专利名称：一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法
技术领域：
本发明属农业生物技术领域和植物基因工程领域；主要涉及农杆菌介导的小麦苗端转化方法及其应用。
背景技术：
自从1984年首次获得转基因烟草(Leone A et al，1991)以来，植物转基因技术日益得到广泛的应用，它对分子遗传学研究和植物的改良都有特别重要的意义。
植物基因的转化方法主要包括直接的基因转移(Sato T et al，1992)和农杆菌介导的转化(Finlay C A et al，1989)。直接的基因转移主要包括PEG介导的转移、电激介导的基因转移以及基因枪(Wates M M et al，1995)转化。这些转化都有成功的例证，但也有共同的、明显的缺点一是原生质体的培养、再生受基因型限制；二是原生质体再生过程常常会产生变异，转化植株出现很高比例的不育株和白化苗。基因枪转化法避开了原生质体再生培养的困难和克服了当时所认为的农杆菌宿主的限制。在问世后即获得了广泛的应用。可适用于不同的物种以及同一种物种的不同品种。用这种方法转化成功的植物包括几乎所有的主要禾谷类作物，如小麦、玉米、水稻、大麦、高梁等等。但是，基因枪转化方法也有明显的缺点，转化效率绝大多数在0.1％-1％的范围内，需要昂贵的仪器。
农杆菌Ti质粒介导的基因转移具有操作简单、成本低、整合位点较稳定、拷贝数低、转化效率高、整合后外源基因结构变异较小等优点。该方法自1983年创建以来，在双子叶植物遗传转化中得到广泛应用。虽然单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，但后来随着对农杆菌转化植物细胞原理的深入认识，通过添加外源信号物质如乙酰丁香酮(AS)及其衍生物等也可以实现农杆菌对单子叶植物的转化。近年来在玉米(Grimsley et al，1987，Yuji et al，1996)、水稻(Chan et al，1993，Hiei et al.1994，1997)、大麦(Tingayet al.1997，Wu et al.1998，1999)、圆葱(Eady et al，1996)和小麦等(Cheng etal.1997；Xia et al.1999；Weir et al.2003；Wu et al.2004；Xue et al.2004)都有农杆菌转化成功的报道。
虽然人们已经实现了农杆菌转化小麦的突破，但由于小麦离体培养具有很强的惰性，再生频率低，受基因型的影响大，而且组织培养过程中易发生体细胞无性系变异等原因，使得通过农杆菌介导的愈伤组织转化法得到转基因小麦仍然受到很大的限制。急需发展新的转化方法。Woolston(1988)，Dale(1989)，Marks(1990)，Chen和Dale(1992)，Mahalakshmi和Khurana(1995)等虽然都采用1到4天幼苗叶基、干种子生长点做为农杆菌的感染的外植体，在体外实现了农杆菌的高效感染，但所采用的目的基因为大麦黄矮病毒完整序列，所感染的少数小麦体细胞可以合成完整的大麦黄矮病毒颗粒，进一步再感染其它未被农杆菌感染的小麦细胞，目的基因并不一定整合到小麦基因组，而出现瞬时表达现象，农杆菌的真实转化率可能被过高估计，在他们的文章中均无后代转基因的分子生物证据似乎也能说这一问题。但可以肯定的是小麦幼苗生长点细胞在人工创造伤口时可被农杆菌感染。
发明内容
针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一种改良的通过农杆菌介导的小麦苗端转化方法，以获得高频率的转基因植株，进行小麦的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及幼胚和愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，不需要进行无菌操作，整个工作周期短，受季节的限制小，可以在较短的时间内获得转基因植株，可以在一定程度上克服基因型的限制。
本发明建立一种改良的农杆菌介导的小麦苗端转化方法包括如下步骤(1)种子的消毒、萌发与春化，(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬，(3)苗端转化，(4)转化植株的移栽土培、抗性筛选，(5)转基因植株及子代植株的鉴定，(6)小苗生根和移栽技术。
本发明中，种子的消毒与萌发是指小麦种子置于灭菌的烧杯中，75％乙醇浸泡30s；无菌水冲洗3次，5min/次；0.1％升汞浸泡10min；无菌水冲洗5次，5min/次；将种子整齐摆放于铺有滤纸的无菌培养皿中，滤纸用无菌水润湿，所用种子均为背面朝上，胚朝向同一个方向；室温下黑暗培养2-3天，于4℃春化处理20-30天，当胚芽鞘长至一定长度(2cm～4cm)后即可用于转化。
本发明中，含有目的基因农杆菌的活化与重悬是指挑取YEP培养基玻璃平板上带有双元载体(Mini-Ti质粒，带有目的基因和/或选择标记基因)或共整合载体(T-DNA区含有目的基因和/或选择标记基因)的根癌农杆菌(如AGL1、EHA105)单菌落，接种于含附加抗生素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养，经2-3次活化，当菌液OD600＝1.2时，4℃、5000rpm离心3min收集菌体，去上清，用适量200μM的乙酰丁香酮溶液重悬菌体至OD600＝0.6，加入0.02％的表面活性剂L77，即可用于转化。
本发明中，苗端转化是指用洁净刀片沿胚根向胚芽鞘伸长的方向45度角向下切断维管束，然后刀片转为水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或损伤生长点部位，刀片顺势延伸，在叶片距生长点1cm-2cm处切断整个胚芽鞘，留下1cm-2cm幼叶，用于光合作用，维持植株生长，整个过程无需在无菌条件下操作。将重悬的菌液滴至切口处，每棵4μl，然后将幼苗置于洁净培养皿中正常光照下恢复生长。
本发明中，转化植株的移栽土培、抗性筛选是指待幼苗恢复生长后移栽至花盆中进行土培，进行正常的管理。长出3-4片新叶时，喷洒适宜浓度的选择剂或进行其它方式的筛选。未转化的植株由于缺乏对筛选的抵抗能力，在以后的生长中会逐渐死亡。而转基因植株具有对筛选的抗性，在筛选后仍然能够存活和生长。通过筛选，大部分的非转化植株最终都会死亡，这样留存下来的转化植株绝大部分都是转基因阳性植株。在适宜的生长条件下，转基因植株就会正常的发育结实。
本发明中，转基因植株及子代植株的鉴定是指采用合适的方法(如CTAB法)提取转化植株叶片的DNA，利用PCR技术对目的基因进行检测，然后用Southern Blotting的方法对PCR阳性的植株再次进行鉴定，最终确定转基因阳性植株。同时进行Northern，Western及其它方式的鉴定。结果详见附图及实施例。
利用本发明中的一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法可以简单、快速、高效地获得转基因植株，排除体细胞无性系变异对转基因植株的影响，克服基因型对农杆菌转化的限制，是小麦遗传转化的一种实用方法。
图1质粒pBLGC的T-DNA区域。
图2转基因植株烟2801和杂种11号T0的β-1，3葡聚糖酶基因的PCR及PCR-Southern分析(探针为随机引物标记的β-1，3葡聚糖酶基因扩增片段和λDNA/HindIII+EcoR I)M分子量标准λDNA/HindIII+EcoR I；+质粒DNA扩增片段(1.1kb)；9，15转基因植株；C11非转基因植株杂种11号。
图3转基因植株烟2801和杂种11T1代β-1，3葡聚糖酶基因的PCR及PCR-Southern分析(探针为随机引物标记的β-1，3葡聚糖酶基因扩增片段和λDNA/HindIII+EcoRI)M分子量标准λDNA/Hind III+EcoRI；+质粒DNA扩增片段(1.322kb)；2，7，9，10，11，12，13转基因阳性植株；C11非转基因植株杂种11号。图4转基因植株烟2801和T0代(A)和T1(B)β-1，3葡聚糖酶基因的Southern分析。Fig.4 Southern hybridization of the T0(A)and T1(B)transgenic Yan2801 wheat24 and 36Two individuals of T0transgenic plants.PpBLGC digested with EcoRIand SalI.34-2 and 34-3Two individuals from No.34A T0transgenic plant.MMolecular weight marker(DNA/HindIII-EcoRI)。
图5转基因植株烟2801 34(2)-10(A)和未转基因的烟2801对照植株(B)对白粉病的不同敏感性。
图6烟2801转基因植株和未转基因的烟2801对照植株T2代的Northern杂交分析ANorthern blotting结果.B分析植株的rRNA.6，9，1034-2-6，34-2-9，34-2-10。
图7 1-7号重组质粒pBI-abmlo基因插入方向的鉴定MMarker，1pBI 121的BamH I酶切，2-8重组质粒pBI-abmlo的BamHI、Sal I双酶切。
图8 pBI-abmlo DNA质粒T-DNA区示意图LB、RB为T-DNA左右边际序列，Pnos、Tnos为nos基因的启动子和终止子，35S为35S启动子，mlo为大麦mlo反义基因，gus为大肠杆菌葡萄糖苷酸酶基因。
图9转基因植株T1代的Mlo基因的PCR及PCR-Southern分析(探针同图3)M分子量标准λDNA/HindIII+EcoR I；+质粒DNA扩增片段(1.322kb)；1，2，5，6，7，8，11，12，13IIIY2-19后代中的转基因阳性植株。
图10转大麦Mlo基因植株的基因组Southern杂交分析M分子量标准λDNA/Hind III、EcoR I；+HindIIII、EcoRI双酶切的阳性质粒；(a)烟优361T0代1，19，42转基因植株；C11非转基因对照烟优361(b)体细胞杂种11号T0代3，5转基因植株；Y3非转基因对照体细胞杂种11号(c)烟优2801T1代11-1，11-2IIIY2-11的两个后代；19-7，19-8IIIY2-19的两个后代；Y2非转基因对照烟优2801。
图11烟2801转基因株系IIIY2-11的F2代(A)和未转基因的对照(B)对白粉病的不同敏感性。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明
实例1农杆菌介导的β-1，3葡聚糖酶-几丁质酶基因苗端转化小麦获得抗白粉病转基因后代1、苗端转化将农杆菌菌株(EHA105农杆菌菌株，其中所含β-1，3葡聚糖酶-几丁质酶基因的植物双价表达载体，图1)接种到20mL含有50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的YEP液体培养基中，于28℃、170r/min振荡培养至OD值1.2左右，10000r/min离心3分钟，弃上清液。用加有100μmol/L AS的MB2(Xue et al.，2004)液体培养基重悬菌体，稀释至OD值0.6左右。
小麦种子经升汞表面消毒后室温萌发2-3天，于4℃春化处理30天，幼苗长到2-4cm后，用洁净刀片沿胚根向胚芽鞘伸长的方向45度角向下切断维管束，然后刀片转为水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或损伤生长点部位，刀片顺势延伸，在叶片距生长点1cm-2cm处切断整个胚芽鞘，留下1cm-2cm幼叶，用于光合作用，维持植株生长；用tip从切口处滴加带有目的基因的农杆菌菌液，在弱光潮湿条件下20℃左右恢复生长5-6天，新叶片长出后移栽正常管理。
2、转基因植株的PCR分析用CTAB法提取转基因植株及对照小麦的基因组总DNA，β-1，3葡聚糖酶基因的PCR检测引物为P1 GCGGATCCGACCATGGCTGCTATCACACTC，P2CGGTCGACCTCACATCTCACTTACGAGA，扩增片段长度为1.1kb。20μl PCR扩增反应体系包含1U Taq酶，两种引物各250ng，250μM的dNTP。程序为94℃预变性3min，94℃1min，60℃ 2min，72℃ 2min循环35次，72℃延伸7min。PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色并照相。
3、转基因植株的PCR-Shouthern及总基因组Southern杂交取阳性植株PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶80V稳压电泳1-2h后，按分子克隆中的方法(molecular cloning)将DNA转移至尼龙膜上，以Pharmacia公司的Random primelabeling and detection system kit实验程序，进行β-1，3葡聚糖酶基因的特异扩增片段的标记、杂交、洗涤、封闭、结合抗体、曝光显影。
总基因组Southern杂交取阳性质粒DNA 0.1μg，转基因及阴性对照小麦的基因组DNA 30μg，经限制性内切酶Sal I+EcoRI酶切后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，于4℃ 15V稳压电泳16-18h，按以上方法进行探针标记和杂交。
4、转基因植株的白粉病抗性选取转基因植株的后代种子在温室及田间种植，用未转基因的植株间隔做对照。对以上植株作白粉病接种，并在苗圃的中央用高感白粉病的品种Huixianhong做白粉病的诱发区，按病斑的多少计反应型。抗感标准分为4级，0级为免疫；1级为高抗，基部叶有1-3处病斑；2级为中抗，中部叶有少量病斑；3、4级为中、高感，上部叶及穗部有较多及大量的病斑。
5、抗白粉病转基因植株的Northern杂交分别取34(2)-1的10个单株，在幼苗期按Xue et al.(2004)的方法分离其总RNA，按1.3.2的方法进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离，Northern blot印迹转移到尼龙膜上，与P32随机标记的葡聚糖基因杂交，洗涤、显影、曝光。
结果利用农杆菌介导的苗端转化，分别对三种基因型的小麦(烟2801、烟361和体细胞杂种11号)，进行几丁质酶-β-1，3葡聚糖酶双价基因的转化。待转化的种子首先进行低温春化处理，当胚芽鞘长2～4cm时切去胚芽鞘及一半的子叶进行农杆菌对生长点的转化处理(图2)。通过PCR和Southern blot检测验证(图3)共获得27株T0代阳性植株，其平均转化率为9.82％。T1代部分阳性植株的检测结果发生明显的分离(图4)。对T2代白粉病抗性的调查结果表明，部分阳性转基因植株比对照的抗性提高2-3级(图6)。Northern杂交证明(图5)，抗性植株的β-1，3葡聚糖酶基因可正常转录。以上结果表明，目的基因己整合到小麦基因组中并可在其后代遗传和表达。
实例2农杆菌介导的大麦Mlo反义基因转化小麦获得抗白粉病后代1、大麦Mlo基因的分离1.1、幼苗RNA的提取取常温光照培养七日大麦幼苗材料20g，采用Pietro et al(2002)报道的一步法提取总RNA。
1.2、RT-PCR取2ug大麦总RNA，用大连宝生物公司的RNA PCR Kit(AMV)Ver2.1试剂盒，按厂商要求进行反转录和PCR反应，PCR引物根据报道的MLO基因序列设计(Buschgas et al.1997)。引物IGTGCATCTGCGTGTGCGTA；引物IICAGAAACTTGTCTCATCCCTG1.3、PCR产物的克隆pBSKS(一)质粒DNA经EcoRV酶切后，参考Woolston，C.J et al(1988)报道的方法制备T-载体。mlo-PCR产物与T-载体16℃连接(2.8∶1)，转化DH5a，篮白斑筛选重组子，利用EcoR I和Hind III酶切确定是否为重组子。
1.4、重组子的测序及插入片段方向的签定.
重组子克隆中的mlo片段由大连宝生物公司进行双向测序，根据其序列与已发表的序列(Buschgas et al.1997)对比，经Pst I和Sal I酶切确定其插入方向(图7)。
2、大麦mlo反义表达载体的构建2.1、mlo基因片段的分离及末端补平pBS-mlo质粒经EcoRI和HindIII双酶切，电泳分离切取1.7kb的mlo片段，用MBI公司的DNA凝胶回收试剂盒，按厂方说明回收DNA，利用宝生物公司DNA平末端连接试剂盒，按厂商说明补平其DNA末端。
2.2、pBI121.2质粒载体的制备pBI121.2质粒DNA经Sma I完全酶切后，用CIAP脱磷，回收DNA。.
2.3、连接及重组子筛选.
mlo基因片段与pBI121.2载体DNA以1∶1摩尔比在16℃连接12小时，转化新制备的感受态DH10B，涂Kan平板筛选转化子。将平板上的菌落依次用牙签点到两个Kan平板上，生长过夜后，将其中一个进行菌落原位杂交，转尼龙膜，另一个4℃保存，利用ECl试剂盒标记mlo基因片段，与转移好并经变性，洗涤固定后的尼龙膜杂交，常规曝光，冲洗x光片。方法参见Amersham-Phamarcia，(UK)的使用手册。
选取7个强阳性克隆，提取其质粒DNA，经BamHI和SalI双酶切签定，然后转进农杆菌。
3、小麦农杆菌介导转化3.1、苗端转化法将以上农杆菌菌株接种到20mL含有50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的YEP液体培养基中，于28℃、170r/min振荡培养12-24h，10000r/min离心3分钟，弃上清液。用加有100μmol/L AS的MB2(Xue et al.，2004)液体培养基重悬菌体，稀释至OD值1.0左右。
小麦种子体细胞杂种11号，烟优2801和烟优361经升汞表面消毒后室温萌发2-3天，于4℃春化处理30天，幼苗长到2-5cm后用洁净刀片沿胚根向胚芽鞘伸长的方向45度角向下切断维管束，然后刀片转为水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或损伤生长点部位，刀片顺势延伸，在叶片距生长点1cm-2cm处切断整个胚芽鞘，留下1cm-2cm幼叶，用于光合作用，维持植株生长，切去胚的上半部分及一半的子叶，露出并且损伤生长点，用tip从切口处滴加带有目的基因的农杆菌菌液，在弱光潮湿条件下20℃左右恢复生长5-6天，新叶片长出后移栽正常管理。
3.2、转基因植株的PCR分析检测大麦Mlo基因的PCR引物为上游引物5‘TATCCCTGCTCCTCATCGT3’；下游引物5‘CGGACCTCCTCCTGTCGTTA3’，扩增片段长度为1.32kb.。PCR扩增体系为20μl，反应体系包含1uTaq酶，两种引物各250ng，250μM的dNTP。具体反应程序为94℃预变性3min，94℃ 1min，56.7℃ 2min，72℃ 2min循环35次，72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色并照相。
3.3、转基因植株的基因组Southern杂交阳性质粒DNA 0.1μg，转基因及阴性对照小麦的基因组DNA 30μg，经限制性内切酶HindIII+EcoRI双酶切后，4℃经0.8％的琼脂糖凝胶分离，15V稳压电泳16-18h，进行Southern blot，将DNA转移到尼龙膜上，以Pharmacia公司的Random prime labelingand detection system kit实验程序，进行大麦Mlo基因的特异扩增片段的标记、杂交、洗涤、封闭、结合抗体、曝光显影。
3.4、转基因植株的抗病性分析选取转基因植株的后代种子在温室及田间种植，用未转基因的植株间隔做对照。对以上植株作白粉病接种，并在苗圃的中央用高感白粉病的品种辉县红做白粉病的诱发区，按病斑的多少计反应型。抗感标准分为4级，0级为免疫；1级为高抗，基部叶有1-3处病斑；2级为中抗，中部叶有少量病斑；3、4级为中、高感，部叶及穗部有较多及大量的病斑，按植株发病情况统计反应级数。
表1T0代转基因植株的白粉病抗性分析体细胞杂种11号 烟优2801 烟优361对照植株 阳性转基对照植株 阳性转基 对照植株阳性转基因植株因植株 因植株反应级数 4.10 3.512.761.20 2.50 1.73结果 利用RT-PCR技术从大麦斯特林幼叶总RNA中分离到MLO基因cDNA完整编码区，反向连接到植物双元载体(pBI 121.2)35S启动子下游(图8)，通过农杆菌介导的苗端转化法获得三种基因型(烟优2801和烟优361、小麦与高冰草体细胞杂种11号)的转基因小麦。通过对T0、T1代植株大麦Mlo基因的PCR(见图3)，PCR-Southern blot(见图9)，Southern blot检测(见图10)，525个T0植株中有72株PCR、PCR-Southern blot阳性，转化率达到13.71％，Southern blot杂交可以证明大麦MLO基因片段已整合到小麦基因组中(见图10)。对部分T1代阳性植株的检测表明目的基因可单考贝整合到小麦基因组中(见图10)。三种基因型的小麦都获得了转基因植株，并已经遗传至T2代。温室及大田的白粉病抗性调查结果表明，转基因植株比其对照具有更强的抗性(见表1，图11)。
权利要求
1.一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法，包含种子的消毒、萌发与春化；含有目的基因农杆菌的活化与重悬；苗端转化；幼苗的恢复生长以及移至土中栽培获得该转基因植株的子代；鉴定转基因植株及分析子代的遗传特性；其特征在于1)、种子的消毒、萌发及低温处理；2)、幼苗长到适宜阶段后经切割，暴露或损伤生长点部位；3)、将含有目的基因的农杆菌菌液滴至幼苗切口处；上述消毒的种子萌发后进行低温处理，是指小麦种子在黑暗下培养2-3天、4℃春化20-30天。幼苗长到适宜阶段后经切割，暴露或损伤生长点部位是指对2cm～4cm长的幼苗用洁净刀片沿胚根向胚芽鞘伸长方向45度角向下切断维管束，然后刀片转为水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或损伤生长点部位，刀片顺势延伸，在叶片距生长点部位1cm-2cm处切断整个胚芽鞘，留下幼叶基部，用于光合作用，维持植株生长，整个过程无需在无菌条件下操作；含有目的基因农杆菌的活化与重悬是指挑取YEP培养基玻璃平板上带有双元载体即Mini-Ti质粒——带有目的基因和/或选择标记基因或共整合载体即T-DNA区含有目的基因和/或选择标记基因的根癌农杆菌单菌落，接种于含附加抗生素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养，经2-3次活化，当菌液OD600＝1.2时，4℃、5000rpm离心3min收集菌体，去上清，用100～200μM的乙酰丁香酮溶液(acetosyringone，AS)重悬菌体至OD600＝0.6，加入质量百分比为0.02％的表面活性剂L77，即可用于转化；将重悬的菌液滴至幼苗切口处，每株4μl，然后将幼苗置于洁净培养皿中正常光照下恢复生长。
2.如权利要求1所述的一种改良的农杆菌介导的小麦苗端转化方法，其特征在于所述的小麦材料为经4℃处理25天；所述的切割是指切去胚芽及胚的上半部分，留下1cm-2cm幼叶；所述的露出或损伤生长点部位是指在解剖镜下能够清晰地观察到被部分叶原基包围的生长锥或裸露及损伤的生长锥；所述根癌农杆菌是带有目的基因的AGL1和EHA105菌株。
全文摘要
本发明公开一种改良的农杆菌介导的小麦苗端转化方法，主要步骤包括1)种子萌发后在4℃春化20－30天；2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；3)对适宜大小的幼苗进行切割，暴露或损伤生长点部位；4)将含有目的基因的农杆菌菌液滴至幼苗切口处；5)幼苗恢复生长以及移至土中栽培和抗生素筛选获得转基因植株及子代；6)转基因植株及子代的鉴定。本发明中的方法无需无菌操作，可以简单、快速、高效地获得转基因植株，排除体细胞无性系变异对转基因植株的影响，克服基因型对农杆菌转化的限制，对于小麦基因功能的验证及基因工程育种具有重要的作用及广阔的应用前景。
文档编号A01H1/00GK1633839SQ20041007577
公开日2005年7月6日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者夏光敏, 陈惠民, 赵双宜, 赵庆臻, 刘恒, 赵同金 申请人:山东大学