专利名称：一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速 繁殖方法。
背景技术：
石斛是传统名贵中药，具有很好的疗效，根据《中国药典》2005版的记载，石斛具有益 胃生津，滋阴清热的功效，还有利咽明目，调节人体免疫力的作用。可作药用的石斛属植物 有30多种，其中铁皮石斛("e/3rfraW"历c朋必c/咖Wa11. ex Lindl)最为名贵，它又称黑节 草，民间称其为救命仙草，医学界称其为药界大熊猫。由于使用量的增加，以及资源的短缺， 其价格不断飚升，目前干品的价格己经到了每公斤2万多元。在利益驱动下，产区药农对野 生铁皮石斛资源毁灭性采挖，加之铁皮石斛繁殖率低，生长缓慢等特点，己经处于极度濒危 状态，我国政府已将野生石斛资源列入国家二类保护植物。国家鼓励开展应用生物技术进行 铁皮石斛大规模繁殖的研究，以保障其资源的可持续利用。
铁皮石斛的种子极其细小，在自然界很难萌发，野生苗基本上依靠无性繁殖的方法繁殖 后代。但是种子可以在无菌条件下萌发，经过原球茎阶段形成植株。我们使用显微镜调查发 现，铁皮石斛每个蒴果内的种子量非常巨大，为4万粒左右。使用种子繁殖组培苗较其它方 法具有以下优势有性繁殖可以保证具有优良性状，操作简便，成苗速度快， 一定时间内获 得优质种苗的数量巨大，能满足快速繁殖的需要。
关于铁皮石斛的组织培养和无性繁殖已有相关研究报道，但绝大部分的培养方法都添加 了激素以促进植株的分化和生长，并且研究内容不系统。激素的长期应用，会导致组培苗的 优良性状发生退化或变异。作为药用植物来说，外源激素的使用不利于人的健康。此外，报 道中使用的组织培养方法操作复杂，费用昂贵，且需要的人员多，占用空间大。本发明使用 的培养方法操作简便，费用低廉，不需要对组培苗进行频繁继代，较好的解决了以上问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖的方法。该方法操作 简便，成本低廉，培养过程中不使用激素，较好地解决了目前普遍存在于铁皮石斛组织培养 过程中的培养成本高和大量使用激素这两方面问题。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案
1、 种子的无菌萌发
采摘铁皮石斛的果实，进行表面消毒处理；将种子播种在常规石斛无菌萌发培养基上诱 导种子无菌萌发。
2、 原球茎及种苗的诱导和培养播种后的培养瓶置于原球茎及种苗诱导条件下培养，培养条件为温度10-27°C，光照 可以为红光，绿光，无光，黄光，蓝光；种子萌发形成原球茎或种苗。
3、 无菌苗的生根
根据需要，将上述条件下培养的种苗转移到诱导生根的条件下培养，以获得大量性状优 良的无菌苗；诱导生根的培养条件为自然光或日光灯，每日光照8-24小时，光照强度 500-6000Lx;培养温度为10-30°C。
4、 无菌苗的增殖及壮苗培养
生根的无菌苗可以经过增殖、壮苗程序获得大量无菌苗；也可以直接在壮苗培养基中进 行壮苗；
增殖方法为在以下两种培养基中交替培养，在每种培养基上的培养周期均为3-6个月，
交替l-2次；两种培养基的组成分别为①N6培养基，蔗糖，琼脂；②N6培养基，蔗糖，琼
脂，天然附加物；
增殖和壮苗培养的培养条件均为自然光或日光灯，每日光照8-16小时，光照强度为
1000-6000Lx，培养温度为10-3(TC，继代周期为3-6个月，最终获得壮苗； 壮苗培养基组成为N6培养基，蔗糖，活性碳，琼脂，天然附加物。
5、 无菌苗的练苗及移栽
壮苗培养后的无菌苗，经过练苗，即可出瓶移栽；
练苗方法为先将培养瓶从壮苗培养条件转移到遮荫和自然变温的条件下，放置7-14天； 然后打开培养瓶的瓶口，再放置2-4天；
出瓶移栽的方法为无菌苗出瓶后，用自来水洗净培养基后，栽种到花盆或育苗盘或苗
圃中；栽种基质为碎石块木块或树皮水苔=1-3:卜2: 0. 3-1;栽种后要保持环境通风、 遮阳，湿度60%-90%;按时浇水，待苗成活，长出新根、新叶后即可移栽大田。
上述方法中，无菌苗增殖所用的两种培养基的组成，按重量百分比分别为
(1) N6培养基,蔗糖40-60g/L， pH5.5-6.0，琼脂7-15g/L;
(2) N6培养基，蔗糖40-60g/L， pH5. 5_6. 0，琼脂7-15g/L，在此培养基上添加天然附 加物，天然附加物可以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60-200g/L，番茄 汁50-150g/L，绿豆汁50-200g/L;
上述方法中，壮苗培养基的组成，按重量百分比分别为
N6培养基，蔗糖40-60g/L，活性炭0.5-3g/L， pH5. 5-6. 5,琼脂7-15g/L，天然附加物 可以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60-200g/L,番茄汁50-150g/L，绿 豆汁50-150g/L;
与以往的铁皮石斛无菌苗快速繁殖技术相比，本发明采用的技术方法具有以下优点
(1) 操作步骤简便，节省人力、物力，生产成本低，便于规模化、工业化应用。
(2) 由于种苗能够周期性提供，可以满足工业化生产所要求的连续性生产流程。(3)整套技术采用无激素培养，有利于保持种苗的优良形状，提高其药用价值，同时， 由于免除了脱激素的生产环节，使操作变得更简单。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。但本发明的内容并不仅仅局限于此。 实施例1:
自广西南宁采集的铁皮石斛的蒴果，表面消毒后，获得无菌种子，种子播种在无菌萌发
固体培养基表面，培养基组成为KC培养基，添加蔗糖20g/L、香蕉150g/L，煮20分钟后 取汁加入培养基中，琼脂为9.0g/L， pH5.2。培养瓶置于温度为20-25°C，光照为蓝光的原球 茎及种苗诱导条件下培养。
在上述条件下培养5个月后，种子萌发形成幼苗，取出部分已经播种的三角瓶转移到诱 导生根的条件下培养，培养条件为光照由日光灯产生，每日光照10小时，光照强度为1500Lx， 培养温度为25土2。C，培养4个月诱导形成有根的健壮无菌苗。
将有根健壮无菌苗采用增殖方法增殖培养，增殖方法为在以下两种培养基中交替培养， 培养条件为光照由日光灯产生，每日光照10小时，光照强度为1500Lx，培养温度为20-25 °C，培养周期为4个月，培养基的使用依次为A培养基，B培养基，然后幼苗发生分化和增 殖；两种培养基组成如下.
A培养基:N6培养基，蔗糖50g/L， pH5.8，琼脂10. 5g/L;
B培养基N6培养基，蔗糖50g/L，琼脂9.0g/L， pH5.8，天然附加物为香蕉100g/L, 番茄80g/L，分别煮20分钟后取汁加入培养基中。
生长出增殖的小苗后进行壮苗培养，壮苗培养的条件为光照由日光灯产生，每日光照 IO小时，光照强度为1500Lx，培养温度为20-25'C，壮苗培养基为N6培养基，蔗糖50g/L， 活性炭2g/L，琼脂9.5g/L， pH5.8，香蕉200g/L，绿豆80g/L，煮20分钟后取汁加入培养基 中，最终获得壮苗。
无菌苗在自然光及自然变温条件下练苗10天，然后再打开瓶口练苗3天。无菌苗出瓶后，
用自来水冲洗干净培养基，栽种到育苗盘中。基质为碎石块木块水苔=1: 2: 0.5。栽
后将育苗盘放置在通风、遮阳网遮光的温室中，湿度控制在75%_85%，温度为20-25r。每周 浇水一次。待苗成活并长出新根、新叶后即可大田移栽。移栽地为云南西双版纳铁皮石斛适 生地盖有遮阳网的简易温棚内，移栽成活率达到了 92.3°/。。 实施例2:
自广西南宁采集的铁皮石斛的蒴果，表面消毒后，获得无菌种子，种子播种在盛有无菌 萌发固体培养基的容器中，培养基组成为大量元素减半的MS培养基，添加蔗糖30g/L，肌 醇100mg/L，椰子汁100g/L， pH5.8，琼脂9.0g/L。培养条件为温度15-25。C，光照为黄光。
在上述条件下培养IO个月后，种子萌发形成具有3片叶的幼苗，取出部分培养容器转移 到诱导生根的条件下培养，培养条件为自然光照，每日光照8-10小时，光照强度为2000-2500Lx，培养温度为20_25°C，培养3个月诱导形成有根无菌苗。
将诱导得到的有根无菌苗转接到壮苗培养基中壮苗培养，壮苗培养基为N6培养基，蔗 糖50g/L， 土豆150g/L，番茄80g/L，煮20分钟后取汁加入培养基中，活性炭2g/L，琼脂 9.5g/L， pH5.8。得到粗壮种苗后即可进行练苗移栽，练苗移栽方法同实施例l。 实施例3: '
自贵州赤水采集的经人工授粉后生长的铁皮石斛的蒴果，表面消毒后，获得无菌种子， 种子播种在盛有无菌萌发固体培养基的容器中，培养基组成为B5培养基，添加50g/L的蔗 糖，琼脂9.0g/L， pH5.8;培养条件为温度15-25°C，无光照培养。培养2个月后，种子萌 发形成原球茎，然后把培养容器转移到绿光环境中继续培养，温度为20-25'C。
培养5个月后，取出部分培养容器转移到诱导生根的条件下培养自然光照，每日光照 8-10小时，光照强度为2000-2500Lx，培养温度为20-25°C，培养4个月诱导形成有根无菌 苗。
将上述有根无菌苗继代到壮苗培养基中N6培养基，添加蔗糖50g/L，活性炭2g/L，琼 脂9.5g/L， 土豆150g/L，绿豆100g/L，煮20分钟后取汁加入培养基中，pH5.8。形成壮苗 后进行练苗移栽，练苗移栽方法如下
无菌苗在自然光及自然变温条件下练苗12天，然后再打开瓶口练苗1天。无菌苗出瓶后，
用自来水冲洗干净培养基，栽种到花盆中。基质为碎石块树皮水苔=2: 2: 0.5。栽后
将花盆放置在通风、遮阳网遮光的温室中，湿度控制在70%-80%,温度为20-25'C。每周浇水 一次。待苗成活并长出新根、新叶后即可大田移栽。移栽地为云南西双版纳铁皮石斛适生地 盖有遮阳网的简易温棚内，移栽成活率达到了90.6%。 实施例4:
自广西南宁采集的经人工授粉后生长的铁皮石斛的蒴果，表面消毒后，获得无菌种子， 种子播种在无菌萌发固体培养基表面，培养基组成为N6培养基，添加50g/L的蔗糖，琼脂 9.0g/L， pH5.8。培养瓶置于温度为15-20°C，光照为红光的条件下培养。
在上述条件下培养12个月，种子萌发形成幼苗，取出部分培养瓶转移到诱导生根的条件 下培养光照培养，光照由日光灯产生，每日光照10小时，光照强度为1500Lx，培养温度 为20-25'C，培养2个月诱导形成有根的无菌苗。
将诱导得到的有根无菌苗采用增殖方法增殖培养在以下两种培养基中交替培养，培养
周期为4个月，培养基的使用依次为A培养基，B培养基，然后幼苗发生分化和增殖；两种 培养基组成如下
A培养基:N6培养基，蔗糖50g/L， pH5.8，琼脂10.5g/L;
B培养基N6培养基，蔗糖50g/L，琼脂9. 0g/L，天然附加物为土豆150g/L，番茄80g/L， 分别煮20分钟后取汁加入培养基中，pH5.8。
生长出增殖的小苗后进行壮苗培养，壮苗培养基为N6培养基，添加蔗糖50g/L，活性炭2g/L，琼脂9.5g/L,香蕉200g/L，绿豆80g/L，煮20分钟后取汁加入培养基中，pH5. 8。
获得壮苗后进行练苗移栽，练苗移栽方法如下
无菌苗在自然光及自然变温条件下练苗7天，然后再打开瓶口练苗2天。无菌苗出瓶后， 用自来水冲洗干净培养基，栽种到苗床上。基质为碎石块树皮水苔=2: 2: 0.5。栽后
注意通风，用单层遮阳网遮光，湿度控制在75%-85%，温度为18-26°C。每周浇水一次。待苗 成活并长出新根、新叶后即可大田移栽。移栽地为云南西双版纳铁皮石斛适生地盖有遮阳网 的简易温棚内，移栽成活率达到了92.5%。
权利要求
1.一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法，包括步骤(1)种子的无菌萌发采摘铁皮石斛的果实，进行表面消毒处理；将种子播种在常规石斛无菌萌发培养基上诱导种子无菌萌发；(2)原球茎及种苗的诱导和培养播种子后的培养瓶置于原球茎及种苗诱导条件下培养，培养条件为温度10-27℃，光照为红光，绿光，无光，黄光，蓝光；种子萌发形成原球茎或种苗；(3)无菌苗的生根根据需要，将上述条件下培养的种苗转移到诱导生根的条件下培养，以获得大量性状优良的无菌苗；诱导生根的培养条件为自然光或日光灯，每日光照8-24小时，光照强度500-6000Lx；培养温度为10-30℃；(4)无菌苗的增殖及壮苗培养生根的无菌苗可以经过增殖、壮苗程序获得大量无菌苗；也可以直接在壮苗培养基中进行壮苗；增殖方法为在以下两种培养基中交替培养，在每种培养基上的培养周期均为3-6个月，交替1-2次；两种培养基的组成分别为①N6培养基，蔗糖，琼脂；②N6培养基，蔗糖，天然附加物，琼脂；增殖和壮苗培养的培养条件均为自然光或日光灯，每日光照8-16小时，光照强度为1000-6000Lx，培养温度为10-30℃，继代周期为3-6个月，最终获得壮苗；壮苗培养基组成为N6培养基，蔗糖，活性碳，天然附加物，琼脂；(5)无菌苗的练苗及移栽壮苗培养后的无菌苗，经过练苗，即可出瓶移栽。
2、 根据权力要求1中所述的方法，其特征在于无菌苗增殖方法中所用的两种培养基的组成，按重量百分比计分别为(1) N6培养基，蔗糖40-60g/L， pH5. 5-6.0，琼脂7-15g/L;(2) N6培养基，蔗糖40-60g/L， pH5. 5-6. 0，琼脂7-15g/L，在此培养基上添加天然附 加物，天然附加物可以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60-200g/L，番茄 汁50-150g/L，绿豆汁50-200g/L。
3、 根据权力要求1中所述的方法，其特征在于壮苗培养基的组成，按重量百分比计分别为N6培养基，蔗糖40-60g/L，活性炭0.5-3g/L， pH5. 5-6. 5，琼脂7_15g/L，天然附加物可 以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60_200g/L，番茄汁50-150g/L，绿豆 汁50-150g/L。
4. 根据权力要求1中所述方法，其特征在于无菌苗的练苗方法可以为先将培养瓶从壮苗培养条件转移到遮荫和自然变温的条件下，放置7-14天；然后打开培养瓶的瓶口，再放置 2-4天。
5.根据权力要求1中所述方法，其特征在于出瓶移栽的方法为无菌苗出瓶后，用自来 水洗净培养基后，栽种到花盆或育苗盘或苗圃中；栽种基质为碎石块木块或树皮水苔=1-3: 1-2: 0.3-1;栽种后要保持环境通风、遮阳，湿度60%-90%;按时浇水，待苗成活， 长出新根、新叶后即可移栽大田。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法，内容包括铁皮石斛种子的无菌萌发，原球茎及幼苗的形成与保存，无菌苗的生根、增殖和壮苗培养，无菌苗的练苗和移栽。该项技术操作简便，占用空间小，生产成本低，便于大规模工业化生产应用。利用该项技术繁殖铁皮石斛，有利于保持种苗的优良性状，提高种苗使用的安全性。
文档编号A01C1/00GK101564008SQ20081009395
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者侯晓强, 房慧勇, 燕 李, 邢晓科, 郭顺星, 陈晓梅 申请人:中国医学科学院药用植物研究所