专利名称：水稻的一种环状微小染色体及其获得方法
技术领域：
本发明涉及一种植物染色体及其获得方法，特别涉及水稻的一种环状微小染色体及其获得方法。
背景技术：
环状染色体(ring chromosome)是存在于动植物细胞内的形态和行为不同于常染色体的一类环形额外染色体。该类型染色体最早在玉米中被发现。环状染色体在结构组成与常规染色体不同，它只有着丝粒和复制起始原点两个重要元件，不存在端粒结构，由染色体的长短臂末端相连而形成环形结构。环状染色体的产生被认为是由于细胞在进行分裂时染色体发生异常断裂事件所造成。McClintock小组对玉米环状染色体在细胞内的遗传行为进行了较长时间(从1931年-1941年)的研究，发现环状染色体在细胞进行减数分裂时不与常染色体发生联会和交换，在遗传上相对独立；但其遗传行为是不稳定的，在细胞有丝分裂和减数分裂过程中染色体大小都可以发生变化，或变大或变小，甚至可以丢失。该小组指出，环状染色体在细胞分裂时经历一个BFB(断裂-融合-成桥，Breakage-fusion-bridge)过程在细胞进行减数分裂时环状的两个同源染色体发生联会和交换，从而形成一个“8”形的双着丝粒染色体；在分裂后期，两个着丝粒分别移向两极，致使染色体被拉断而形成两个大小不等的线状染色体；在分裂末期，这两个线状染色体再各自首尾相连而成环状。由于染色体发生断裂部位的随机性，因而在其后代中就会产生各种大小的环形微小染色体(ring minichromosome)。从环状染色体后代中分离出的环形微小染色体，因其结构简单，只含有其独立存在所必需的最少元件，便于进行分子操作，被认为是构建人工染色体载体的最理想对象之一。
目前，有关环形染色体的研究报道尚不多见。只在少数动物(人类、小鼠和果蝇)和植物(玉米、烟草、金鱼草、矮牵牛)细胞中被发现，在水稻中尚无此方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供水稻的一种环状微小染色体。
水稻的一种环状微小染色体，由水稻4号染色体着丝粒和靠近着丝粒的部分长臂组成。
该环状微小染色体包括复制起始原点和着丝粒，没有端粒结构。
所述水稻4号染色体着丝粒的DNA是由310个拷贝的cent0重复单位组成的串联重复序列，以及分布在所述串联重复序列两侧的逆转座序列CRR构成；所述cent0重复单位的5′→3′链具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述CRR的5′→3′链具有序列表中序列2的核苷酸序列。
序列1由155个碱基组成，序列2由7403个碱基组成。
本发明的第二个目的是提供一种获得上述水稻的一种环状微小染色体的方法。
本发明所提供的获得该环状微小染色体的方法，是用Mix探针通过荧光原位杂交筛选含有环状染色体的2n+1型水稻(Oryza Sativa)变异体三体，得到环状微小染色体。
所述Mix探针为6个逆转座子RCH1、RCH2、RCH3、RCE1、RCE2、RCS1特异序列探针，探针序列及制备方法参见FG Dong，Joseph T等，1998，PNAS，95(14)8135-8140。
所述含有环状染色体的2n+1型水稻(Oryza Sativa)变异体三体可通过以下步骤获得1)用秋水仙素处理中籼3037二倍体水稻植株，获得四倍体株系；2)将步骤1)的四倍体株系再与二倍体植株中籼3037杂交，获得三倍体株系；3)将步骤2)的三倍体株系再与二倍体植株中籼3037杂交回交，得到三体株系2n+1型三体；4)对步骤3)的三体株系进行遗传和细胞学筛选，获得含有环状染色体的2n+1型水稻变异体三体。
本发明首先利用第4染色体长臂区域上的BAC(细菌人工染色体)检测，证明该2n+1型水稻(Oryza Sativa)变异体三体的环状染色体来源于第4染色体长臂上靠近着丝粒区域的一段染色体，推测该环状染色体可能由于第4染色体在细胞分裂时发生了异常断裂，带有着丝粒结构的第4染色体长臂首尾相连而成环型。应用端粒特异探针pAtT4(Richards EJ and Ausubel FM，1988，Cell，53127-136)进行了端粒序列检测，发现该环状染色体无端粒序列；应用着丝粒核心区特异逆转座子探针Mix(该探针是6个逆转座子RCH1、RCH2、RCH3、RCE1、RCE2、RCS1探针)，进行检测，发现该环状染色体有特异信号。说明该环状染色体来源于第4染色体，由部分长臂区域和共同着丝粒区域组成，只含有着丝粒结构，不含有端粒结构。在细胞进行减数分裂时，环状染色体经历一个BFB(断裂-交换融合-成桥，Breakage-Fusion-Bridge)过程，同源染色体发生联会和交换，形成“8”形的双着丝粒染色体结构的过渡态。随着分裂的进行，双着丝粒染色体分别向两极移动，导致大环状染色体被拉断，断裂成的两个染色体片段各自连接成环，形成两个新的环状染色体。由于染色体断裂位点的随机性，导致该非整倍体后代中携带有大小不同的各类型的环状微小染色体(ring minichromosome)。应用着丝粒CRR探针对该非整倍体自交后代FISH检测，也证明了这一过程，环状染色体在后代中产生了各种类型的微小染色体。
本发明的水稻环状微小染色体结构简单，不含有端粒，便于操作，对于探索构建水稻人工染色体的可能性具有重要的理论意义和实践价值。
图1为环状微小染色体的FISH检测照片图2为环状微小染色体的结构示意图具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、获得水稻的一种环状微小染色体1、水稻环状染色体附加系(2n+1型三体)的获得首先利用秋水仙素处理中籼3037二倍体水稻植株，获得四倍体株系；四倍体株系再与二倍体植株中籼3037杂交，获得三倍体株系；三倍体株系再与中籼3037回交，得到三体株系2n+1型三体。
2、获得环状微小染色体(1)水稻花药的预处理及压片取步骤1中的含有环状染色体的2n+1型水稻变异三体幼穗，加一滴醋酸洋红染色，镜检选择含有粗线期细胞的花药，解剖针敲片后，用45％的醋酸洗去洋红，火焰烤制后压片。
(2)Mix探针的标记及制备探针标记采用缺口平移法，具体如下25μL体系10×buffer 2.5μL，0.5Mm dNTP(ATG)2.5μL，0.5mM Dig-dUTP2.5μL，DNA Polymerase I 0.5μL，DNase I 1μL，Mix质粒8μL，H2O8μL。15℃保温2hr，加2.5μL 0.2M EDTA终止反应。标记后探针用Sephdex G50填料纯化。3μL探针中加入4μL浓度为10mg/ml SS sDNA单链鲑鱼精DNA(sDNA)(sDNA煮沸10min后立即放冰上10min得到SS sDNA)、2μL 20×SSC、10μL 50％去离子甲酰胺，4μL 50％葡聚糖，95℃保温5min，冰浴备用。其中，10×buffer为Roche公司试剂盒提供。Mix质粒为携带着丝粒核心区特异逆转座子RCH1、RCH2、RCH3、RCE1、RCE2、RCS1序列的6个质粒的混合物，简称Mix质粒，(该Mix质粒的具体制备方法是，参照文献FG Dong，Joseph T等，1998，PNAS，95(14)8135-8140报导的序列，利用PCR的方法分别扩增出这些目的片段，然后连接到pGEM-Teasy载体(promega公司试剂盒)上，具体方法参照试剂盒说明进行)。
(3)环状微小染色体的FISH检测压制的玻片于液氮中速冻15分钟后，解剖刀迅速揭片，4％QC(Qiagen公司产品)处理15分钟，2×SSC处理5分钟，乙醇梯度脱水，晾干。70％甲酰胺88℃变性2分钟，立刻放入-20℃ 70％乙醇5分钟，然后乙醇梯度脱水、晾干，每张玻片用20μL变性过探针于37℃保温8hr以上。2×SSC 42℃洗10min，2×SSC室温5min，1×PBS室温5min，晾干。用Dig-Rodamine抗体(Roche产品)(1∶100)37℃避光保温作用30min，1×PBS室温3×5min，用含有DAPI的封片剂封片，荧光显微镜观察并拍照。FISH检测结果显示，水稻在其自交系后代中形成了大小不等的各种类型的环状微小染色体。其中，本发明的环状微小染色体的FISH检测结果如图1(图左上部为一环状微小染色体)所示，由水稻4号染色体着丝粒和水稻4号染色体靠近着丝粒的部分长臂组成。其结构示意图如图2(图中左侧的环状染色体为第4染色体部分长臂和着丝粒区域组成的原环状染色体，右侧的环状染色体为新产生的微小环状染色体)。
序列表<160>2<210>1<211>155<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa)<400>1cacgagggtg cgatgttttc tactggaatc aaaaagttca aaaagagcca aaacatgatt60tttggacata ttggagtgta ttgggtgcgt tcgtggcaaa aactcacttc gtgattcgcg120cggcgaactt ttgtcaatta atgccaatat tggca 155<210>2<211>7403<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa)<400>2tgatgaggac atcccttcca acgatacaac cacgcctatt gcacagcaag gaccaatgac60tagagctcga gctcgtgaac ttaattatca ggaatatggg agaggaacca aatcgcaagc120agcactagca gcgctgattt gatgaagtca atgctcttca ctccggaggg caaacggggc180aaatgagtac ttgttggaaa gatctcgtcg tctactttca gctatgtgtg gcctcaccat240caactttgac ccaggctgct cagaatgacg aaaatagttc tttacatcag aaacttgggc300ttgggccttg tatcattaca gccatcatta cagcccatta ggggtccaca aaacctaggg360tttgctccca cctcctctcc tggtcattcc tccacctata taaactccta gcagccacca420ttttgcactt tgggttttgt tttgatgtaa gtttagctgc agctacttcc ttgtactcgc480gtgtgtcggc tagaccaccc ggatacttgt attccgaacc ccattttggt ttgtttaagt540ttcatcattt gacaagtgcc gtgagctgtt tccttgtcaa cttgttcttg cttgttcttc600gattgcttgc aggttcaagg ttgttcttgg cacggcaaga acagcaacaa cgtggagtcg660gtgtaccggt tgctaaggcg cagcacccct gtggtagttg tagtcggacc gccaacgtcg720
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1.水稻的一种环状微小染色体，由水稻4号染色体着丝粒和水稻4号染色体靠近着丝粒的部分长臂组成。
2.根据权利要求1所述的环状微小染色体，其特征在于所述水稻4号染色体着丝粒的DNA是由310个拷贝的cent0重复单位组成的串联重复序列，以及分布在所述串联重复序列两侧的逆转座序列CRR构成；所述cent0重复单位的5′→3′链具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述CRR的5′→3′链具有序列表中序列2的核苷酸序列。
3.获得权利要求1或2所述的环状微小染色体的方法，是用Mix探针通过荧光原位杂交筛选含有环状染色体的2n+1型水稻变异体三体，得到环状微小染色体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述Mix探针为6个逆转座子RCH1、RCH2、RCH3、RCE1、RCE2、RCS1特异序列探针。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述含有环状染色体的2n+1型水稻变异体三体通过以下步骤获得1)用秋水仙素处理中籼3037二倍体水稻植株，获得四倍体株系；2)将步骤1)的四倍体株系再与二倍体植株中籼3037杂交，获得三倍体株系；3)将步骤2)的三倍体株系再与二倍体植株中籼3037回交，得到三体株系2n+1型三体；4)对步骤3)的三体株系进行遗传和细胞学筛选，获得含有环状染色体的2n+1型水稻变异体三体。
全文摘要
本发明公开了水稻的一种环状微小染色体及其获得方法。该环状微小染色体，由水稻4号染色体着丝粒和水稻4号染色体靠近着丝粒的部分长臂组成。本发明提供的获得该环状微小染色体的方法，是用Mix质粒(着丝粒核心区特异逆转座子RCH1、RCH2、RCH3、RCE1、RCE2、RCS1序列的6个质粒的混合物)做探针通过荧光原位杂交筛选含有环状染色体的2n+1型水稻变异体三体，得到环状微小染色体。本发明的水稻环状微小染色体结构简单，不含有端粒，便于操作，对于探索构建水稻人工染色体的可能性具有重要的理论意义和实践价值。
文档编号A01H1/08GK1912124SQ20051008776
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月8日 优先权日2005年8月8日
发明者程祝宽, 李明, 顾铭洪 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所