专利名称：一种含有氯化血红素的植物生长调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，属于植物生长调节物质的开发与利用领域，专用于包括农用化学品开发、农田化学调控、种源农业、组培、果蔬贮藏以及切花保鲜等领域。
(二)技术背景植物的生长发育进程通常受植物内源激素的调控，同时也经常受到各种不良环境条件(包括许多非生物/生物胁迫等逆境因素)的制约，往往导致生长速率和产量的下降，其中与人类生活最密切的是农艺性状的下降，而植物各组织和部位的代谢功能下调以及导致的抗氧化能力下降是其中的最主要诱因之一。已经证实，通过改善农业环境、选育抗/耐逆性强的作物品种以及开发转基因作物确实可以达到增产和增收的目的，但其往往成本较高，而且开发年限也较长，甚至还可能带来其它副效应，例如转基因作物的风险性评估以及潜在的安全性问题。另一方面，尽管目前已经有不少发明专利可以用于提高植物的耐/抗逆性和改善各种农艺性状，但是上述发明专利往往是将几种大量/微量元素和(或)植物激素或人工合成的衍生物按一定比例配合。由于成份复杂，作用机理不明确，使用方法也不易被生产者所掌握，而且有些植物激素的价格比较昂贵，在使用过程中也存在有一定的副作用，因此使用效果往往不稳定。
已经知道，当植物受到各种不良环境的胁迫时，往往体内ABA和H2O2等内源信号分子的含量和分布会发生改变的趋势，表明ABA和H2O2作为重要的信号因子能够参与对不同环境因子的交叉耐受和适应；同时，若用其中一种因子(ABA和H2O2等)诱导胁迫植物，则可抵抗接下来相同种类或不同种类的胁迫。最近的研究已经发现，作为植物生长调节/信号分子的一氧化氮(Nitric oxide，NO)可以广泛参与各种生理过程，尤其在植物生长发育及其对逆境的响应等方面起着重要的调节作用，并与植物的生长发育进程和NO的处理浓度有关。例如低浓度外源NO(μM浓度范围)能显著提高植物的耐盐性，并与其能增加各组织抗氧化能力有关，同时也与其能调节植物离子平衡相关，并有Ca2+信使和H2O2等信号分子的参与；但高浓度NO处理则有明显的伤害效应(Ruan等，Chin Sci Bull，2002；Uchida等，Plant Sci，2002；Zhao等，Plant Physiol，2004)。此外，植物NO功能还与ABA以及其它激素/植物生长调节物质的交互作用有关(Beligni和Lamattina，Planta，2000；Delledonne，Curr Opin Plant Biol，2005)。1999年11月，阿根廷科学家Lamattina等申请了与植物NO功能开发利用相关的美国专利(Method ofenhancing the metabolic function and the growing conditions of plants and seeds，专利申请号450192)，并在2001年6月正式获得专利(美国专利号6242384)。
另一方面，与NO同为双原子气态分子的一氧化碳(CO)一直被认为是一种有毒气体。从化学特性看，CO纯品为无色、无臭、无刺激性的气体，分子量28.01，密度0.967g/L，冰点为-207℃，沸点为-190℃，在水中的溶解度较低，但易溶于氨水，空气混合爆炸极限为13～74％。通常，当含碳的物质不完全燃烧时，都可产生CO气体，例如在工业生产中接触CO的作业不下70余种，如冶金工业中的炼焦、炼铁、锻冶、铸造和热处理生产，化学工业中合成氨、丙酮、光气、甲醇的生产，矿井放炮和煤矿瓦斯爆炸事故，碳素石墨电极制造以及生产金属羰化物如羰基镍、羰基铁等过程，或生产使用含CO的可燃气体(如水煤气含CO达40％，高炉与发生炉煤气中含30％，煤气中则含5～15％的CO)，都可能接触或产生CO气体，使用柴油、汽油的内燃机废气中也含CO约1～8％。此外，Hemin(氯化血红素，C34H32ClFeN4O4，分子量为651.94)、Hematin(高铁血红素，C34H33N4O5Fe，分子量为633.49)和CORM-3等也是常用的能释放CO气体的人工供体，而通过浓硫酸与甲酸共热的加热反应也可以产生人工CO气体。
已经知道，CO也是许多国家引起意外生活性中毒中致死人数最多的毒物，急性CO中毒的发生与接触CO的浓度及时间有关。已经知道CO之所以能引起煤气中毒，是因为CO被人吸进肺中，跟血液里血红蛋白结合。由于碳氧血红蛋白的存在，使人体血液的携氧功能发生障碍，造成机体急性缺氧。当CO浓度较高时，还可与细胞色素氧化酶中的铁结合，从而抑制组织细胞的呼吸过程，阻碍其对氧的利用。由于中枢神经系统对缺氧最敏感，当吸入CO的量不等时便可能产生不同的中毒现象。例如，当CO在空气中浓度为0.4％时，将危及人的生命。
最近的大量研究已经证实CO也是动物体内重要的细胞间信使，属于活性碳(Reactive carbon species，RCS)范畴，参与调节动物体内各种生理和病理过程，并与动物中NO的功能相类似(Verma等，Science，1993)。在动物体内，血红素氧合酶(Hemeoxygenase，HO)是一种催化血红素降解为CO、Fe和胆红素的起始酶和限速酶，有着重要的生物学作用，而CO的细胞信使作用已引起人们的普遍关注。例如，CORM-3(可溶性液态CO供体)可以促进心脏细胞生长从而有效治疗患者的心脏病发作，在患者心脏病发作期间，CORM-3释放出的CO气体能有效地预防心脏细胞的受压和缺氧；同时，CORM-3还可增强移植器官的生理机能，降低人体机能对移植器官的排斥性。因此，英国谢菲尔德综合大学Brian Mann教授称，“根据实验结果可以看出，CO分子在医疗应用中有巨大的潜力，CO的生理活动性将应用至更广阔的领域”。有意思的是，在心血管系统中，CO具有的维持血管张力和保护心肌细胞的作用与NO的功能相类似。通常，CO与NO在动物体内都可以通过结合可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)活性中心的Fe2+从而改变sGC的构象，导致酶活性的增强，从而提高细胞内cGMP的浓度，发挥舒张内皮细胞的作用。另外，CO和NO的生成和调节系统也有较大的相似性。例如，HO和一氧化氮的重要合成酶一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)都有两种形式组成型和诱导型(iHO/iNOS)，HO也分为HO-1(iHO)和HO-2/3(组成型HO，cHO)，而HO对iNOS的一些刺激因素如内毒素、细胞因子、活性氧也有应答效应。此外，NOS和HO系统的产物均对血红素分子有很高的亲和力，并在调节胞内cGMP浓度的功能上有互补的关系。总之，动物的研究表明CO与NO在分子结构、生理功能、信号转导途径、合成酶系统等方面都存在许多相似之处。
与上述相对应的是，植物中的研究也已经初步发现HO具有体内合成CO气体的能力(Muramoto等，Plant Physiol，2002)。此外，在植物种子萌发和幼苗生长过程中也往往伴随着CO生成的现象(一般≤1000ppm)，其中产生的最高浓度则为6000ppm，并初步推测与光呼吸作用、光合作用以及呼吸代谢作用有关(Wilks，Science，1959；Siegel等，Science，1962)。这一发现表明CO可能也是植物代谢的天然副产物，同时也为CO对植物生长发育调控作用的发现和利用提供了相应的现实基础和思路。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于克服现有技术中使用各种大量/微量元素以及植物激素/生长调节物质(包括NO等)来提高植物抗/耐逆性以及改善各种农艺性状的效果往往不稳定或具有一定伤害作用以及价格昂贵的缺陷，通过氯化血红素(Hemin，也是HO-1的活性诱导剂)来逐步提高植物内源CO的含量，从而提供一种能促进植物生长发育和形态建成，增强各种代谢能力，增加产量和改善品质等各种农艺性状，以及提高植物抗/耐逆性和上调植物抗氧化能力的方法。
技术方案 一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂含有氯化血红素，配制成溶液后氯化血红素的有效终浓度为0.001～1000μM。该植物生长调节剂还含有配制成溶液后终浓度为0～1000μM的Ca2+或终浓度为0～1000μM的水杨酸或0～1000μM的其它农用化学品。该植物生长调节剂能诱导植物体内逐步释放总浓度≤1000ppm CO的气体。上述一种含有氯化血红素的植物生长调节剂的应用，其特征在于采用含有氯化血红素的植物生长调节剂对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以改善各种农艺性状或代谢功能以及非生物或生物胁迫耐受性或抗性；连续处理1～60天，每天1～3次。
所述植株、植物组织和种子，包括种植在大田和温室等地方的单子叶植物、双子叶植物或裸子植物以及经遗传修饰生物体(Genetically modified organisms，GMO)的植株、组织和种子； 各种非生物胁迫，包括盐害、渗透胁迫、干旱和渍水胁迫、冷害、热激、紫外线照射、臭氧、创伤、金属(铁、铜、铅、锰、铝和汞等)毒害、除莠剂(包括Paraquat和Diquat等诱发活性氧过量产生的除草剂等)的过量或错误使用等，而生物胁迫包括各种虫害和病原菌侵染； 所述各种农艺性状和代谢功能以及非生物/生物胁迫耐受/抗性，是指在播种、萌发、生根、生长、移栽、枝插、分蘖、开花、果实形成与成熟、组织培养等各种发育与生产阶段，以及各种天然或人为导致的生物与非生物胁迫条件下，包括诱导α/β淀粉酶活性从而缓解各种胁迫对种子萌发的抑制以及提高正常条件下种子萌发率以及打破休眠、延缓老化和衰老进程、延长货架期、诱导侧根和不定根的发生、上调各种抗氧化酶基因表达和合成以及酶活性的提高、下调各种活性氧产生系统的运转速度、延缓脂质过氧化产物的生成、诱导植物叶片的气孔关闭以及保绿作用、提高地上/地下部组织的干鲜重以及伸长/生长速率、增加农作物产量和改善品质、增强植物的抗病性和抗虫性、重金属抗性以及诱导脯氨酸、黄酮类化合物以及植保素等各种保护物质的合成等。
氯化血红素用于植物生长调节的方法，其特征是， 1)配制含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液该溶液中氯化血红素有效终浓度为0.001～1000μM；此外，还含有终浓度为0～1000μM的Ca2+或水杨酸或0～1000μM的其它农用化学品； 2)用上述含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以改善各种农艺性状或代谢功能以及非生物或生物胁迫耐受性或抗性；连续处理1～60天，每天1～3次。
有益效果 尽管已经有报道发现低浓度CO气体和Hematin可以提高植物种子的萌发(Dekker和Hargrove，Am J Bot，2002；Xu等，J Integr Plant Biol，2006)，但是由于是直接采用CO气体处理，容易引起对人体的不良反应；同时，与增加了Cl原子的Hemin相比，高铁的Hematin化学性质不稳定，而且价格昂贵。与它们所不同的是，本发明所用的是能直接诱导体内释放低浓度CO气体的含有氯化血红素(Hemin)的植物生长调节剂，由于化学性质稳定的氯化血红素可以直接诱导植物HO-1(属于iHO)的活性，从而逐次产生CO气体，并被植株、植物组织和种子所直接吸收，因此可以有效的避免CO气体对人体的直接伤害效应；而植株、植物组织和种子体内中产生的CO也可以进一步诱导NO的合成，从而协同改善植株、植物组织和种子的各种农艺性状，提高各种代谢功能以及非生物/生物胁迫耐受/抗性。
植物中的研究已经表明，高浓度的CO气体(＞6000ppm，相当于大于0.6％(V/V)的CO气体)可以明显抑制植物生长和发育。本发明是一种以能释放低浓度CO气体的含有氯化血红素(Hemin)的植物生长调节剂来改善植株、植物组织和种子农艺性状以及提高代谢功能的方法，包括可以促进植物生长发育和形态建成，加快种子萌发，提高抗氧化能力以及改善各种非生物/生物胁迫耐受/抗性。
本发明进一步证实CO供体/HO-1的活性诱导剂氯化血红素(Hemin)与NO相类似，也能提高植物的抗/耐逆性和改善农艺性状以及上调各种代谢功能，其作用的机理涉及CO作为信号/还原分子来提高植物耐/抗逆性以及代谢功能、或通过与NO、H2O2信号分子以及ABA、IAA和GA等植物激素的互作，而相关的调节功能则包括诱导植物正常或胁迫条件下的侧根和不定根发生以及组培条件下的生根、缓解各种胁迫条件对植物种子萌发的抑制和提高正常条件下萌发率以及打破种子休眠、诱导叶片的气孔关闭和保绿作用、提高地上/地下部组织的干鲜重以及伸长速率、增强植物的抗病/虫性、延缓老化和衰老以及上调植物各组织的抗氧化能力等，由于CO也是植物生理代谢的内源副产物，因此上述研究结果表明CO或相关供体也可能是新型的植物生长调节物质，并能在作物逆境或正常生长条件下行使有效的调节作用。
由于NO本身是一自由基，因此在使用过程中容易引起氧化伤害，而CO不是一个自由基，则不太容易引发氧化损伤。此外，本发明中所采用的Hemin诱导释放的CO浓度远低于人体敏感浓度(例CO气体对人的致死剂量至少为4000ppm，而本发明所涉及的浓度为≤1000ppm)，且由于是采用能逐次诱导植物体内释放CO气体的Hemin溶液，因此更不会对人体产生直接的明显影响。另一方面，本发明中的CO供体Hemin来源广泛(Hemin通常是动物血液的深加工产品)，价格便宜。因此，采用CO供体Hemin来提高作物的抗/耐逆性、农艺性状和代谢功能，与传统的基因工程和其它化学调控方法相比更具有优良的性价比和环保优势。总之，本发明不仅可以为作物发育生理和逆境生理研究提供实践依据，而且也为动物血液的合理深加工产品开发提供新的实践思路。
本发明所提供的一种含有Hemin的植物生长调节剂来改善植物和种子农艺性状以及提高代谢功能的方法，还具有以下优点 1)无污染、环保 由于CO本身不是一个自由基，为植物内源代谢产物(浓度通常≤1000ppm)，所有植物体内也都含有CO降解代谢机制，包括能通过氧化生成CO2或通过血红蛋白清除；同时，Hemin本身也是来源于各种动物血液，通常用于食品行业的补血剂，因此在农田和温室等各种实践条件下使用低浓度的CO供体Hemin溶液也不会对生态环境造成不利影响；此外，Hemin溶液的使用浓度(≤1000μM)也不会引起人体健康安全问题，由于诱导植物体内释放CO气体也是逐次产生的，因而也是一种无毒无污染的技术，符合绿色农业的需要； 2)低成本 本方法采用的CO供体Hemin本身是各种动物血液的深加工产品，价格便宜，因此使用成本也较低； 3)稳定性高 与高铁的Hematin相比，增加了Cl原子的Hemin化学性质比较稳定，使用起来也比较方便； 4)应用范围广 本方法专用于包括农用化学品开发、农田化学调控、种源农业的无公害生产、组培、果蔬贮藏以及切花保鲜等领域，其中Hemin溶液诱导产生的CO能够作为信号/还原分子来提高植物耐/抗逆性、改善各种农艺性状以及上调各种代谢功能，因此与其它化学调节物质相比还具有多效性的特点。
图1为含有氯化血红素的植物生长调节剂可以缓解渗透胁迫对小麦种子萌发的抑制。
图2为含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液对黄瓜不定根发生的诱导作用。其中图1中的CK为小麦种子在蒸馏水处理2天时的萌发照片(对照)，P为25％的PEG-6000来模拟干旱胁迫，P+Hm0.1、P+Hm1.0和P+Hm10.0分别为25％的PEG-6000和0.1、1.0以及10.0μM Hemin的组合处理，表明CO供体Hemin可以以浓度依赖性的形式缓解渗透胁迫2天对小麦种子萌发的抑制，其中1.0μM Hemin的效果最好；图2表明与对照(蒸馏水，CK)相比，不同浓度的CO供体Hemin(0.1、1.0和10.0μM)处理5天后均可以诱导黄瓜不定根的发生(标尺示为5mm)。
具体实施例方式 本发明所提供的是一种含有氯化血红素(Hemin)的植物生长调节剂来改善植株、植物组织和种子(包括经遗传修饰生物体等)的农艺性状以及提高各种代谢功能和非生物/生物胁迫耐受/抗性的方法，其特征在于，配制能释放低浓度CO气体(≤1000ppm，采用GC-MS检测CO气体释放，Anderson等，JAgric Food Chem，2005；或血红蛋白比色法检测，Chalmers，Clin Chem，1991)的终浓度为0.001～1000μM的氯化血红素(Hemin)溶液，并加入0～1000μM的Ca2+或0～1000μM的水杨酸或0～1000μM的其它农用化学品从而配制成混合溶液；采用上述溶液对植株、植物组织和种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种等各种处理，包括直接加进包含上述材料的培养基；连续处理1～60天，每天1～3次。
实施例 实施例1以青海9号蚕豆的表皮条为实验材料，采用脱落酸(ABA)和聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫作为阳性对照，运用Hemin(Fluka公司生产)处理蚕豆表皮条3小时，与对照(缓冲液)相比，发现Hemin具有与ABA和PEG-6000相类似的功能，可以明显诱导气孔关闭，其有效浓度大约在0.01～1.0μM之间，Hemin的最佳浓度分别为0.1和1.0μM(释放低浓度的CO气体，≤1000ppm，采用GC-MS检测CO气体释放，Anderson等，J Agric Food Chem，2005)，暗示低浓度的Hemin可以参与调节植物对干旱胁迫的应答，诱导气孔关闭，从而增强植物的耐旱性；进一步采用不同稀释倍数的CO气体饱和水溶液处理蚕豆表皮条，发现0.1％和0.01％饱和度的CO溶液也能诱导蚕豆叶片气孔的关闭(≤1000 ppm的CO，采用血红蛋白比色法检测，Chalmers，Clin Chem，1991)。
实施例2以25％(W/V)的PEG-6000对“扬麦158”小麦种子进行渗透胁迫处理，并通过添加不同浓度(0.1、1.0和10.0μM)的Hemin(上海鸿儒科技发展有限公司生产)研究外源Hemin对渗透胁迫下小麦种子萌发的影响(附图1)。结果发现，渗透胁迫下的小麦种子萌发受到不同程度的抑制(与正常水分条件下相比，萌发滞后1～2天)。1.0和10.0μM的Hemin促进了渗透胁迫早期(处理2天内)小麦种子的萌发，其中1.0μM的Hemin处理(P+Hm1.0)效果最为明显，表现在处理2天时萌发率和根长都明显提高(P＜0.05或0.01，表1)，另外芽长(数据未列)亦明显高于单独渗透胁迫处理(P)。与单独渗透胁迫处理(P)相比，1.0μM的Hemin(P+Hm1.0)还明显提高了淀粉酶活性(包括α/β-淀粉酶)(P＜0.05，表2)，促进了淀粉的降解，还原糖的含量也明显上升，同时也显著提高了可溶性糖含量(P＜0.05，表2)。CO合成抑制剂ZnPPIX(50μM)和清除剂血红蛋白(Hb，1mg/ml)单独处理对小麦种子萌发无显著影响(图片未列)，却逆转了1.0μM的Hemin(P+Hm1.0)对渗透胁迫下小麦种子萌发的促进作用，包括不同程度上降低了淀粉酶活性和还原糖以及可溶性糖的含量，提高了淀粉含量(表2)，表明Hemin促进萌发的有效物质确实是CO。为了证实上述结果，进一步采用不同稀释倍数的CO气体饱和溶液处理渗透胁迫下的小麦种子。发现不同浓度的CO气体饱和溶液均可缓解渗透胁迫对种子萌发的抑制效应。其中，0.1％的CO气体饱和溶液(P+0.1％CO，CO气体实际浓度≤1000ppm)的效果最为明显。与渗透胁迫(P)相比，P+0.1％CO处理后的小麦种子萌发率和根长都有显著的提高(具体数据未列)。
实施例3“露丰”黄瓜种子(江苏省农科院提供)经水浸泡后，播种于铺有2～3层白色纱布的搪瓷盘中，加双蒸水保持湿润。先在25±1℃的光照下(光照强度为200μmol·m-2·s-1，光周期为光14小时/暗10小时)培养5天后切除主根，并放进不同浓度的CO供体Hemin溶液中培养5天，最后量取＞1mm的不定根数目，发现与对照(蒸馏水，CK)相比，0.1、1.0和10.0μM的Hemin处理均可以显著诱导黄瓜不定根的发生(附图2，标尺示为5mm)。
实施例4Hemin(用Hm表示)购至上海鸿儒科技发展有限公司。挑选大小一致的水稻“武育粳3号”种子，用0.1％的KMnO4表面消毒3分钟，冲洗干净，清水浸种24小时后于30℃下暗处催芽，每个培养皿中放置50粒，并设置如下处理对照(CK)，0.1M NaCl；Hm 10.0，0.1M NaCl+10.0μM Hm+1.0μM CaCl2；Hm 1.0，0.1M NaCl+1.0μM Hm+1.0μM CaCl2；Hm 0.1，0.1M NaCl+0.1μM Hm+1.0μM CaCl2，各处理溶液每天更换一次。结果表明，一定浓度范围的Hm能促进盐胁迫下水稻种子的萌发，其中以Hm1.0和Hm0.1的效果最为明显。例如，盐胁迫下水稻种子经Hm1.0处理36小时便开始萌发，比对照提前约6小时；处理48小时后，种子的根长、根数和芽长均明显超过对照。与对照相比，经Hm 1.0和Hm 0.1处理48小时后，水稻种子的发芽势分别提高了59.2％和39.4％，发芽率分别提高了33.3％和23.8％，发芽指数也分别提高了50.4％和34.8％(表3和表4)。此外，Hm 1.0处理还显著提高了盐胁迫下水稻种子萌发过程中淀粉酶的活性，增加了还原糖与可溶性总糖的含量(表5)。
实施例5采用1.0μM的Hemin处理0.1MNaCl盐胁迫下的“武育粳3号”水稻幼苗2天时，发现Hemin能够增强叶片的保绿水平，延缓叶绿素的降解速率，减少根系和叶片膜脂过氧化水平，降低丙二醛(MDA)的积累，并且该浓度的Hemin(+Hm)可以通过增强水稻幼苗的抗氧化能力来行使其对盐胁迫下植物细胞氧化损伤的保护作用。例如叶片CAT(过氧化氢酶)、APX(抗坏血酸过氧化物酶)、POD(过氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)等抗氧化酶的活性分别比对照(无Hemin的有盐培养液，-Hm)提高了263.5％、45.9％、170.0％和78.5％(表6A)，而根系的APX、POD和SOD活性分别提高了150.4％、108.9％和145.7％(表6B)。
实施例6试材为切花月季“影星”购于南京市的园艺场。在1小时内运回实验场所，复水2小时，挑选开花级数为2的鲜花，处理前修剪枝叶，只保留两片复叶，花枝长30cm。每瓶插5枝，每组处理30枝，重复3次，瓶插液250mL，室温为25～30℃，相对湿度35～60％，并在散射光下进行实验。各种瓶插液处理设置如下CK(对照)蒸馏水；Hm0.10.1μM Hemin；Hm0.010.01μM Hemin；Hm0.0010.001μM Hemin；SA1.0μM水杨酸(切花保鲜剂中常见的抗氧化剂)；Hm0.01+SA0.01μM Hemin+1.0μM水杨酸；Hm0.001+SA0.001μM Hemin+1.0μM水杨酸。所用化学试剂均直接添加到瓶插液中，且对瓶插液所用的瓶子进行密封处理。结果发现，Hm0.01+SA处理的效果最好，比对照(6.1天)平均延长切花瓶插寿命4.4天，并与处理6天后开花级数的缓慢增长相一致，但对花径增大率则没有明显影响；Hm0.01的处理效果也比较好，与对照相比平均延长了4.1天(表7)，表明低浓度的Hemin和SA的组合处理(Hm0.01+SA)可以作为切花保鲜剂。
实施例7将Hemin配制成不同浓度(0.1、1.0和10.0μM)的溶液，在上海大棚甜瓜种植区进行Hemin灌溉试验，品种为西薄洛托，试验小区面积为100m2。Hemin处理是连续60天，每天1～3次。结果表明，Hemin处理明显促进甜瓜产量的提高，并改善果实品质。与对照(CK)相比，上述Hemin浓度的处理小区平均单产分别增加21.5％，37.1％和16.4％，果实可溶性固形物增加7.2％，12.7％和-1.2％(表8)。
实施例8供试番茄砧木品种为LS-89(江苏省农科院提供)。番茄砧木采用50孔穴盘育苗，按常规方法管理。育苗期间的平均昼夜温度为25.6℃/15.8℃。幼苗长至8叶1心时，移入光强300μmol·m-2·s-1、光周期12小时/12小时的光照培养箱内，先在昼夜温度为15℃/10℃的条件下预处理2天，再置于昼夜温度为10℃/5℃下进行处理。处理过程中，每隔3天取样一次，每品种每次取10株，重复3次。另Hemin配制成不同浓度(0.1、1.0和10.0μM)的溶液。与对照(CK)相比，第12天上述Hemin浓度处理番茄砧木后的冷害指数分别比对照下降21.7％，38.4％和20.2％(表9)。
实施例9采用江苏省广泛栽培的优质粳稻品种“武育粳7号”，取成熟饱满的水稻种子去颖壳，用75％酒精浸泡30秒，再用20％NaClO4灭菌30分钟，无菌水清洗7～8次，最后用无菌水浸泡4～5小时，将种子置于无菌滤纸上吹30分钟，取胚接种在诱导培养基上，待3周后诱导出米黄色的愈伤组织，取愈伤组织接种在分化培养基上一定的时间后用于生根培养。同时在生根培养基中加入Hemin，使其终浓度分别为0.1、1.0和10.0μM。结果发现与对照相比，上述Hemin处理的水稻愈伤组织，其生根率分别增加20.9％、28.4％和5.7％，同时前两种浓度处理显著地提前了水稻愈伤组织发根，分别提前了1.9天和3.7天(表10)。
实施例10将Hemin配制成不同浓度(0.1、1.0和10.0μM)的溶液，并与“灭铃皇(10克/公顷)”复配杀虫剂配制成混合溶液。通过不同浓度的Hemin溶液的喷雾处理来研究转Bt基因棉对棉铃虫幼虫的抑制生长作用，实验品种为美国Monsanto公司的抗虫棉品种“保铃棉32B”。对3龄幼虫抗性测定结果表明，取食32B嫩叶3天后，Hm0.1、Hm1.0和Hm10.0处理的幼虫取食量、体重比、相对生长率及粗生长效率较取食对照棉(CK，泗棉3号)后有明显以处理浓度依赖性的形式减退。上述结果表明，Hemin处理后转Bt基因棉对棉铃虫的抑制生长作用增强(表11)，表明Hemin可以有效地作为杀虫剂的增效剂。
实施例11试验地点在云南省华宁县，供试品种为云烟87，防治对象为烟草花叶病毒病(TMV)。对照用清水喷施，将Hemin配制成不同浓度(0.1、1.0和10.0μM)的溶液为其它处理，分别记作CK、Hm0.1、Hm1.0和Hm10.0。在烟苗移栽后还苗时开始施第一次药剂，以后每隔8天施一次药，连续用药3次。调查各小区的全部烟株。按病害严重度0～4级分级标准，分别记载各处理的总株数、各级病株数，并计算病情指数和防治效果。在施药后第8、16和24天调查各处理烟株药害情况。大田结果显示，不同浓度的Hm处理液可以有效的提高烟草抗烟草花叶病毒的能力，其中以Hm0.1处理最为显著，第24天的防治效果高达76.1％(表12)，同时黄酮类化合物含量也明显升高(具体数据未列)。
实施例12将Hemin配成浓度为0.1、1.0和10.0μM的溶液。在山东省潍坊市高密市豌豆种植区进行Hemin应用试验，豌豆品种箭舌豌豆881由山东省农科院提供，试验小区面积为100m2。结果表明，豌豆幼苗叶片的SOD活性对低浓度Hg具有应激性诱导效应，在10μM HgCl2浓度下活性升高12.8％，加入Hemin(0.1和1.0μM)后其活性随Hemin浓度升高而进一步上升。此外，与单独Hg处理(对照)相比，超氧阴离子产生速率、丙二醛含量和细胞膜透性在一定范围内随Hemin的浓度升高而下降，其中1.0μM的Hemin处理(Hm1.0)效果最好(表13)。
实施例13配制浓度为0.1M NaCl的0.6％琼脂溶液，分别装于100ml的玻璃烧杯中，每个处理重复3次。待琼脂溶液冷却并凝固后，将分别用0.1、1.0和10.0μM的Hemin(Hm，Fluka公司生产，均包含100μM的CaCl2)溶液浸种48小时的“武育粳3号”水稻种子随机选出，插入琼脂中，每个烧杯放置12粒种子，接着将烧杯放入周转箱中，在人工气候箱(温度30℃，湿度70％)中生长。盐胁迫5天后，水稻幼苗的生长受到明显抑制，表现为生长速率下降，株高降低，发根数减少、根长变短；而采用0.1和1.0μM的Hm浸种可以不同程度的缓解盐胁迫对水稻幼苗生长造成的抑制作用，促进幼苗株高的增加、幼叶形成以及根的生长和伸长，而10.0μM的Hm处理相对不明显。例如，1.0μM的Hm处理后的幼苗地下部和地上部的干重以及根冠比分别比对照增加了48.1％、25.8％和17.8％。另一方面，1.0μM Hm处理的幼苗籽粒质量也明显下降，暗示低浓度的Hm也可以加速水稻种子贮藏物质的降解，上述结果表明低浓度的Hm处理可以提高水稻幼苗的耐盐性。
实施例14取三叶一心的小麦(扬麦158)植株的第2片叶片，先用0.01和0.1μM的Hemin以及蒸馏水(对照)在25℃黑暗条件下预处理24小时，再用10mg/L的Paraquat(百草枯)或150mM的H2O2在25℃黑暗条件下处理3小时。发现，对照样品产生明显的氧化损伤，而Hemin处理的叶片受损较轻或几乎不受损伤。同时，0.01和0.1μMHemin处理的叶绿素含量比对照高出了12.15％和26.10％；小麦叶片中CAT、POD、APX和SOD的活性明显升高，MDA含量也明显降低，说明Hemin预处理有效提高了小麦叶片的抗氧化能力，Hemin可以作为包括Paraquat和Diquat等诱发活性氧过量产生类型除草剂的保护剂。
实施例15蕃茄在0.5％的次氯酸钠中浸泡20分钟，冲洗后在水中培养3天。种子根长至2～3mm时移至含滤纸和4ml不同处理液的培养皿(60mm直径)中培养，并进一步在25±1℃和14小时/10小时(LD)光周期，200μmol·m-2·s-1光强条件下培养。经过5天的处理后，测量主根长和侧根数(以侧根长＞1mm作为相关的指标)。结果发现，Hemin在1～40μM浓度范围内均能诱导番茄侧根发生，与清水处理(对照，CK)相比有显著的促根效应，尤其是浓度为1.0μM的Hemin处理后的番茄，其侧根的数目是对照(CK)的两倍；而在浓度超过50μM后，Hemin则对侧根生长有明显的抑制现象。
实施例16供试材料为“玉露”桃果实，采自浙江省奉化市，在果实底色转白期(约7成熟)采收。采收当天运回实验室，挑选大小均匀的果实进行处理，每一处理果实60公斤。各种处理如下(1)水浸果5分钟作为对照；(2)1.0μM的Hemin浸果5分钟作为处理。处理后贮藏于20℃下，定期测定果实的成熟进程及其相关生理指标。结果发现Hemin处理可以延缓桃果实老化进程，降低采后果实细胞膜透性的增加速率，果实的硬度比对照要提高30％以上，延迟乙烯的释放，同时ACC合成酶活性和ACC的累积也被明显抑制(P＜0.05)；此外，电子传递链的活性也被明显抑制，从而有效降低活性氧的产生。上述结果表明，一定低浓度的Hemin可以作为水果贮藏的保鲜剂，适当延长货架期。
实施例17在长安10号板栗雄花序长出7～10支(最长的花序约5～6cm)时喷布终浓度分别为1000μM的Hemin和CaCl2的混合溶液，结果率增加48％～202％，魁栗增产165％；同时处理60天后使雄花数量减少而且变短，使原采后再形成的幼果(俗称二次果)能提前正常发育，形成产量；叶片中的叶绿素含量增加26.7％以上，光合作用强度从7.19μmol CO2m-2.s-1增加到17.11μmol CO2m-2.s-1，从而提高了光合生产能力；板栗叶片中形成的光合产物如可溶性总糖、蔗糖和淀粉的速率分别比对照(喷布水)提高了59.0％、240％和93.0％。
实施例18用Hemin控制蔬菜花性别，提高产量。在秋大棚黄瓜品种“津优11号”的4片真叶时，用1000μM的Hemin喷洒叶面，能明显地增加雌花数，提高瓜秧的抗病、抗冻能力。由于雌花数增加，早期产量和总产量可以分别增加43％以上。在人头南瓜有3～4片真叶时，用1000μM的Hemin溶液喷洒植株，每10～15天喷1次，共喷3次，可以增加雌花数，并提早成熟10～20天，总产增加30％左右。
表1.不同浓度的Hemin对渗透胁迫下小麦种子萌发率及根长的影响 (*和**分别代表与处理(P)相比差异达到显著以及极显著水平，p＜0.05或p＜0.01) 表2.CO供体Hemin及其合成抑制剂ZnPPIX、清除剂Hb对渗透胁迫2天时的小麦种子萌 发过程中储藏物质降解及淀粉酶活性的影响 (*表示与处理(P)相比达到p＜0.05的差异显著水平) 表3.Hemin处理2天对盐胁迫下水稻种子萌发的影响 *和**分别代表与CK相比差异达到显著以及极显著水平，P＜0.05或P＜0.01，表4和5同表3b 表4.Hemin处理2天对盐胁迫下水稻幼苗生长的影响 表5.Hemin(处理2天)对盐胁迫下水稻种子萌发过程中淀粉酶活性、还原糖和可溶性总糖含量的影响 表6.1.0μM的Hemin对盐胁迫2天时水稻叶片(A)和根系(B)抗氧化酶活性 (SOD活性为U·g-1DW，其它为μmol·min-1·g-1DW)的影响 (A) (B) *和**分别代表与-Hm处理相比差异达到显著以及极显著水平，P＜0.05或p＜0.01 表7.不同浓度的Hemin处理对切花月季“影星”瓶插寿命的影响 **代表与对照(CK)处理相比差异达到极显著水平，p＜0.01 表8.不同浓度的Hemin处理对甜瓜产量及品质的影响 表9.不同浓度的Hemin处理对番茄砧木冷害程度的影响 表10.不同浓度的Hemin处理对水稻愈伤组织生根的影响 表11.不同浓度Hemin处理转Bt基因棉32B对棉铃虫的抑制生长作用 表12.不同浓度的Hemin处理对大田烟草抗烟草花叶病毒(TMV)能力的影响 表13.不同浓度的Hemin处理3天对Hg胁迫下豌豆幼叶抗氧化能力的影响 *超氧阴离子产生速率、丙二醛含量和细胞膜透性以对照(CK，单独Hg处理)作为100％
权利要求
1、一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂含有氯化血红素，配制成溶液后氯化血红素的有效终浓度为0.001～1000μM。
2、根据权利要求1所述的一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂配制成溶液后还含有终浓度为0～1000μM的Ca2+或终浓度为0～1000μM的水杨酸或0～1000μM的其它农用化学品。
3、根据权利要求1或2所述的一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，其特征是，该植物生长调节剂能诱导植物体内逐步释放总浓度≤1000ppm的一氧化碳气体。
4、权利要求1或2所述一种含有氯化血红素的植物生长调节剂的应用，其特征在于采用权利要求1或2所述的一种含有氯化血红素的植物生长调节剂对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以提高非生物或生物胁迫耐受性或抗性，并改善各种农艺性状或代谢功能；连续处理1～60天，每天1～3次。
5、根据权利要求4所述的植物生长调节剂的应用，其特征是，所述植株、植物组织和种子，包括种植在大田和温室的单子叶植物、双子叶植物或裸子植物以及经遗传修饰生物体的植株、组织和种子；
各种非生物胁迫，包括盐害、渗透胁迫、干旱和渍水胁迫、冷害、热激、紫外线照射、臭氧、创伤、金属毒害、除莠剂的过量或错误使用，而生物胁迫包括各种虫害和病原菌侵染；
所述各种农艺性状和代谢功能以及非生物/生物胁迫耐受/抗性，是指在播种、萌发、生根、生长、移栽、枝插、分蘖、开花、果实形成与成熟、组织培养的各种发育与生产阶段，以及各种天然或人为导致的生物与非生物胁迫条件下，包括诱导α/β淀粉酶活性从而缓解各种胁迫对种子萌发的抑制以及提高正常条件下种子萌发率以及打破休眠、延缓老化和衰老进程、延长货架期、诱导侧根和不定根的发生、上调各种抗氧化酶基因表达和合成以及酶活性的提高、下调各种活性氧产生系统的运转速度、延缓脂质过氧化产物的生成、诱导植物叶片的气孔关闭以及保绿作用、提高地上/地下部组织的干鲜重以及伸长/生长速率、增加农作物产量和改善品质、增强植物的抗病性和抗虫性、重金属抗性以及诱导脯氨酸、黄酮类化合物以及植保素的合成。
6、一种氯化血红素用于植物生长调节的方法，其特征是，
1)配制含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液该溶液中氯化血红素有效终浓度为0.001～1000μM；
2)用含有氯化血红素的植物生长调节剂溶液对植株、植物组织或种子进行灌溉、喷洒、浸泡或浸种处理，或者直接加进包含上述植物材料的培养基，以改善各种农艺性状或代谢功能以及非生物或生物胁迫耐受性或抗性；连续处理1～60天，每天1～3次。
7、根据权利要求6所述的氯化血红素用于植物生长调节的方法，其特征是，配制的含有氯化血红素的溶液中还含有终浓度为0～1000μM的Ca2+或终浓度为0～1000μM的水杨酸或0～1000μM的其它农用化学品。
全文摘要
本发明是一种含有氯化血红素的植物生长调节剂，属于植物生长调节物质的开发与利用领域。包括用含有终浓度为0.001～1000μM氯化血红素(Hemin)的植物生长调节剂，对植株、植物组织和种子进行灌溉、喷洒或浸泡等处理，连续1～60天，每天1～3次，可以促进植物生长和形态建成，加快种子萌发，提高抗氧化能力以及改善抗/耐逆性。由于氯化血红素价格低廉，且植物体内含有相关代谢机制，因此该法还具有无污染、环保、低成本和应用范围广的特点，适用于农田化学调控、种源农业、组培、果蔬贮藏以及切花保鲜等领域。
文档编号A01P21/00GK1934944SQ200610097240
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者沈文飚, 黄丽琴, 沈晋良, 凌腾芳, 宣伟, 徐晟 , 叶茂炳, 邵苏宁, 黄本开, 顾克余, 刘开力, 刘雅辉, 曹泽彧, 萨支圣, 韩毅, 谢彦杰, 刘辉 申请人:南京农业大学