：
水葫芦[Eichhornia crassipes(Martus)Solmslaubach]又称凤眼莲，是雨久花科凤眼蓝属的多年生飘浮性宿根大型水生单子叶植物，原产于南美洲。水葫芦在13-39℃温度下均能繁殖，以无性繁殖为主，在适宜条件下每5天就能繁殖一个新的植株，也能开花结实产生种子而进行有性繁殖，一枝花大约结300粒种子。1万平方米的水面能生长200万株水葫芦，合计300多吨，是世界上生长、繁殖最快的水草之一，也是危害最严重的多年生水生杂草之一。它侵占水库、湖泊、堵塞河道、灌渠、为蚊蝇的滋生、繁殖提供良好的环境，严重危害农业发展，水上运输和人类健康。
我国辽宁南部、华北、华东、华中、西南和华南的19个省(市、区)均有分布，特别是长江流域及其以南地区，水葫芦导致生态破坏和生物污染，生长难以控制，对生态系统造成不可逆转的破坏，大量水生动植物的死亡；导致生物多样性的丧失、生态灾害频发，对农林业造成严重的损失。
目前在水葫芦治理中，国内多用人工打捞和化学药剂。目前国内外使用的化学药剂主要有克无踪(paraquat)、草甘磷(glyphosate)、农达(Roundup)、41％Bioforce水剂、2，4-D。在庞大的水体中，滥用化学除草剂容易产生新一轮的环境污染造成的后果越来越严重，人们已把目光投向无污染、无公害的天然产物农药及植物性农药。
利用植物化感作用(allelopathy)来控制一些杂草的生长，已有很多报道(Fujii Y等，weed Biology and Management 3233-241，2003；Singh HP等，Agriculture，Ecosystems and Environment 95537-541，2003；Chung IM等，Crop Protection 21913-920，2002)。开发植物源农药主要是利用植物体的次生代谢物质，这些物质是植物自身防御体系与有害生物的相互适应演变、协同进化的结果，具有除草剂活性物质通常包括酚酸类(phenolic acids)，生物碱(alkaloids)，三萜(烯)(triterpenes)等。与有机合成农药相比，植物源除草剂具有选择性高、低毒、易降解等优点(Beiz RG amd Hurle K，Journal of Chemical Ecology，Vol 30，No.1，pp 175-198，2004)。利用植物内源提取物治理水葫芦的有关报道很少，例如印度的Saxena报道用马缨丹(Lantana camara)叶的提取液培养水葫芦，能够有效地杀死水葫芦，但其作用机理及其有效成分尚不清楚(Saxena MK，Journal of Chemical Ecology，Vol.26，No.10.pp2435-2447，2000)。国内尚未见有关用生物抑制剂治理水葫芦的报道。因此，研究寻找一种安全、稳定和高效的水葫芦的生物防治制剂，为建立健康、有效的水葫芦管理体系，提供新的途径，是一个很有价值的研究工作。
发明内容
本发明提供一种水葫芦生物抑制剂及其制备方法。
水葫芦生物抑制剂是由马缨丹提取液，甘油和表面活性剂组成。它们的体积比为马缨丹提取液∶甘油∶1重量％浓度的表面活性剂＝85-95∶10-4∶5-1。并用醋酸调节pH为5.6-5.8。
马缨丹提取液的提取方法是将马缨丹的叶片于60-80℃烘干至恒定，制成干粉。取1-10重量份的马缨丹叶的干粉在100重量份水中于温度1-10℃提取过夜，离心，取上清液即是马缨丹提取液，马缨丹是本发明抑制剂的活性成份，它能抑制水葫芦生长，叶芽的繁殖，加速水葫芦叶的衰老死亡。
甘油是起保湿剂的作用，保持在喷药后的一定时间内叶表面有一定的湿度，以增加药效。
表面活性剂的作用是，由于水葫芦表面有蜡质，光滑，表面活性剂的作用是使药剂喷洒在叶的表面后，能粘附于叶的表面。表面活性剂可选自于吐温-20，TritonX-100或十二烷基硫酸钠(SDS)，在抑制剂配方中是采用1重量％浓度。
本发明水葫芦生物抑制剂的制备方法将马缨丹的叶片于60-80℃烘干至恒重制成干粉，取1-10重量份的马缨丹叶的干粉在100重量份水中于温度1-10℃下提取过夜，离心，取上清液即得马缨丹提取液。在该提取液中加入按上述体积比的甘油和1重量％浓度的表面活性剂，混匀，用醋酸调节pH为5.6-5.8，即制得液体抑制剂。
本发明抑制剂可直接喷洒在水葫芦叶面上使用，实验室的实验结果表明，它能有效地抑制水葫芦叶芽的生长，加速水葫芦叶片衰老死亡。抑制效果还可通过对喷洒药前后的叶片中的叶绿素含量的测定和超氧化物歧化酶的测定来显示。
叶绿素是高等植物用于光合作用光能吸收和传递的主要色素。用本发明水葫芦生物抑制剂喷洒水葫芦的实验表明，喷洒3天后，水葫芦叶片的叶绿素含量，明显低于对照，嫩叶与老叶中总的叶绿素相对含量分别是对照的50.39％与47.72％，叶绿素含量的减少，影响了叶片的光合作用，水葫芦的生长发育因此受到抑制。
超氧化物歧化酶(SOD)能够有效地维持植物体细胞内活性氧代谢平衡，水葫芦生物抑制剂能降低水葫芦细胞内SOD活性，加速水葫芦叶的衰老死亡，从而达到抑制水葫芦的生长与无性繁殖作用。
又对本发明水葫芦生物抑制剂进行了对水体生物安全性的试验。试验结果显示，对南美白对虾的安全浓度为235μl/l，对蒙古裸腹蚤的安全浓度为5.1ml/l，证明了该抑制剂对水体生物的毒性很低。
综合本发明试验结果，表明以马缨丹的天然产物为主要成分的本发明水葫芦生物抑制剂能够有效地促进水葫芦叶片的衰老死亡，并对其叶芽有一定的抑制作用，降低叶片叶绿素的含量和超氧化物歧化酶的活性，对水葫芦的生长与有明显的抑制作用，加速水葫芦叶片的衰老死亡。
与目前国内外常用的有机化学药剂相比，本发明还具有下列优点(1)生产成本低本发明采用的药用植物马缨丹是一种生物产量很高的植物，容易栽培，且有效成份含量高、活性强。
(2)容易生产马缨丹叶干燥后，只需简单的水提取即可使用，不要复杂的化学合成。
(3)无化学污染，环保型的具有低毒、易降解等环保方面的优点，本发明抑制剂使用的植物的天然产物，在使用一段时间后，就能够被降解，实验表明该抑制剂对水生生物的毒性很低。
(4)本发明抑制剂的使用不受温度的限制，实验室内的研究表明，用本制剂喷洒水葫芦的叶，用药剂量为0.17L/m2，每天喷洒一次，连续喷洒7天，都能有效地使水葫芦的叶提早衰老死亡，根坏死，叶芽繁殖受到抑制。
因此本发明水葫芦生物抑制剂作为水葫芦的天然植物源除草剂具有很大的潜在的应用价值，具有广阔的开发前景。
图1水葫芦生物抑制剂对水葫芦叶芽繁殖与叶片衰老死亡作用的照片，A对照，B喷抑制剂5天后，C喷抑制剂8天后，D对照水葫芦植株与处理11天后的水葫芦植株。
图2水葫芦生物抑制剂对水葫芦叶片中SOD酶活性影响的曲线图。
具体实施例方式
实施例1水葫芦生物抑制剂的制备取广州市郊区采集的马缨丹叶，于70℃烘干至恒重，研磨成细粉末制成干粉(约小于100目)，在1000毫升水中加30克干粉，在4℃下进行提取过夜，10000g离心15分钟，取上清液，即为马缨丹提取液。向该提取液940ml中，加入甘油50ml及1重量％浓度的吐温-20 10ml，搅拌混匀，用醋酸将pH调节至5.6，即得液体水葫芦生物抑制剂。
实施例2水葫芦生物抑制剂的制备取广州市郊区采集的马缨丹叶，于80℃烘干至恒重，研磨成细粉末制成干粉(约小于100目)，在1000毫升水中加100克干粉，在10℃下进行提取过夜，10000g离心15分钟，取上清液，即为马缨丹提取液。向该提取液850ml中，加入甘油100ml及1重量％浓度的TritonX-100 50ml，搅拌混匀，用醋酸将pH调节至5.8，即得液体水葫芦生物抑制剂。
实施例3水葫芦生物抑制剂对水葫芦生长及叶片衰老死亡的影响试验水葫芦[Eichhornia crassipes(Mart.)Solms.Family Pontederiaceae]采集于上海市清浦县的河道中，再于中科院植物生理生态所的人工气候室的缸中进行生长繁殖。选取大小、形态相似的水葫芦植株(每株水葫芦大约50g鲜重，5片展开的叶子，根长20cm，水上部分20cm左右)培养于盛有15L Hoagland营养液的塑料盒(34×27×19cm)中，人工气候室中培养实验，温度25-30℃，光照1000-2500lux(modelAplab ML 4420光度计测定)。实验期间塑料盒中培养液通过添加蒸馏水保持恒定的体积。每一盒中放入5棵水葫芦，每4盒为1组，用药剂量为0.17L/m2，用实施例1制得的抑制剂进行喷洒，每天喷洒一次，对水葫芦新增及死亡叶进行观察统计，每组试验重复3次。
试验结果1.喷药后水葫芦叶的反应图1表明喷洒抑制剂后，水葫芦的老叶提前衰老死亡，在喷药后3-5天水葫芦的叶明显失绿，8天后大部分叶已衰老死亡，根与茎部也开始坏死。水葫芦生长受到明显的抑制。
2.叶芽繁殖与叶的衰老死亡统计结果从表1可看出用水葫芦生物抑制剂喷洒3天后，水葫芦的叶片，尤其是较老的叶片开始坏死，5天后膨大的葫芦部位也开始失绿坏死。本发明抑制剂同时还减慢了水葫芦叶芽的增加速度，但不能完全抑制叶芽的繁殖，其主要作用是加速叶片衰老，最后导致其死亡(见图1)，可见本发明抑制剂对抑制水葫芦的生长及叶芽的繁殖有显著的效果。
表1.水葫芦生物抑制剂处理对水葫芦叶芽繁殖及叶片衰老死亡的影响
注表中数字是平均数±方差，“0”表示没有。
实施例4.水葫芦生物抑制剂对水葫芦叶片的叶绿素含量影响的试验叶绿素的测定与计算参考Arnon等的方法(Amon DI，PlantPhysiol.，241-15，1949)加以修改。用实施例1制得的水葫芦生物抑制剂喷洒水葫芦3天后，选取从中心叶芽开始的第2片叶为嫩叶，第5片叶为老叶，大约2g，剪碎后加丙酮10ml，过滤后，于751GW分光光度计上，663nm和645nm波长处读取光密度，计算出叶绿素的含量，每组实验重复3次。
实验结果见表2。实验表明，喷洒3天后，水葫芦叶片的叶绿素含量，明显低于对照，嫩叶与老叶中总的叶绿素相对含量分别是对照的50.39％与47.72％，叶绿素含量的减少，影响了叶片的光合作用，这也是本发明生物抑制剂能够抑制水葫芦生长的原因之一。
表2水葫芦生物抑制剂喷洒3天后水葫芦叶片中叶绿素的含量(平均±方差)
注“相对含量”表示受处理的叶片中叶绿素的含量占对照叶片中叶绿素含量的百分比。
实施例5.水葫芦生物抑制剂对水葫芦叶片的超氧化物歧化酶影响的试验超氧化物歧化酶的测定方法参见Giannoplilis等的方法(Giannoplilis CN等，Plant physiol.，59315-318，1997)。取2g左右的叶片，加入5ml的研磨缓冲液(0.02mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.8)，研磨(冰上)成匀浆，用两层纱布过滤后，13,000g，4℃离心，20分钟。上清液即酶提取液用于酶活测定。反应混合液3ml(由0.013mol/L蛋氨酸，1.3×10-6mol/L核黄素，7.5×10-5mol/L氮蓝四唑，0.05mol/L磷酸钠缓冲液组成，pH7.8)，与50μl酶提取液在37℃保温，4000lux光照，15分钟后，立即放回冰中保存，分光光度计560nm测定OD值。用磷酸缓冲液作为空白对照。
用实施例1制得的水葫芦生物抑制剂进行对水葫芦叶的喷洒处理，测定结果如图2所示，水葫芦的嫩叶中SOD的活性一直高于老叶，水葫芦生物抑制剂喷洒后显著下降，在处理5天后仍然与老叶的对照样品活性相似，在处理的早期嫩叶片中SOD尚能有效地清除O2，而后期SOD活性严重下降，则不能有效地清除O2，引发氧化性破坏作用，这可能是水葫芦生物抑制剂处理总是老叶先衰老死亡的原因之一。
实施例6.水葫芦生物抑制剂对水体生物的安全性试验将本发明水葫芦生物抑制剂委托上海水产大学进行了对水体生物的安全性试验。试验对象为南美白对虾(P.vanname)与蒙古裸腹蚤(Moina mongolica)。试验用水为曝气自来水。按常规方法测得pH为7.3-7.5，硬度为4.6德国度，试验水温分别为25±0.5℃与22±3℃。本实验对水葫芦叶面喷洒的落入40cm深水中最大的浓度为60μl/L。
试验结果是南美白对虾的安全浓度为235μl/L，对蒙古裸腹蚤的安全浓度为5.1ml/l。证明了本发明水葫芦生物抑制剂对南美白对虾与蒙古裸腹蚤的毒性很低。
权利要求
1.一种水葫芦生物抑制剂，其特征在于所述抑制剂是由马缨丹提取液，甘油和表面活性剂组成，它们的体积比为马缨丹提取液∶甘油∶1重量％浓度的表面活性剂＝85-95∶10-4∶5-1，并用醋酸调节pH为5.6-5.8；所述马缨丹提取液的提取方法，是将马缨丹叶片于60-80℃烘干至恒重，制成干粉，取1-10重量份的马缨丹叶的干粉在100重量份水中于温度1-10℃下提取过夜，离心，取上清液即是马缨丹提取液。
2.如权利要求1所述的水葫芦生物抑制剂，其特征在于所述表面活性剂可选自于吐温-20，Tinton X-100或十二烷基硫酸钠。
3.如权利要求1所述的水葫芦生物抑制剂的制备方法，其特征在于将马缨丹叶片于60-80℃烘干至恒重，制成干粉，取1-10重量份的马缨丹叶的干粉在100重量份水中于温度1-10℃下提取过夜，离心，取上清液即是马缨丹提取液，在该提取液中按权1的所述体积比加入甘油和1重量％浓度的表面活性剂，混匀，用醋酸调节pH为5.6-5.8即得液体抑制剂。
全文摘要
一种水葫芦生物抑制剂及其制备方法。该抑制剂是由马缨丹提取液，甘油和表面活性剂组成，取1－10重量份的马缨丹叶制成的干粉在100重量份水中于温度1－10℃下提取过夜，离心，取上清液即是马缨丹提取液。该抑制剂可直接喷洒在水葫芦叶面上使用，实验结果表明，它能有效地抑制水葫芦叶芽的生长，加速水葫芦叶片衰老死亡；降低叶片叶绿素的含量和超氧化物歧化酶的活性，对水葫芦的生长有明显的抑制作用，因此水葫芦生物抑制剂作为水葫芦的天然植物源除草剂具有很大的潜在的应用。
文档编号A01N65/08GK1586206SQ20041005299
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月20日 优先权日2004年7月20日
发明者郑慧琼, 王六发, 王慧 申请人:中国科学院上海生命科学研究院