专利名称：简便高效的农杆菌介导玉米转基因方法
技术领域：
本发明涉及玉米转基因的方法。
背景技术：
应用转基因技术将目的基因导入合适受体获得稳定的转基因植株是转基因的重要环节。在玉米转基因研究上，已开拓建立了多种转基因技术，包括基因枪法、PEG法、电击法、超声波介导法、花粉管通道法等，分别适应于不同的受体，并取得了一定成效，但这些技术在组织培养、受体选择、转化效率等不同方面存在各种不同的缺陷，为实验操作带来了诸多不便。
众所周知，组织培养工作量较大，需要大量的专业人员从事繁重的工作。传统农杆菌方法就是建立在组织培养基础上的，并且在组织培养转化过程中细胞脱分化和再分化中产生的体细胞变异以及转基因株的育性降低或丧失，会干扰转基因植株的分析及利用。基因枪法虽然具备受体类型广泛、基因枪转化无宿主限制等优点，但不可避免要经过组织培养过程。同时，玉米的组织培养、愈伤分化较水稻、小麦等植物困难，玉米组织培养受基因型的限制较大，受体范围较小，所以，以组织培养为基础的农杆菌介导法、基因枪法、超声波及电击法在玉米上的应用受到了很大限制，而花粉管通道法虽然可避免组织培养过程而直接获得转化种子，但转化效率低，因此，建立和开拓一种新的不需要经过组织培养的简便高效的玉米转基因技术迫在眉睫。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的问题提供一种简便高效的农杆菌介导玉米转基因方法。
本发明方法的特点是利用含有外源基因的农杆菌菌液感染玉米雌幼穗花丝进行玉米原位转化，先损伤花丝和雌幼穗，并用含有目的基因的农杆菌菌液涂抹或滴注以感染损伤部位，然后进行授粉，感染，反复处理3-4次，通过对当代种子的抗性筛选和分子检测，获得转基因植株。
本发明方法在技术上的优点如下1、本发明农杆菌介导在玉米上实现原位转化，将农杆菌感染花丝和雌幼穗，通过授精，直接实现转化，这样就有效地避免了组织培养和植株再生的繁杂过程，又可借助农杆菌介导外源基因进入配子细胞或合子胚细胞，以实现外源基因在受体细胞基因组的整合，从而简便快捷地实现转基因，且转化的后代可直接成株。
2、在受体选择上，本发明适合各种玉米品种，操作过程中不存在基因型差异，可以方便广大科研工作者从事玉米转基因研究，同时，本发明仅需要常规仪器和常规试剂即可完成，操作简便。
3、在转化效率上，玉米为穗状花序，雌穗花丝易于受粉，一次授粉即可实现整穗受粉，不象自花授粉的水稻、小麦农杆菌感染那样，需每朵小花分别操作，工作量大，玉米每个果穗结实通常可以达200粒以上种子，通过原位转化可以获得大量的种子，即使转化效率稍低，但通过对当代种子的抗性筛选和分子检测，即可获得有效的转基因植株。因此，本发明方法在玉米上更具有独特的应用价值。
具体实施例方式本实施例方法的工艺流程如下外源基因→Ti质粒表达载体构建→农杆菌转化液制备→原位转化→转化体的筛选→转化体的鉴定→转基因植株。
具体实施步骤如下1、目的基因的确定和载体构建。
选定相关的目的基因，利用pCAMBIA1300或者pBI121等Ti质粒构建玉米表达载体。
2、农杆菌转化液的制备。
通过三亲杂交的方法或者直接转化法将表达载体导入农杆菌感受态细胞中，获得转化的农杆菌菌株。
(1)三亲杂交方法，各取培养好的三种菌液根癌农杆菌LBA4404、大肠杆菌HB101(pRK2013)、大肠杆菌DH5α(构建的载体表达质粒)各500ul混合入1.5mldorf管中，室温5000rpm离心10min，收集菌体，用LB培养基洗涤2次，再离心，收集菌体，重新悬于100ulLB中。转移到放有纤维素酯的微孔滤膜(孔径为0.45um)的LB平板上，28℃培养过夜。取一接种环混合培养物，悬浮于100ulLB中，稀释100倍，取各稀释液100ul涂布于含有Rifr、Strr、Kmr的LB平板上，28℃培养2天。与此同时，把三种菌液分别涂布在含3种抗性的平板上，作为对照。
(2)农杆菌转化菌液的制备，挑选一个经三亲交配的土壤根癌农杆菌单菌落，接种于含链霉素(Str)25ug/ml，利福平(Rif)50ug/ml和卡那霉素(Kan)50ug/ml的5mlLB液体培养基中，28℃下200r/min振荡培养28h，至细菌处于对数生长时期(OD600＝0.8～1.0)，室温5000rpm离心10min。弃上清，沉淀的菌体用含150umol/L AS的MR液体培养基中，该液体培养基含1/5MS大量元素+MS其它成分+2，4-D1mg/L+10mmol/L果糖+10mmol/L葡萄糖+30g/L蔗糖，pH5.3，继续振荡培养2h，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化工程菌液。
3、农杆菌原位转化 当玉米花丝长到2厘米时，下午5点到7点之间用剪刀把花丝贴近包叶剪平，用利器穿透苞叶，刺伤幼穗，然后用消毒过的棉花蘸2ml制备好的菌液均匀涂抹花丝，同时外面套上隔离袋，防止混杂，然后次日上午9点至11点之间进行授粉，下午5点至7点再进行一次重复涂抹菌液，次日再进行授粉一到两次。反复处理3-4次。
3、转化体筛选 收获成熟种子，通过潮霉素或除草剂抗性选择标记进行筛选，例如我们采用了潮霉素选择标记，首先对未转化玉米植株进行抗性实验，确定玉米耐受潮霉素的临界浓度，我们筛选得到玉米整粒种子潮霉素抗性筛选浓度为55mg/L。我们利用无菌水进行转化种子浸种6小时，置于含55mg/L潮霉素MS培养基上发芽和抗性筛选，经筛选，15000粒原位转化，当代(T1代)种子的抗潮霉素频率为8.6‰。
5、转化体的鉴定 利用潮霉素基因设计PCR引物，对抗性株的叶片进行PCR检测，以明确外源潮霉素基因是否存在于抗性株的细胞内。同时可以利用Southern杂交进行转化体的鉴定，从而筛选出玉米转基因株。本研究结果显示原位T1代转化株PCR阳性率达3.6‰。证明该方法是一种简便高效的玉米转基因方法。
权利要求
1.简便高效的农杆菌介导玉米转基因方法，其特征是利用含有外源基因的农杆菌菌液感染玉米雌幼穗花丝进行玉米原位转化，所述玉米原位转化是先损伤花丝和雌幼穗，并用含有目的基因的农杆菌菌液涂抹或滴注以感染损伤部位，然后进行授粉，感染，反复处理3-4次，通过对当代种子的抗性筛选和分子检测，获得转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述玉米原位转化是当玉米花丝长到2厘米时，下午5点到7点之间用剪刀把花丝贴近包叶剪平，用利器穿透苞叶，刺伤幼穗，然后用消毒过的棉花蘸2ml制备好的菌液均匀涂抹花丝，同时外面套上隔离袋，防止混杂，然后次日上午9点至11点之间进行授粉，下午5点至7点再进行一次重复涂抹菌液，次日再进行授粉一到两次，反复处理3-4次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述抗性筛选是对所收获的成熟种子，通过潮霉素或除草剂抗性选择标记进行筛选。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述转化体的鉴定是利用潮霉素基因设计PCR引物，对抗性株的叶片进行PCR检测，以明确外源潮霉素基因是否存在于抗性株的细胞内；同时利用Southern杂交进行转化体的鉴定，筛选出玉米转基因株。
全文摘要
简便高效的农杆菌介导玉米转基因方法，其特征是利用含有外源基因的农杆菌菌液感染玉米雌幼穗花丝进行玉米原位转化，所述玉米原位转化是先损伤花丝和雌幼穗，并用含有目的基因的农杆菌菌液涂抹或滴注以感染损伤部位，然后进行授粉，感染，反复处理3－4次，通过对当代种子的抗性筛选和分子检测，获得转基因植株。本发明方法避免了组织培养和植株再生的繁杂过程，简便快捷，转化的后代可直接成株。
文档编号A01H1/00GK1602672SQ20041006561
公开日2005年4月6日 申请日期2004年11月8日 优先权日2004年11月8日
发明者程备久, 朱苏文, 项艳, 张永风, 王洲, 谈应权, 马庆, 韩国民, 叶辉, 程郢 申请人:安徽农业大学