专利名称：一种快速聚合优良基因的水稻育种方法
技术领域：
本发明涉及分子细胞育种领域，具体是涉及一种快速聚合优良基因的水稻育种方法。
背景技术：
水稻是世界最重要的粮食作物之一，也是我国50％以上人口的主食，因而提高水稻的生产水平对于保证我国的粮食安全和国民经济的稳步发展具有十分重要的意义。近年来，随着工业的发展和人民生活水平的提高，使得我国人多地少的矛盾日益突出。据估计，到2010和2030年，我国水稻单产水平必须在1995年的基础上，分别提高16％和33％才能满足人民生活需求。但经过矮化育种和杂种优势利用两次大的突破后，目前世界水稻产量已达较高水平，通过常规育种方法提高水稻产量难度加大。同时，随着人民生活水平的提高和环保意识加强，对水稻的品质和安全性提出更高要求，因而培育高产多抗优质的水稻新品种(组合)就成为当前水稻育种的迫切需要。
由于每个水稻材料所携带的优良基因比较有限且或多或少地存在一些不足，因而将不同材料的两个(或两个以上)优良基因组合到一个材料中，使其具有双亲的优良基因，这就是水稻聚合育种并已成为水稻育种的重要内容。目前人们主要通过常规杂交、分子标记辅助选择和转基因三条途径来实现优良基因的聚合，但由于通过常规杂交进行基因聚合存在育种周期长，工作量大的难题，而分子聚合育种和转基因方法虽然可以减小育种工作量，但也存在费用高等问题难以被一般育种工作者所掌握。
光合作用是作物高产的生理基础，据估计，作物干物质的90％来源于光合作用，因而改善和提高作物的光合能力，就有可能促进作物产量水平的提高。自然界存在C3植物(水稻和小麦)和C4植物(如玉米和高粱)，二者具有不同的光合作用的途径C3循环和C4循环。由于C4植物具有CO2泵作用，在高温、高光及干旱条件下较C3植物有高的光合效率。将C4植物的高光效特性转移到C3植物中以提高C3植物光合效率一直是育种家和生理学家关注的热点。但因C4植物和C3植物杂交属远源杂交，这一研究多年来一直未有大的突破。1999年，美国学者古森本将C4植物玉米的光合作用关键酶PEPC基因转入水稻中，并获得高效表达，转基因水稻的PEPC酶活性可达对照的20-40倍。通过国际合作，我国学者焦德茂引入了转PEPC基因水稻，进一步的研究表明，转PEPC基因水稻的光合效率和抗逆性和产量均较对照有较大幅度提高。同时通过常规育种和花药培养相结合，获得了一些高光合效率新株系，这些研究表明，将玉米的PEPC基因导入到水稻中可以提高其光合效率并培育出高产水稻新品种。
白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)是世界水稻生产中最严重的细菌性病害，在我国各稻区都有发生，尤以华中、华东和华南稻区发病严重，对水稻生产带来极大威胁。为了防治该病，每年都要施用大量农药，不仅污染了环境增加了农民的成本，而且影响了稻米的品质，过多的施用农药还可能使稻米中农药残留量超标，影响人们的身体健康。在植物组织培养中常会发生一些变异，即体细胞无性系变异，目前该技术已广泛应用于植物遗传改良中，在水稻中目前已获得了抗稻瘟病、抗纹枯病、抗胡麻叶斑病等细胞突变体。利用无性系变异技术，我们从高感水稻白叶枯病的杂交稻恢复系明恢63中获得了抗病细胞突变体HX-3，经多年研究从HX-3中鉴定出一个水稻抗白叶枯病基因Xa-25，该基因对我国水稻白叶枯病的主要代表菌株具有较好抗性，可广泛应用于培育抗白叶枯病水稻新品种。
发明内容
为了克服现有水稻聚合育种方法的不足，本发明提供了一种快速简便、花费少的快速高效的聚合水稻优良基因的育种新方法，该方法将常规杂交、花药培养、生理测定有机结合，从而较好克服了常规方法育种周期长，分子标记辅助和转基因育种的费用高等难题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种快速聚合优良基因的水稻育种方法，其特征在于将两个分别具有不同优良基因的水稻材料杂交，获得F1杂种；对F1杂种进行花药培养，得到稳定的花培株系；对稳定花培株系进行性状筛选，获得聚合了优良基因的水稻材料。
作为本发明的一个具体例子，是应用本育种方法快速聚合玉米PEPC基因和水稻抗白叶枯病基因Xa-25，具体是将两个分别具有玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa-25的水稻材料杂交，获得F1杂种；对F1杂种进行花药培养，得到稳定的花培株系；对稳定花培株系进行性状筛选获得聚合了玉米PEPC基因和水稻抗白叶枯病基因Xa-25的水稻材料。
所说的性状筛选是采用抗性鉴定、酶活性检测、生理测定等方法，选择出同时具备两种优良性状的株系。在聚合玉米PEPC基因和水稻抗白叶枯病基因Xa-25的育种过程中，性状筛选具体是指通过抗白叶枯病鉴定和PEPC活性测定，选出抗白叶枯病且PEPC活性大于或等于100μmol/mg-1h-1的花培株系；而且，在对高光合效率性状筛选时，还可以PEPC活性测定的基础上分别或同时辅以光合速率测定、PCR测定。
本发明中所说的优良基因，育种者可以根据育种要求来确定，不限于上述提到的玉米PEPC基因、水稻抗白叶枯病基因Xa-25；只要确定了具体的优良基因，那么本领域普通技术人员就能依据现有技术的方法和操作对该优良基因进行性状筛选。
本发明的有益效果是，克服了现有水稻聚合育种的不足，将常规杂交、花药培养、性状筛选有机结合(如图2、图3)，形成了一种快速聚合优良基因的育种新方法，运用本育种方法，能够在两年内获得稳定的聚合株系，周期短、成本低，这比其它方法更适合我国水稻育种的实践需要。
图1是HPTER、HX-3和花药培养株系PCR扩增电泳图；其中M为标准分子量，1为HPTER，2为HX-3，3-12为HPTER和HX-3花药培养株系，4、5、6、12分别为XP-4、XP-11、XP-17和XP-27。
图2是快速聚合优良基因的水稻育种流程示意图；图3是快速聚合玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa-25的水稻育种流程示意图。
具体实施例方式
1.水稻稳定花药培养株系的获得2003年3月在海南陵水以高光效但高感白叶枯病的水稻HPTER(下简称HPTER)为母本(具有玉米PEPC基因)，以抗病但不具有高光效特性的水稻(下简称HX-3)(具有抗白叶枯病基因Xa-25)为父本，获得F1杂种。2003年5月种植该F1杂种，并于8月份取HPTER和HX-3的F1杂种植株处于单核靠边期的花药进行培养(花药培养的配方为M8+2mg/L 2，4-D+1mg/L KT+3mg/L NAA+5％蔗糖+7g/L琼脂)，共计接种HPTER/HX-3 F1杂种花药3754枚，获得愈伤组织348块。将这些愈伤组织转到分化培养基上(配方为MS+2mg/L 6-BA+1mg/LKT+3％蔗糖+7g/L琼脂)，分化出绿苗67丛。2003年11月将所有绿苗移栽于海南陵水南繁基地种植。2004年按单株收获种子，共计获得42株水稻种子。2004年5月将这些种子按单株种植即成为一个株系，每个株系种植10株，在田间观察其稳定性发现，所有这些株系都是稳定的，没有出现分离。2.花药培养株系的抗病性鉴定2004年8月对HX-3、HPTER和42个株系进行白叶枯病抗性鉴定。以剪叶法接种我国水稻白叶枯病菌浙173。接种前将浙173冻干菌粉从-70℃取出，并于NA固体培养基上转接活化2次，每次培养48-72h，接种时配制成109cfu/ml菌液。于水稻生长的孕穗期对HX-3、HPTER及42个稳定株系进行抗性鉴定。在接菌后第21d进行抗性调查。以病斑长度作为抗性鉴定的评价指标，病斑长度大于6cm即为感病。HX-3表现为抗病(病斑长度为2.2cm)，HPTER表现为高度感病(病斑长度为10.0cm)，42个稳定花药培养株系中，18个株系表现抗病，24个株系表现感病。3.花培株系的PEPC活性和光合速率测定于2004年8月同时测定了HX-3、HPTER和42个株系的PEPC活性和光合速率。
PEPC活性测定方法为取水稻新鲜叶片0.5 g，用蒸馏水冲洗干净，滤纸擦干后用小剪刀剪成小块，置于预冷研钵中，加入含50 mMTris-HCl(pH 7.5)、1mM MgCl2、5mM DTT(二硫苏糖醇)和2％(w/v)PVP的提取液3 ml，冰上研磨，双层纱布过滤，滤液转入5 ml离心管，首先取40μl滤液加入到960μl无水乙醇中，分别在649nm和665nm下测定消光值，以计算叶绿素含量。其余滤液于4℃下，13000 rpm离心10 mim。取上清液50μl，加入蒸馏水495μl、0.2M Hepes-KOH(pH 8.0)250μl、0.2 M NaHCO350μl、0.1 M MgCl250μl、4mM NADH 50μl和300 units/ml MDH 5μl，混合均匀后加入40mM PEP 50μl，在340nm测定反应液消光值变化。
利用基因公司的LI-6400光合仪活体测定水稻的光合速率。所有待测水稻材料于8月下旬晴日上午11:00-12:00测定植株剑叶的光合速率。
HX-3的PEPC活性为63.6μmol/mg-1h-1，光合速率为27.1μmol CO2m-2s-1。而HPTER的PEPC活性为1337.1μmol/mg-1h-1，是常规水稻HX-3的20多倍，光合速率为37.5μmol CO2m-2s-1，比HX-3提高近30％，这说明转入玉米PEPC基因确实能够提高水稻的光合速率。42个稳定株系中有13个株系具有高PEPC活性(＞100μmol/mg-1h-1)，结合白叶枯病抗性鉴定结果，获得了7个抗病且具有高PEPC活性株系(见表1)，这些株系的PEPC活性为160-1197μmol/mg-1h-1，较常规水稻增加2-15倍，且光合速率增加20％以上。
表1水稻材料白叶枯病抗性调查和生理测定
4.聚合株系的分子鉴定经登陆Genebank，得到玉米PEPC基因的登陆号为X15239，其序列全长为6.6kb左右，利用其全基因序列，设计PCR引物(sense5-CACAGCAGCTTCTCCTCCA-3；antisense 5-GCCAGTTCGGCATTTCCAT-3)，对国外获得的转玉米PEPC基因水稻(HPTER)、HX-3和我们获得42个稳定株系进行PCR检测，HPTER和聚合株系均可扩增出清晰主带(约500bp)，但HX-3和低PEPC活性株系不能扩出清晰带型，因而从分子水平上进一步验证了生理测定的结果，高PEPC活性的株系确实存在玉米PEPC基因(见图1)。
权利要求
1.一种快速聚合优良基因的水稻育种方法，其特征在于a.将两个分别具有不同优良基因的水稻材料杂交，获得F1杂种；b.对F1杂种进行花药培养，得到稳定的花培株系；c.对稳定花培株系进行性状筛选，获得聚合了优良基因的水稻材料。
2.根据权利要求1所说的水稻育种方法，其特征在于a.将两个分别具有玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa-25的水稻材料杂交，获得F1杂种；b.对F1杂种进行花药培养，得到稳定的花培株系；c.对稳定花培株系进行性状筛选，获得聚合了玉米PEPC基因和水稻抗白叶枯病基因Xa-25的水稻材料。
3.根据权利要求2所说的水稻育种方法，其特征在于所说的性状筛选是指通过抗白叶枯病鉴定和PEPC活性测定，选出抗白叶枯病且PEPC活性大于或等于100μmol/mg-1h-1的花培株系。
4.根据权利要求2所说的水稻育种方法，其特征在于所说的性状筛选是指通过抗白叶枯病鉴定、PEPC活性测定、光合速率生理测定，选出抗白叶枯病且PEPC活性大于或等于100μmol/mg-1h-1的花培株系。
5.根据权利要求2、3或4所说的水稻育种方法，其特征在于所说的具有玉米PEPC基因的水稻材料是水稻品种HPTER，所说的具有抗白叶枯病基因Xa-25的水稻材料是水稻品种HX-3。
全文摘要
本发明涉及一种快速聚合优良基因的水稻育种方法。该方法是将两个分别具有不同优良基因的水稻材料杂交，获得F1杂种；对F1杂种进行花药培养，得到稳定的花培株系；对稳定花培株系进行性状筛选，获得聚合了优良基因的水稻材料。本发明将常规杂交、花药培养、性状筛选有机结合，形成了一种快速聚合优良基因的育种新方法，运用本育种方法，能够在两年内获得稳定的聚合株系，周期短、成本低，这比其它方法更适合我国水稻育种的实践需要。
文档编号A01G16/00GK1709035SQ200510040408
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者高东迎, 焦德茂, 郭士伟 申请人:江苏省农业科学院