获自水稻的胁迫诱导启动子的制作方法

专利名称：获自水稻的胁迫诱导启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种获自水稻的胁迫诱导启动子及其使用方法。
背景技术：
植物体本身具有耐受机制以应付自然界中不同类型的环境胁迫例如，脱水，高温，冷冻或者盐胁迫。近年来，因为胁迫耐受机制得以在分子水平描述，因此可以利用生物技术的方法生产胁迫耐受植物。例如，研究表明当细胞暴露于胁迫条件下，细胞中会诱导产生胁迫蛋白例如LEA蛋白，水通道蛋白，或能够溶解于溶质中的合成酶，从而保护细胞免于胁迫的影响。因此，有人曾尝试过基因例如大麦LEA蛋白的或烟草解毒酶的基因，或者是用于渗透调节物质(例如，糖，脯氨酸，或甜菜碱)的合成酶的基因被导入到宿主植物的研究。也有人尝试过利用编码拟南芥(Arabidopsis thalina)w-3脂肪酸脱氢酶的基因，蓝-绿藻D9-脱氢酶的基因，或类似的细胞膜脂类修饰酶的基因的研究。在上述研究中，一个基因被与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接并导入植物体中。然而，重组植物体的胁迫耐受水平不稳定，并且导入的基因的表达水平也很低。因此这些研究均未应用到实际应用中。
此外，研究发现，胁迫耐受机制与很多基因错综复杂地相关(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.“在水胁迫反应中的基因表达和信号传导”，植物生理学(Plant Physiol.)1997年10月；115(2)p327-334)。相应地，有人尝试研究了编码转录因子并且同时激活基因表达的基因被连接到一个组成型启动子上并被导入到植物体中，从而增强植物体的胁迫耐受能力(Liu等，(1998)植物细胞(The Plant Cell)，101391-1406)。然而，当几个基因被同时激活，宿主植物体的能量被导向基因产物的合成或者由基因产物产生的胞内代谢。相应地，植物体本身的生长被延缓或者生长矮小。
相反，本发明人从拟南芥分离出编码与胁迫反应元件结合并且特异性激活该元件下游基因转录的转录因子的基因DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A，和DREB2B(JP专利公开(未审查申请)No.2000-60558)。他们报道在一个植物体中导入与一个胁迫诱导的rd-29A启动子连接的基因能够产生不影响植物生长的胁迫耐受植物(JP专利公开(未审查申请)No.2000-116260)。
rd-29A启动子获自双子叶植物拟南芥。其也能够在单子叶植物中起作用，但是活性水平较低。相应地，在单子叶植物中具有高水平活性的胁迫诱导启动子已经成为很多研究的目标。

发明内容
本发明的一个目的是发现一种在单子叶植物例如水稻中能有效发挥作用的胁迫诱导启动子并且提供一种利用该启动子的新的环境胁迫耐受植物。
本发明者进行了集中的研究以求达到上述目的。结果，他们从水稻基因组中成功分离了一种强型胁迫诱导启动子。他们还发现单子叶植物的环境胁迫耐受能力通过使用该启动子被显著提高。从而完成了本发明。
优选地，本发明涉及一种来源于水稻的胁迫诱导启动子。更具体地，该启动子由如下(a)或(b)的DNA组成(a)具有显示于SEQ ID NO1或者2的核苷酸序列的DNA；或(b)在严谨条件下，与具有互补于具有显示于SEQ ID NO1或者2的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA杂交并且表达胁迫诱导启动子活性的DNA。
此处所用的术语“胁迫”是指脱水胁迫，低温胁迫，或盐胁迫。
本发明提供了一种包含该启动子的重组载体。在本发明涉及的启动子的控制下，该载体可以含有其他的结构基因或者调节基因。特别优选的情况是，该载体包含用于增强胁迫耐受的结构基因和/或调节基因。
用于增强胁迫耐受的优选的结构基因的实例包括，P5CS基因，其是脯氨酸合成的一种关键酶(Yoshiba Y.等(1999)BBRC261)和肌醇半乳糖苷合成的AtGo1S3基因(Taji T.等(2002)植物学杂志(PlantJ)，29417-426)。
用于增强胁迫耐受的优选的调节基因的例子包括，Arabidopsisthalina来源的DREB转录因子基因(JP专利公开(未审查的申请)No.2000-60558)，水稻来源的OsDREB转录因子基因(JP专利申请No.2001-358268，Dubouzet等，植物学杂志(Plant J)，出版中)，以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的一种关键酶(Iuchi S.等(2001)植物学杂志(Plant J).27325-333)。
本发明提供了一种转化子，其通过将本发明的载体导入到适宜的宿主中而获得。在一个实施方案中，转化子是一个转基因植物体，其通过将本发明的载体导入到一个宿主植物体中而获得。在这种情况下，该宿主植物优选的是单子叶植物，该单子叶植物优选的为水稻。
通过将本发明的启动子导入到植物体中，本发明进一步提供了一种方法用于加强植物体的胁迫耐受。本发明的启动子表现了一种潜在的胁迫诱导启动子活性，该活性从未在单子叶植物中被观察到，因此本发明的启动子更加适于加强单子叶植物的胁迫耐受。
下面具体描述本发明。
附图的简要说明


图1表示各种胁迫被实施时a0528(OsNAC6)和a2660(SalT)Northern分析的结果。
图2表示a2660(SalT)其启动子区的核苷酸序列。
图3表示a0528(OsNAC6)其启动子区的核苷酸序列。
图4表示Gus表达构建体的结构，其中Tg7代表g7终止子，HPT代表潮霉素磷酸转移酶，Pnos代表Nos启动子，Tnos代表Nos终止子。
图5是一个表示当脱水胁迫实施时，通过导入不同的启动子连接到GUS基因制备的转基因烟草或水稻的GUS活性的图。
图6是一个显示当盐胁迫实施时，通过导入SalT启动子连接到GUS基因制备的转基因水稻的GUS染色结果的图。
图7是一个表示当脱水胁迫实施时，通过导入OsNAC6启动子连接到GUS基因制备的转基因烟草和水稻的GUS活性的图。
图8表示每种胁迫实施时，GUS基因连接到OsNAC6启动子而制备的转基因水稻中用于观察GUS表达的组织染色结果。
发明的具体实施方案本发明的启动子是一种分离的水稻来源的启动子，其特异性地由例如，低温，脱水，盐胁迫等环境胁迫诱导。
1.本发明启动子的鉴定本发明的启动子可以通过如下方法进行鉴定。比较那些被实行胁迫和那些没有被实行胁迫的植物体，以显著差异水平表达的基因(胁迫诱导的基因)被首先筛选出来。随后，基于基因组的信息，被认定为基因启动子的序列被筛选出来。
本发明启动子的鉴定过程在后面描述。
1.1mRNA的制备首先制备用于筛选胁迫诱导的基因的mRNA。
作为mRNA的来源，植物体的局部例如，叶子，茎，根，花朵，乃至植物体作为整体都可以使用。可选择地，由播种到例如GM培养基，MS培养基，或#3培养基这样的固体培养基上并无菌生长而获得的植物体可以被使用。来源可以是胼胝体或者是无菌生长的植物体的组培细胞。
在这个筛选过程当中，观察那些给予胁迫的植物体和那些没有给予胁迫的植物体之间基因表达水平的差异。因此，有必要为每种植物体制备mRNA。实施胁迫的适宜方法是由所利用的植物体的类型来决定的。通常，脱水胁迫能够通过2-4星期不给植物体浇水来实施。低温和冷冻胁迫能通过在15至-10℃培养植物体1-10天来实施。盐胁迫能通过在100到600mMNaCl中培养植物体一小时到7天来实施。例如，水稻的实施例中，水培的水稻被暴露于低温胁迫(10至-4℃)，盐胁迫(150到250mMNaCl中)，和脱水胁迫(干燥的状态)。
被施于胁迫和没有被施于胁迫的植物体用液氮冻融，并在研臼中研磨，等等。从研磨后的材料中，采用乙二醛的方法，硫氰酸胍和氯化铯的方法，氯化锂和尿素的方法，蛋白酶K和脱氧核糖核酸酶的方法，或者类似的方法，提取粗RNA组分。从粗RNA组分中，可以通过采用寡dT-纤维素，琼脂糖2B携带多U-琼脂糖亲和柱的方法，或者类似方法或者分批的方法，能获得poly(A)+RNA(mRNA)。如果需要，获得的mRNA可以通过蔗糖密度梯度离心或者类似的方法进一步分级分离。
1.2胁迫诱导基因的筛选胁迫诱导基因的筛选基于那些被实行胁迫和那些没有被实行胁迫的植物体基因表达水平差异的比较。基因表达水平的比较方法没有特别的限定，而且，可使用的方法的具体例子包括传统方法，例如RT-PCR，实时(real-time)-PCR，消减，差异显示，示差杂交，以及交叉杂交。
利用例如基因芯片以及cDNA微阵的固相样品的方法特别适用于实施筛选过程，因为该方法能够同时定性并定量检测出几千到几万个基因的表达。
(1)cDNA微阵的制备在筛选程序中使用的cDNA微阵没有特殊的限制，只要是单子叶植物(比如水稻)的cDNA，即，启动子的检测靶点点在其上。可以用现成的微阵列，或者可以采用常规方法制备点阵(比如，参见“植物细胞”(The Plant Cell)(2001)1361-72，Seki等)。
制备cDNA微阵列时，首先应该制备目的植物体的cDNA文库。cDNA文库可以通过常规方法构建，采用方法(1)制备的mRNA作为模板。被点加的cDNA没有特殊限制，只要其来源于单子叶植物。从后面基因组数据分析简化的观点考虑，来源于像水稻这样具有高级基因组分析的单子叶植物的那些是优选的。植物体可以是在正常状态下(没有处理)。然而，植物体优选被暴露于像脱水，盐，或低温这样的胁迫下。
建立cDNA文库时，首先利用一个商售的试剂盒(比如，ZAP-cDNA合成试剂盒Stratagene)进行mRNA的反转录和单链cDNA的合成。然后利用合成的单链cDNA作为模板合成双链cDNA。随后，一个含有合适限制位点的连接物被插入到合成的双链cDNA中，然后将该双链cDNA插入到λ噬菌体载体的克隆位点。合成的DNA利用商售试剂盒(例如，GigapackIII金属包装提取物(Stratagene))在体外进行包装，然后感染E.coli宿主，再进行扩增。因此获得目的cDNA文库。
一旦制备了cDNA文库，就用PCR扩增该cDNA或者其具有高度特异性的区域(比如，在3’端没有重复序列的UTR区)来产生固定在微阵列上的探针。当通过重复该过程获得所有目的基因的探针时，利用商售分配器(例如，由Amersham制造的)将这些探针分配到光滑的玻璃板上。这样就获得了目的cDNA微阵列。
(2)基因表达水平的检测当标记有适宜反应物的样品mRNA(或cDNA)在微阵列上与cDNA探针杂交时，可以通过cDNA微阵获得的信号强度检测基因表达的水平。一般情况下，基因表达的水平优选确定为与适宜对照比较的一个相对值，或者是考虑到微阵上分配的cDNA探针量的差异，被检测的两个样品之间的表达水平的比率。在本发明筛选过程的实施例中，来自未被实施胁迫(没有处理)的植物体的mRNA作为对照，相应地，获自实施胁迫的植物体的mRNA的表达水平通过比率值来反映。
检测按如下进行。对照和样品的mRNAs(或者其cDNA)分别用不同的荧光染料(例如Cy3和Cy5)进行标记，并且与点阵上的cDNA探针杂交。譬如，从实施胁迫的植物体中提取mRNA并在Cy5标记的dCTP存在的条件下进行反转录来制备Cy5标记的cDNA。随后，从未实施胁迫(未被处理)的植物体中提取mRNA，并用同样的方法制备Cy3标记的cDNA。将等比例的Cy5标记的cDNA样品和Cy3标记的cDNA(对照)彼此混合，然后与点阵上的cDNA杂交。作为标记染色剂，Cy3可以用于样品，Cy5可以用于对照物。可选择地，其他的适宜标记染色剂也可以被应用。
利用荧光信号检测仪读取获得的荧光强度并随后被转化为数值。该数值等同于样品的基因表达水平相对于对照的比率。任选地，将扫描仪读取的荧光强度对于每个样品进行错误校正或者方差的标准化。基于在每种样品中都普遍表达的基因例如管家基因，可以进行标准化过程。此外，用于评价可靠性的阙值曲线可以被确定从而去除低相关性的数据。
(3)胁迫诱导基因的筛选基于点阵的分析结果，胁迫诱导基因被指定为被施以胁迫和未施以胁迫的植物体中以显著差异水平表达的基因。此处所用的术语“显著差异”是指，例如，在1000或者更高的强度水平基础上，两种植物体之间的差异在3倍或3倍以上。
(4)通过Northern印迹法分析表达如上被选择的基因被进一步进行Northern分析和类似的分析。因此，基因的表达水平的增强被证实与胁迫耐受水平的增强相关。例如，植物体被暴露于如上所描述的方式进行的例如盐，脱水，温度的不同水平的胁迫下。从植物体中提取RNA并通过电泳进行分离。分离的RNA被转移到硝酸纤维素膜上，然后与特异于该基因的标记cDNA探针杂交。这样，表达水平可以被检测。
如果被选择的基因的表达水平以胁迫依赖的方式加强，可以确定该基因是胁迫诱导的。从水稻cDNA文库筛选的胁迫诱导基因的例子包括a2660(SalTSEQ ID NO3)和a0528(OsNAC6SEQ ID NO4)。a2660和a0528是固定在微阵列上的cDNA的标示号(ID No.)。
1.3启动子序列的筛选(1)从基因数据库中筛选随后，利用检测软件(例如Blast)，在已经存在的基因数据库(例如，DDBJ数据库)中寻找胁迫诱导基因的启动子序列。对于像水稻这样的植物体，其基因组大多数已被解码，所有的控制特异性胁迫诱导基因的启动子序列，可以利用已存在的数据库寻找。从高度同源于胁迫诱导基因(cDNA)的基因组基因的上游区域中被认作启动子的区域选择作为启动子序列。例如，基于胁迫诱导基因的基因组信息，被假定为这些基因的一个起始密码子位点的上游大约1到2kb区域被推测是一个启动子区域。
一些传统胁迫诱导启动子在它们的序列中含有cis元件参与启动子的活性，例如，脱水反应元件(DRE)，脱落酸反应元件(ABRE)，以及低温胁迫反应元件。当一个胁迫诱导转录因子与cis元件结合时，前面提到的启动子被激活，在启动子控制下的胁迫耐受传授基因被允许表达。相应地，如果寻找到包含在上游区域的cis元件，该区域很有可能是胁迫诱导启动子。
因此，一个推测的SalT启动子序列(SEQ ID NO1)从高度相似于上述提到的a2660(SalTSEQ ID NO3)的基因的上游1.6kb区域中找到，一个推测的OsNAC6启动子序列(SEQ ID NO2)从高度相似于a0528(OsNAC6SEQ ID NO4)的基因的上游1.5kb区域中找到。
(2)胁迫诱导启动子的功能确定随后，推测的启动子序列的功能通过胁迫实施时启动子活性的变化被确定。
最初，基于上述部分推测的启动子的序列制备引物。利用基因组DNA作为模板进行PCR，启动子被克隆。随后，一个报告基因被连接到启动子下游产生一个报告质粒。产生的报告质粒随后被导入到一个植物体中，然后检测对植物体(优选的是其T2代)实施胁迫时报告基因的表达。报告基因的例子包括β葡糖醛酸酶(例如，GUSpBY121，Clontech，)，荧光素酶基因，以及绿荧光蛋白基因。GUS是优选的，因为其活性可以通过数值来显示并且其表达可以通过染色肉眼观察。
1.4本发明的启动子基于上述，水稻基因组来源的SalT启动子(SEQ ID NO1)和OsNAC6启动子(SEQ ID NO2)被发现是胁迫诱导的启动子，他们以脱水，低温，或盐胁迫依赖的方式进行高度表达。
因此，SalT启动子和OsNAC6启动子被所有胁迫特异性诱导。OsNAC6启动子包含cis序列，ABA反应元件(ABRE)；然而，SalT启动子的序列不包含特异性cis序列。
OsNAC6启动子被脱水胁迫迅速诱导，SalT启动子被低温胁迫迅速诱导。
本发明的启动子并不局限于具有SEQ ID NO1或2所显示的核苷酸序列的DNA。本发明的胁迫诱导启动子包括，在严谨条件下与具有互补于具有SEQ ID NO1或2所显示的核苷酸序列的DNA的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，只要该DNA具有胁迫诱导启动子的活性。此处所用的术语“严谨条件”是指本领域技术人员公知的参数。严谨条件是序列依赖性的并且在不同条件下不同。更长序列特异性地在更高温度下杂交。一般情况下，对于特异序列在确定的离子强度和pH下选择比热溶解点(Tm)低大约5℃的严谨条件。Tm是指，在平衡条件下，50％互补于目的序列的探针与目的序列杂交时的温度(在限制性的离子强度，pH值和核酸浓度条件下)。核酸的杂交参数可以在编纂如下方法的参考书中找到，例如，分子克隆实验指南，J.Sambrook，等，编著.，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.，1989。更特殊地，此处所用的严谨条件一词是指，例如，甲酰胺的浓度为30-50％，温度为37-50℃，以及6×SSC的条件。优选地，甲酰胺的浓度为50％，温度为42℃，以及6×SSC。
2.重组载体本发明的重组载体包括本发明的启动子。该载体可能包括其他的功能性结构基因或者本发明的启动子下游的调节基因。优选的基因实例包括用于加强胁迫耐受的结构基因和/或调节基因。“功能性”一词是指在本发明启动子的控制下，其他的结构基因或者调节基因适宜表达的一种状态。
加强胁迫耐受的结构基因编码一种蛋白，该蛋白在加强植物体对于像脱水，低温，或盐胁迫的环境胁迫耐受中发挥作用。这些蛋白的例子包括LEA蛋白，水通道蛋白，溶解于溶质中的合成酶；烟草的解毒酶；用于渗透调节物质(例如，糖，脯氨酸，或甜菜碱)的合成酶；编码Arabidopsis thalina w-3脂肪酸脱氢酶和蓝-绿藻D9-脱氢酶的基因，它们是细胞膜脂类修饰酶；P5CS是脯氨酸合成的一个关键酶；而且AtGo1S3基因用于肌醇半乳糖苷的合成。
加强胁迫耐受的一个调节基因调节胁迫诱导启动子的活性和用于产生胁迫耐受的基因的表达，从而加强植物体中的胁迫耐受。这样的例子包括Arabidopsis thalina来源的例如DREB1A，DREB2A，DREB1B，和DREB1C基因转录因子(参见JP专利公开(未审查的申请)No.2000-60558)；水稻来源的例如OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D，和OsDREB2A基因转录因子(参见JP专利公开No.2001-358268)；以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的一个关键酶。
当本发明的启动子含有一个特异性的cis元件时，结合于cis元件并加强其启动子活性的转录因子的基因特别优选地被连接于启动子的下游。
本发明的载体的构建是功能性的，其通过连接(插入)本发明的启动子或者启动子和其它的调节基因或结构基因到适宜的载体上。被插入启动子的载体没有特殊限制，只要其能够在宿主中复制。例如，质粒DNA，噬菌体DNA或类似可被使用的。质粒DNA包括用于大肠杆菌(E.coli)宿主的质粒，例如，pBR322，pBR325，pUC118，和pUC119；用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主的质粒，例如pUB110和pTP5；用于酵母宿主的质粒，例如，YEp13，YEp24，和YCp50；和用于植物细胞宿主的质粒，例如，pBI221和pBI121。噬菌体DNA包括λ噬菌体和类似的噬菌体。此外，也可以使用动物病毒载体例如，逆转录病毒或牛痘病毒，或者，昆虫病毒载体例如杆状病毒。
本发明的启动子通过用合适的限制酶切割纯化的DNA然后插入到用于连接的合适载体的限制性位点或多克隆位点。
如果需要，本发明的重组载体可以含有一个剪接信号，poly(A)添加信号，选择标记，核糖体结合序列(SD序列)等等。选择性标记的实施例为二氢叶酸还原酶基因，氨苄青霉素耐受基因，新霉素耐受基因，等等。
3.转化子本发明的转化子可以通过将本发明所述重组载体导入宿主以便启动子活性能够得以表达来制备。宿主并无具体限制，只要本发明所述启动子在其中能够发挥作用即可。优选地，宿主为植物体，特别优选水稻等单子叶植物体。
当用植物体或植物细胞作宿主时，例如，使用从水稻、玉米、小麦、拟南芥，烟草或胡萝卜建立的细胞或者从这些植物制备的原生质体。将重组载体导入植物体的方法包括Abel等一文[Abel，H.等，PlantJ.5421-427(1994))中使用聚乙二醇的方法，以及电穿孔。
4.胁迫耐受性转基因植物(1)制备转基因植物将用于增强耐受胁迫的结构基因和/或调节基因导入植物体，使得其置于本发明所述启动子的调控之下。从而，能够制备出对环境胁迫耐受性增强了的功能性转基因植物，所述环境胁迫是例如低温、冷冻或脱水的胁迫。特别优选的宿主植物为单子叶植物。
用于将本发明启动子等导入宿主植物体的方法包括间接导入如农杆菌感染法以及直接导入如粒子枪法、聚乙二醇法、脂质体法以及微注射法。到目前为止，用农杆菌感染法从水稻这样的单子叶植物制备转基因植物是很难的。但是，加入acetosyringon可使农杆菌感染水稻。从而，使得农杆菌感染法可用于单子叶植物。
本发明下文中将描述用农杆菌制备转基因植物。
导入植物的重组载体可以通过下述方法制备而成用合适的限制性酶对包含本发明启动子和用于加强胁迫耐受的一结构基因和/或调控基因的DNA进行切割，如有必要，在切割后的DNA上连接一合适的接头，然后将该DNA插入可用于植物细胞宿主的克隆载体中。二元载体型质粒，如pBI2113Not，pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH和pBIG，或者中间载体型质粒如pLGV23Neo、pNCAT和pMON200，可用作克隆载体。
当使用二元载体型质粒时，目的基因要插入到二元载体的两邻接序列(LB、RB)之间。得到的重组载体在大肠杆菌中扩增。然后通过冻融、电穿孔等方法将扩增后的重组载体导入根癌农杆菌C58(Agrobacterium tumefaciens C58)、LBA4404、EHA101、C58C1RifR、EHA105等。将得到的农杆菌用来转化植物。
本发明中，除上述方法外，还可以用三成员偶联法[Nucleic AcidsResearch，128711(1984)]来制备要导入植物体中的农杆菌。具体地说，将包括目的基因的含质粒大肠杆菌、辅助性含质粒大肠杆菌(例如，pRK2013)以及农杆菌混合并在含利福平和卡那霉素的培养基上培养。从而，可以得到待感染到植物体中的结合子农杆菌。
对于在植物体内表达外源基因等而言，应该将植物终止子等置于结构基因的下游。可用于本发明的终止序列的具体实例包括花椰菜花叶病毒来源的终止子以及胭脂氨酸合成酶基因来源的终止子。终止子不仅限于上述的终止子，只要已知它们在植物体中能够发挥作用即可。
为了有效地筛选目的转基因细胞，优选使用可有效筛选的标记基因。可以用选自下列基因的1个或多个基因作为筛选标记卡那霉素耐受性(NPTII)基因、可赋予植物对抗生素潮霉素耐受性的潮霉素磷酸转移酶(htp)基因、可赋予bialaphos耐受性的phosphinothricin acetyl转移酶(bar)基因，等。本发明中的启动子和筛选标记基因可以一同插入到同一载体中。替代地，可以分别引入不同的载体中。
如果用上述方法制备的农杆菌感染植物体，那么就制得目的转基因植物。
将该转基因植物播种在含足量抗生素的培养基上，然后就可以选择得到含目的启动子和基因的植株。将筛选得到的植株转移到含Bonsol No.1、黑泥土(black dirt)或类似成分的盆中，并进行进一步的培养。通常，基因都是以类似的方式导入宿主植物的基因组中。但是，由于导入的基因在基因组上排列的位置不同，会使得导入基因的表达情况随之变化。这种现象称之为“位置效应”。用来自导入基因的DNA片段作为探针通过Northern印迹方法对转化子进行分析，有可能筛选出那些其中导入基因更高表达的转化子。
(2)胁迫耐受性的确认已经导入了本发明所述基因的转基因植株及其后代中是否整合了本发明所述启动子或结构基因和/或用于增强胁迫耐受性的调节基因，可以采用下述方法对其确认从这些植株的细胞及组织提取DNA，并用本领域常规方法PCR或Southern分析对导入的基因进行检测。
基因在转基因植物中的表达水平及表达器官可以通过下述方法分析从植株的细胞及组织中提取RNA，通过本领域常规方法RT-PCR或Northern分析检测导入的基因的mRNA。替代地，导入基因的转录产物的表达水平及表达位点可以使用抗该产物的抗体通过Western印迹或类似方法直接分析。
已经导入了本发明所述启动子的转基因植物对于环境胁迫的耐受性可以通过下述方法评估将该转基因植物栽培在一装有土壤的盆中，所述土壤中含有蛭石、perlite、Bonsol、等或者水生植物，将该植物暴露于不同的环境胁迫下，然后检测植物的存活情况。环境胁迫包括低温、脱水及高盐胁迫。例如，对脱水胁迫的耐受性可以通过让植株无水生长2～4周，然后检测生存情况来评价。对低温和冷冻胁迫的耐受性可以通过让植物在15～-10℃下生长1～10天，在20～35℃下生长2天到3周，然后测定存活比例来评价。对盐胁迫的耐受性可以通过，例如，让植物在100～600mM NaCl中生长1小时到7天，在20～35℃下生长1～3周，然后测定存活比例来评价。
因此，使用本发明所述启动子能够显著增强胁迫耐受性而不阻碍植物的生长(特别是单子叶植物)。
实施例参照下列实施例更详细地描述本发明，但是，本发明的范围绝不仅限于这些实施例。
胁迫诱导的水稻基因的鉴别通过cDNA微阵列及Northern分析搜索胁迫-诱导水稻基因。
1.水稻cDNA微阵列的制备将在水生环境下生长2-3周的水稻种籽(Nihonbase)遭受脱水、盐或低温的胁迫。通过室温下空气干燥实施脱水胁迫，通过在250mMNaCl溶液中培养实施盐胁迫，通过在4℃下培养实施低温胁迫。把用每一种胁迫处理过的水稻用液氮冷冻。用硫氰酸胍及氯化铯法从冷冻样品中提取总RNA，用寡聚(dt)-纤维素柱制备mRNA。用得到的mRNA作模板用HybriZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack克隆试剂盒(Stratagene)合成cDNA，将得到的cDNA插入并克隆到HybriZAP-2.1噬菌粒载体的EcoRI-XhoI切割位点。用Gigapack IIIGold包装提取物(Stratagene)包装这种噬菌粒DNA。用得到的含随后要扩增的cDNA的λ噬菌体颗粒感染入宿主大肠杆菌，然后回收这些噬菌体作为噬菌体悬液。
测出cDNA克隆的核苷酸序列，筛选出大约1500个单个克隆。PCR扩增这些筛选到的克隆并用GTMASS系统(Nippon Laser andElectronic Laboratory)将其印在聚-L-赖氨酸-包被的显微载玻片(型号S7444，Matsunami)上。然后，通过UV交联将这些克隆固定制备成水稻cDNA微阵列(The Plant Cell(2001)1361-72Seki等)。
2.微阵列分析用与上述相同的方法给与水稻植株脱水、盐或低温胁迫或者用100μM脱落酸对其处理(5小时或10小时)，分别从这些植株以及未受胁迫的水稻植株中提取mRNA。来自未经处理水稻植株的mRNA用作对照，用来自经每种胁迫或脱落酸处理的水稻植株的mRNA用作样品。通过用Cy3和Cy5双重荧光标记的方法进行cDNA微阵列分析。作为微阵列分析的结果，强度为1000或更高的基因称之为表达水平比对照高3倍的基因，这些基因可以选用为侯选的胁迫-诱导基因。
3.Northern杂交表达分析上述部分选择的基因的特征性表达用Northern杂交分析。首先，将水稻植株暴露于脱落酸、脱水、低温、盐或水胁迫，然后每隔0、1、2、5和10小时从施加了胁迫的水稻完成取样。脱落酸、脱水、低温和盐胁迫分别以与1中相同的方式施加，用将植株浸没纯水中的方式施加水胁迫。从每一样本中制备总RNA，电泳，用Northern方法观察每一基因的表达。结果见
图1。
图1清楚可见，a0528基因(OsNAC6SEQ ID NO3)和a2660基因(SalTSEQ ID NO4)的表达受脱落酸-、脱水-、低温-、盐-、或水-胁迫诱导的情况。具体而言，a0528的表达被脱水胁迫快速诱导，a2660基因的表达被低温胁迫快速诱导。
启动子序列的筛选1.水稻基因组数据库的筛选用blast，从DDBJ水稻基因组数据库中搜索实施例1中选用为胁迫-诱导基因a0528基因(OsNAC6SEQ ID NO3)和a2660(SalTSEQ ID NO4)cDNA的同源位点。结果，在观察到同源性的基因中，位于该基因从起始密码子上游向5’端方向的1.5kb序列选作为a0528基因的启动子序列，位于该基因上游的1.6kb序列选作为a2660的启动子序列(分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
每一启动子区域的结构见图2和图3。尽管OsNAC6具有顺式序列ABA效应元件(ABRE)，但是SalT在启动子序列中不具有特异性顺式序列。
2.克隆以筛选到的启动子序列为基础，设计引物，用水稻基因组DNA作模板进行PCR扩增，并进行克隆。引物序列及PCR使用的条件如下引物序列OsNAC正向ctcccctacgaagcttaggtagt(SEQ ID NO5)OsNAC反向aaggatcctctctcccccttctccggt(SEQ ID NO6)SalT正向gccagaagcttaggaacacctgtacccg(SEQ ID NO7)SalT反向cagcgggatcctctgtttagtaaatac(SEQ ID NO8)PCR条件95℃、1分钟，55℃、1分钟，68℃、2分钟，共30个循环。
SalT启动子的功能分析用玉米的泛素启动子取代pBIG29APHSNot的启动子位点制备G-ubi质粒。用BamH I-Hind III切割G-ubi质粒，与用同一方式切割后的SalT启动子的片段连接，将已引入了SalT启动子的质粒用BamHI-EcoR I切割，同样，将其与从pBI221(Clontech)中用BamH I-EcoR I切出的Gus基因连接制备成GUS-表达构建体G-SalTGUS(图4)。电穿孔将质粒G-SalTGUS导入培养后用10％甘油洗涤后的农杆菌EHA105，从而制备出产生转化子的农杆菌EHA105(G-SalTGUS)。
将水稻种籽浸没在70％乙醇中1分钟，然后浸没在2％次氯酸钠中1小时消毒。然后用无菌水洗涤消毒后的种籽，每一种种籽各取9粒播种在N6D固体培养基(每升中含3.98g CHU[N6]Basal SaltMixure(Sigma)，30g蔗糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2,878mgL-脯氨酸、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、1mg盐酸硫胺素、2mg 2，4-D以及4g Gellite，pH5.8)平板上，然后培养24天。因此，愈伤组织被诱导。从大约20个种籽形成的胼胝体转移到新的N6D固体培养基上，然后再培养3天。
将农杆菌EHA105(G-SalTGUS)分别在含100mg/l利福平和含20mg/l卡那霉素的5ml YEP培养基(每升中含细菌培养用蛋白胨10g、细菌培养用酵母提取物10g，NaCl 5g、MgCl2·6H2O 406mg，pH7.2)中28℃下培养24小时。用含20mg/l acetosyringon的AAM培养基(每升中含有10mg MnSO4·5H2O、3mg H3BO3、2mg ZnSO4·7H2O、250μgNa2MoO4·2H2O、25μg CuSO4·5H2O、25μg CoCl2·6H2O、750μg KI、150mgCaCl2·2H2O、250mg MgSO4·7H2O、40mg Fe-EDTA、150mgNaH2PO4·2H2O、1mg烟酸、10mg盐酸硫胺素、1mg盐酸吡哆醇、100mg肌醇、176.7mg L-精氨酸、7.5mg甘氨酸、900mg L-谷酰胺、300mg天门冬氨酸和3g KCl、pH5.2)稀释该农杆菌至O.D.660值为0.1。因此，制备得到20ml农杆菌悬液。
随后，将农杆菌悬液加入培养了3天后的胼胝体，然后混合1分钟。然后，将该胼胝体放置在消毒后的纸巾上去除多余的农杆菌悬液，然后在其上已放置了消毒后的滤纸的2N6-AS固体培养基上培养，(每升中含3.98g CHU[N6]Basal Salt Mixure，30g蔗糖、10g葡萄糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、1mg盐酸硫胺素、2mg 2，4-D、10mg acetosyringon以及4g Gellite，pH5.2)黑暗处25℃下培养3天。培养3天后，用含有500mg/l羧苄青霉素的3％蔗糖水溶液彻底洗涤该培养产物直至该产物不变白。将洗涤后的培养产物在含500mg/l羧苄青霉素和10mg/l潮霉素的N6D培养基上再培养1周。然后，将得到的培养产物转移到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素的N6D固体培养基上再培养18天。然后，把该胼胝体转移到再分化培养基(每升含有4.6g Murashige and Skoog Plant SaltMixture(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd)，30g蔗糖、30g山梨醇、2g酪蛋白氨基酸、100mg肌醇、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、0.1mg盐酸硫胺素、2mg NAA、2mg激动素、250mg羧苄青霉素、50mg潮霉素及8g琼脂糖，pH5.8)。每隔一周将产物转移到新的培养基上进行再分化。将那些芽体长到大约1cm长的产物转移到无激素培养基(每升含有4.6g Murashige and Skoog Plant SaltMixture(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd)，30g蔗糖、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、0.1mg盐酸硫胺素、50mg潮霉素以及2.5gGellite，pH5.8)。将那些在无激素培养基上生长到约8cm的植物体转移到装有合成颗粒状盆用土壤(Bonsol No.1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)的盆中让转基因植物产生种籽。
得到的GUS-表达转基因水稻的T2代在水生环境下生长2周，并以与实施例1相同方式暴露在脱水胁迫下。
类似地，将rd29A启动子(SEQ ID NO9Nature Biotechnology(1999)17287-291)或35S启动子(SEQ ID NO10)连接到GUS基因的上游得到构建体。将得到的该构建体引入水稻和/或烟草。
就表达GUS的转基因烟草而言，让从T1代植株再生得到的植株在植物生长锥体中生长3～5周，将生长的叶片一分为二。其中一个作为对照测定，另一个在室温下空气干燥，然后暴露于脱水胁迫下。
4-methylumbellifery-β-D-葡萄糖苷酸降解导致荧光强度的变化，据此来分析每一转基因水稻及烟草的GUS活性。图5显示了在施加脱水胁迫时已导入不同启动子的转基因植株的GUS活性。
图5中清楚可见，胁迫-诱导的SalT启动子在单子叶植物即水稻中的活性水平比rd29A启动子要高。相比较而言，尽管SalT启动子在双子叶植物烟草中也表现出了胁迫-诱导启动子的活性，但是其活性比水稻中的活性弱。
另外，将其中已导入SalT启动子-GUS构建体的水稻整个植株浸没入盐水中，进行GUS染色。结果，整个植株都被染色(图6)。在此基础上，发现SalT启动子在给予了胁迫的整个植株中能够发挥作用。
OsNAC6启动子的功能分析用玉米的泛素启动子取代pBIG29APHSNot的启动子位点制备G-ubi质粒。用BamH I-Hind III切割G-ubi质粒，与用同一方式切割后的OsNAC6启动子片段连接，将已引入了OsNAC6启动子的质粒用BamH I-EcoR I切割，同样，将其与从pBI221(Clontech)中用BamH I-EcoR I切出的Gus基因连接制备成GUS-表达构建体(图4)。用农杆菌将制备的构建体导入水稻或烟草中制成转化子。
按照实施例1的方法将转基因的水稻和烟草暴露于脱水胁迫下，用实施例3的方法分析GUS活性。结果，脱水诱导的OsNAC6启动子活性水平很高(图7)。OsNAC6启动子活性水平在水稻中比在烟草中更高。按照实施例1的方法将转基因水稻的T2代暴露于脱水、盐或低温胁迫下，用组织染色法来探测施加胁迫后植物中GUS的表达状况。结果，发现OsNAC6启动子使得以脱水、盐、或低温胁迫依赖性模式在整个植株中表达GUS(图8)。
因此，发现SalT启动子和OsNAC6启动子是以胁迫-诱导模式被激活的，并且它们使得胁迫耐受基因在其控制下被表达。此外，该启动子的胁迫-诱导启动子活性的水平是如此的高，该水平此前还从未在单子叶植物中观察到。因此，如果用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调控基因被这样连接使得位于本发明所述启动子的控制下，并被导入植物，那么就可以在包括水稻在内的重要的谷类植物的单子叶植物中制备出高胁迫耐受性的转基因植物。
pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A的制备按下述方法制备G-ubi和G35S-ShΔ。首先，用BamHI切割pBIG质粒(Nucleic Acids Research 18203(1990))，平端化，并连接，从而删除该BamHI切割位点。然后，用Hind III和EcoR I切割该质粒。将得到的片段和一个通过相同方式切割pBE2113Not质粒得到的长约1.2kb的片段彼此连接，从而制备出pBIG2113Not质粒。
随后，用Hind III和BamHI切割pBIG2113Not，并与以相同方式切割rd29A启动子得到的一个片段(约0.9kb，Nature Biotechnology17287-291(1999))连接，从而制备出pBIG29APHSNot质粒。接着，用Hind III和Sal I切割该pBIG29APH SNot质粒，然后与玉米的泛素基因(Ubi-1)启动子的一个片段(约2.0.kb，Plant MolecularBiology 18675-689(1992))或者一个其中含有p35S-shΔ-stop的CaMV35S启动子和玉米蔗糖合成酶基因(Sh1)一部分内含子的片段(约1.6kb，Proceeding National Academy of Science USA 9615348-15353(1999))连接，这些片段是以同一方式切割得到的。从而，制得G-ubi质粒和G35S-ShΔ质粒。
用BamHI切割上述的pBE2113Not、G-ubi和G35S-ShΔ，并用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd.)与同样切割得到的OsDREB1A基因(SEQ ID NO11)中编码水稻转录因子的片段连接。用以此得到的连接产物转化E.coli DH5α。培养转化子后，从中纯化出质粒pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A。
发明效果本发明提供了一种胁迫-诱导的启动子，该启动子可以在单子叶植物中发挥功效。使用该启动子，可以赋予包括水稻等谷类类植物在内的单子叶植物以极强的胁迫耐受性。
SEQ ID NO5-人工序列描述引物SEQ ID NO6-人工序列描述引物SEQ ID NO7-人工序列描述引物SEQ ID NO8-人工序列描述引物序列表<110>独立行政法人 国际农林水产业研究中心<120>来自水稻的胁迫诱导启动子<130>PH-1725<140>
<141>
<150>JP 2002-377316<151>2002-12-26<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1608<212>DNA<213>水稻<220>
<223>发明人筱崎和子，桂幸次，伊藤裕介<400>1
caacaaccac tactgaacac ggctaagtgt gtttcctctc ctcgaagatg tcgttattgc 60gttcttttct gctattccat acatatcaat ctctagagga acaccttact ctagctttca 120gacaagggac ggtggtaaat cacgtcgtat cctccatggg gtgtgctccg aaaaaccttc 180cctcatgcat tagagatcat gggtggaatt tagcgatggc acaccttatt tataatttag 240ttactctccg gcggtaccat ctgcttccgt ttgttgatcg atgctggcga tgatgtgtgt 300gagtatcgat caacagaatg atcggacgct atttttgggg tcgttttttt tcagcattga 360ggagggatga ggattgcttg caacatgcag gtgctgctca aaacaacggt taagcagata 420tccgtcaatt tgatagtaag atctgtaacg cgtggtcttt cgagctgaaa actatggact 480ctttgaaaca aagataatat tatattaaat tctattattc aaagatatct aaatatttag 540aaagatatta ataatgttat taaactttga cttacttaaa acaagtccaa aactgcatgt 600ccctaaatcg ccagaagata aggaacacct gtacccgtga taacagaggg gtatgaaatt 660tggacacgag gcttctttgg cagacgtggc gctgagtgag cttggctcgc ttggtcaaac 720tccgtgcagg gacattcagt tagctagcta gcagcattgt cgacaataag atagccttta 780aatgttagca ctcaccagct tgtcaaaaac caaggcttgg tgacggcggc ttcagaatga 840aggatagatg gataaatgtc tagaatatta taaagtccaa caaaagatgg agcacatgca 900tgaaagatta cgtacacgaa tgcagttgat acagtggatg ttaggcataa gaagcactat 960aaatagaggg tgcaatcccc attgccctac acaactacac aagtcgacta tcattacaag 1020gaaatttaag cgaccacgaa ggtatgaaag catagcagta ctctgcattt tttttttttg 1080atgttgttct agctagctct gcttaaggtt ttcctttctt tcgttctttg tttttttttt 1140gtaagctcaa ctagttgcat gcaatttaga ttttatcctt ttacagttgg aaaaacatcc 1200ctataaatat taccatgaat gcatagagat tcgaggaagc tacaaattgg acgactgatt 1260ccaaaaaaaa aaaaaaaatc agatggtcac atcattgcta ttgttttgtg aaagtacaaa 1320agcactcgtt cggattcaaa ttacttgtgc aaattaatta aaaaccatag aaatgatcat 1380gttaccccta cacatttcgg aaacaatacc atatatgtta gtgtgcgatc attcaaattg 1440atttatatct gaacaaaact gagtgggaat acggtgagca aacttgacga ttccaaaata 1500atttatattt aggcaaaatt ttacaacttc aaagttcaaa caagctaacc tgaaaaatca 1560tgtttgaatt tactaagatg tgcttttgta tttactaaac agagtatg 1608
<210>2<211>1520<212>DNA<213>水稻<400>2ctcccctacg aagcttaggt gtagtgataa gaaaaatcga gaaggattgg tacaagttaa 60caacttaatc aatagattgt gcatatagca aacaagtcta tataataaca caaagagaaa 120gaaagaagac ccattttagt tgatagtggt attattaccc aaaaattaaa aatacgttca 180atttagacct acttttataa gcatcatgcc agctacagct acagtcacag cctctttcat 240ccctttttct ttcttccaaa aaacgctcac ctgtagtgat ggatctatgt gaaagttgtg 300aggtcgaatg tcgaatgacc ctacagcttc ttcacattca ttcttgagta ctaaattttt 360catggaaatc cattcaaatc tacacaaata atcccactga aatatttaat aataataatc 420gatctcacaa agtaacttta tctaataatt tattgactcc gccactgaat ttaagtgtag 480tgataaaaaa tcgagaagaa ggtttggtgc aaattaacaa cttaaacatg aaattaaatt 540gtacatgtag caaacaacct ttataataac acaaaaaaaa ccattttagt tgaaagtggt 600attgctaaaa gagttaaaag tatttcaatt tagagcaaca tgccagctac ggctacagtc 660acaacccctt tatccttttt ctttcttcca aaatacaaac gcttacctta cagtgatggt 720tctatgtcaa agctgtgggg tccgttgacc ccatagtttc ttaccatcat cgtttagagt 780ttcttaaatt ttctatattt atccgttgaa atttacacaa ataatcccac taaaatatat 840agtaatgata atcgatgtca cagagtaaat ttgctggctc tgccactact cacctgtaac 900cccccaacta tgccaccaaa cacacataac tcatcgcctc atcatcgtca tctatctccg 960catgagaccg catccttatc ccaccacgtc cccctcgcgc tcacgcgcac agcaacaaag 1020aaaaaaaaaa aaacccgtcc cttttccctc gccgccccac cgctccccca ccccacgtgt 1080cgccggccca tcggcggcgg cgcctgcgtg ggccgtgtgg cccaccctgc ggccccttcc 1140cgaaaacgga acgccccccc cctcctcccc tctccacgtc actgcgcggt gggcccgcgc 1200gtgcgtccaa gaagcgtgac gtaagcagtg acagaatccg cgccgcctct cggggcgccc 1260acgtgtcgcg gtcaaacggt cagcgcgggg cgggggctcg catcgcatct gctccacgtg 1320tgcgctatcg cggctgcggc cgcacgggcc acacgtgtcg cttgcccccg gctctataaa 1380
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<213>人工序列<220>
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1.一种分离的水稻来源的启动子，其如下述下列DNA(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA；或者(b)如下特征的DNA即，能够在严谨条件下与互补于(a)中所示DNA的DNA杂交，并表达胁迫-诱导启动子活性。
2.权利要求1中的启动子，其中所述的胁迫为脱水胁迫、低温胁迫或盐胁迫。
3.一种重组载体，其中含有权利要求1或2所述的启动子。
4.权利要求3中的载体，其中包含用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调控基因，从而使其在权利要求1或2的启动子控制下发挥作用。
5.权利要求4中的载体，其中所述的用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调控基因选自作为脯氨酸合成中的一种关键酶的P5CS基因、用于肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因、拟南芥来源的DREB转录因子基因、水稻来源的OsDREB转录因子基因和作为ABA合成中关键酶的NCED基因。
6.一种转化子，该转化子是将权利要求3-5中任一项所述载体导入单子叶植物制得的。
7.一种通过将权利要求1或2所述的启动子导入单子叶植物体从而增强植物胁迫耐受性的方法。
全文摘要
本发明涉及一种分离的胁迫－诱导的启动子，该启动子能够在水稻等单子叶植物中有效发挥作用，本发明还提供了使用该启动子的环境胁迫耐受植物。
文档编号A01H5/00GK1912125SQ20061008995
公开日2007年2月14日 申请日期2003年3月20日 优先权日2002年12月26日
发明者筱崎和子, 桂幸次, 伊藤裕介 申请人:独立行政法人国际农林水产业研究中心, 独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构