含有植物促生菌的生物制剂及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：含有植物促生菌的生物制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明关于一种微生物肥料，具体地说是一种植物促生菌以及生物制剂(微生物制剂)，尤其是含有多功能植物促生菌成分的生物制剂。
背景技术：
：微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制剂，应用于农业生产中能够获得特定的肥料效应。微生物肥料可分为两类，一类是通过其中所含微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，改善植物的营养状况，进而增加产量,代表品种是菌肥；另一类是广义的微生物肥料，其制品虽然也是通过其中所含的微生物生命活动作用使作物增产，但它不仅仅限于提高植物营养元素的供应水平，还包括了它们所产生的次生代谢物质，如激素类物质对植物的刺激作用，促进植物对营养元素的吸收利用，或者能够拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻病虫害而使作物的产量增加。微生物肥料的种类很多，如果按其制品中特定的微生物种类可分为细菌肥料(如根瘤菌肥、固氮菌肥)、放线菌肥(如抗生菌类、5406)、真菌类肥料(如菌根真菌)等；按其作用机理又可分为根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷菌类肥料、解钾菌类肥料等；按其制品中微生物的种类又可分为单纯的微生物肥料和复合微生物肥料。微生物肥料的功效主要是与营养元素的来源和有效性有关，或与作物吸收营养、水分和抗病有关，概括起来有以下几个方面l.增加土壤肥力，这是微生物肥料的主要功效之一如各种自生、联合、共生的固氮微生物肥料，可以增加土壤中的氮素来源，多种解磷、解钾微生物的应用,可以将土壤中难溶的磷、钾分5解出来,从而能为作物吸收利用。2.产生植物激素类物质剌激作物生长，许多用作微生物肥料的微生物可产生植物激素类物质，能刺激和调节作物生长，使植物生长健壮，营养状况得到改善。3.对有害微生物的生物防治作用由于在作物根部接种微生物肥料，微生物在作物根部大量生长繁殖，作为作物根际的优势菌，限制了其它病原微生物的繁殖机会。同时有的微生物对病原微生物还具有拮抗作用，起到了减轻作物病害的功效。我国微生物肥料的研究、应用和国际上一样，是从豆科植物上应用根瘤菌接种剂开始的，起初只有大豆和花生根瘤菌剂。20世纪50年代，从原苏联引进自生固氮菌、磷细菌和硅酸盐细菌剂,称为细菌肥料；20世纪60年代又推广使用放线菌制成的"5406"抗生菌肥料和固氮蓝绿藻肥；20世纪7080年代中期，又开始研究VA菌根，以改善植物磷素营养条件和提高水分利用率；20世纪80年代中期至90年代，农业生产中又相继应用联合固氮菌和生物钾肥作为拌种剂；近几年来又推广应用由固氮菌、磷细菌、钾细菌和有机肥复合制成的生物肥料做基肥施用。由此可见，我国微生物肥料种类很多，主要有以下种类根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷细菌肥料、硅酸盐细菌肥料、增产菌肥料、复合微生物肥料。综上所述，在农业生产中，仍然需要开发出同时可以促进植物生长，提高肥效和提高植物的抗逆能力如抗干旱、盐碱、药残(主要针对土壤沙漠化、盐碱化以及农药残留污染的生物治理和生态修复)能力的优质高效的生物制剂。
发明内容本发明以植物促生菌为主要功能成分，研发出一种植物促生菌和含有该植物促生菌的生物制剂(或者称为微生物制剂)，其为一种利用优筛训化多功能植物促生菌/^ewdomo"osc^H"aUW3禾B尸化wcfomo"osUW4生产的生物制剂，用于农业生产可以促进植物生长，提高产量，提高肥效(节肥)和提高植物的抗逆能力。200810181327.8本发明的目的在于提供了植物促生菌尸Mz^omo"oscedn'加UW3、i^e^fomo"os/Mri^UW4，该促生菌可以促进植物吸收营养、调节植物生长以及增强植物根系对营养及空间的竞争。本发明的目的在于提供一种含有植物促生菌的生物制剂，该生物制剂主要用于农业，可以达到促进植物生长，提高产量，提高肥效，节省肥料和提高植物的抗逆能力的效果。本发明的目的还在于提供一种制备含有植物促生菌的生物制剂的方法，采用该方法生产的生物制剂可以达到是植物促生长、高产、增效等效果。本发明的目的还在于提供一种含有植物促生菌的生物制剂在农业上促进植物生长方面的应用。为了达到上述目的和效果，本发明提供了一种植物促生菌Aw^fowo"wc^H"aUW3，在美国农业研究菌种保藏中心保藏，保藏编号为NRRLB-50192。本发明还提供了一种植物促生菌/^eWomo"^pw"^UW4，在美国农业研究菌种保藏中心保藏，保藏编号为NRRLB-50193。美国农业研究菌种保藏中心位于伊利诺伊州皮契里亚，是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定服务。美国农业研究菌种保藏中心英文全称AgriculturalResearchServiceCultureCollection,简称NRRL。本发明的提供的植物促生菌PseudomonascedrinaUW3，Pseudomonas是属名，cedrina是种名，UW3是Pseudomonascedrina种中的小种；本发明的提供的植物促生菌PseudomonasputidaUW4，Pseudomonas是属名，putida是种名，UW4是Pseudomonasputida禾中中的小禾中。7本发明的提供的植物促生菌UW3和UW4均已保藏在上述美国农业研究菌种保藏中心，UW3的保藏编号为NRRLB-50192，UW4的保藏编号为NRRLB-50193，该植物促生菌UW3和UW4的保藏日均为2008年6月9日。该促生菌具有促进作物生长，提高作物营养，增加肥料效果，可以提高抗旱、涝，抗盐碱能力，是促进作物根际解毒微生物生长的多功能菌菌种。本发明还提供了一种含有植物促生菌的生物制剂，该生物制剂包括植物促生菌的菌液和复合载体材料，其中，该植物促生菌的菌液为含有植物促生菌/^ewdo附o"oscecH"aUW3禾口i^ei^owowoyUW4的溶液，所述UW3禾口UW4的菌数比例为1-2:2-1，该复合载体材料包括有机质、腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂、包埋材料中任意两种或两种以上的组合，上述复合载体材料和菌液的比例为植物促生菌的菌数至少1亿/每克复合载体材料。本发明上述的生物制剂中，所述的复合载体材料包括1535X(w/w)的有机质、1232X(w/w)的腐殖酸、1232X(w/w)的腐熟有机质、522%(w/w)的络合置换剂以及0.01l%wt的包埋材料，以上重量百分比均以复合载体材料的重量(w/w)为100%计。上述生物制剂中植物促生菌的菌数一般达到至少1-20亿/每克复合载体材料，优选每克复合载体材料菌数为2亿或2亿以上，该生物制剂更优选为1-20亿菌数/每克复合载体材料；本发明的植物促生菌优选由/^e^fowo"wceA/""UW3和尸化w^mo"os/7w/z'^UW4组成；该菌的菌液为发酵菌液，一般1ml菌液中含有植物促生菌的菌数至少为10亿，例如可以含有20亿、40亿、60亿、80亿、100亿、甚至可达200亿或更高。上述生物制剂主要用于农业，可与作物根共生，以ACC(氨基环丙烷朔酸)为生存氮源可以达到促进植物生长，提高产量，提高肥效，节省肥料和提高植物的抗逆能力的效果。上述生物制剂的产品若为颗粒状，则该生物制剂的组成中还含有成粒剂，目的是制成颗粒状的微生物肥料。复合载体材料包括1535%的有机质、1232%的腐殖酸、1232%的腐熟有机质、828%的成粒剂、522。％的络合置换剂和0.011%的包埋材料，以上重量百分比均以复合载体材料的重量为100%计。本发明所述的有机质包括草炭(或称草木灰、草木炭)。所述的腐植酸(HumicAcid，简写HA)是动植物遗骸，主要是植物的遗骸，经过微生物的分解和转化，以及一系列的化学过程和积累起来的一类有机物质。其组成成分是由芳香族及其多种官能团构成的高分子有机酸，具有良好的生理活性和吸收、络合、交换等功能，广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及泥炭(又称草炭)、褐煤、风化煤中，本发明主要采用的是土壤腐植酸、水体腐植酸和煤炭腐植酸。所述的腐熟有机质是经过腐熟的农业上应用的有机质材料，所谓腐熟是将备足的有机质材料充分混合后平摊开，保持一定厚度(一般40厘米左右)，将需要的发酵菌(例如有机质原料发酵菌=5000:1)分成3分以上，与少量有机质原料拌匀后，再撒到已混合的有机质原料上，并做充分搅拌；将一定量的尿素溶于水中均匀拌入己混合的有机质原料中，使有机质原料的含水量达到60°/。左右；以上操作完成后进行自然堆放(堆的高度一般在80-100厘米，宽度应在100-150厘米，长度不限)，或自然状态装入袋中，温度由低到高再降到常温，测定水分含量适宜即证明有机质原料己充分腐熟，即为腐熟有机质。所述的本发明的生物制剂中还可以包括腐殖质，其是指新鲜有机质经过微生物分解转化所形成的黑色胶体物质，腐殖质是一种有机胶体，吸水保肥能力很强，吸水率高达400-600。％(—般粘粒吸水率为50-60%)，而保肥能力是粘粒的6-10倍，腐殖质既含氮、磷、钾、疏、钙等大量元素，还有微量元素，经微生物分解可以释放出来供作物吸收利用；另外，腐殖质是形成团粒结构的良好胶结剂，可以提高粘重土壤的疏松度和通气性，改变砂土的松散状态。同时，由于其颜色较深，有利吸收阳光，提高土壤温度，促进土壤微生物的活动，为微生物活动提供了丰富的养分和能量，又能调节土壤酸碱反应，因而促进土壤养分的转化，而且，在分解过程中产生的腐殖酸、有机酸、维生素及一些激素，对作物生育有良好的促进作用，可增强呼吸和对养分的吸收，促进细胞分裂，从而加速根系和地上部分的生长。一般情况下可将其划归为腐植酸中。所述的成粒剂英文名称是graphiteaggregate,是制成颗粒剂有机或无机或者有机无机复合肥料的常规辅料，属于本领域公知的辅料。所述的络合置换剂包括有机络合剂，例如酶解蛋白(或称酶解消化蛋白)或者无机置换剂，例如硫酸钙，或者二者的混合，其中，若络合置换剂为有机络合剂和无机置换剂的混合物，二者比例可以为51:1，即51重量份的有机络合剂和1份的无机置换剂共同组成本发明的络合置换剂。所述的包埋材料为有机大分子包埋材料，如甲基纤维素。本发明的生物制剂为含有植物促生菌的微生物肥料(微生物制剂)，具有以下特征和优势第一，优良的菌种组合植物促生菌尸化W^WW"Wce^7'"aUW3禾n尸^^/omowwUW4这两种优良的菌种组合在生理指标有互补性，能够使产品效果达到最佳，二者配合有很好的溶解性、利用率、转化和储存营养功效；对改善作物营养条件，提高化肥利用率和化肥生物有效率的效果十分明显。第二，本发明的复合载体材料形成菌剂利用廉价有机和无机复合载体材料形成生物菌剂的固体产品，方便储存，销售，运输和使用，保证菌种的数量和活性。在本发明的优选实施例中，所述的生物制剂的组成包括2030%的草炭、2025%的腐殖酸、2025%的腐熟有机质、1520%的成粒剂、1015°/0的络合置换剂(其中有机络合剂酶解(消化揮白为712%，无机置换剂硫酸钙38%)、0.05%的有机大分子包埋材料(如甲基纤维素)。其中，每克复合载体材料加发酵菌液(例如可以是0.030.08ml)达到15亿菌数，制粒后即可得到本发明的含有植物促生菌的生物制剂。本发明利用优筛训化多功能植物促生菌i^ez^owonoscedn>wUW3和尸"w^mowmpwfWaUW4生产生物制剂，用于农业生产中可以促进植物生长(提高产量)，提高肥效(节肥)和提高植物的抗逆能力如干旱、盐碱、药残(土壤沙漠化，盐碱化以及农药残留污染的治理和修复)。这种新的生物制剂和微生物肥料在作用机理上有原则上的不同，本发明利用植物根际促生菌，可大幅度地提高植物的抗逆性，促进作物生长，增加产量。本发明的植物促生菌特殊功能体现在以下几个方面1.促进植物营养功能。除了目前菌肥的功能溶磷，固氮外，本发明的植物促生菌可以生产嗜铁素(Siderophore)嗜铁和其他植物难以吸收的微量元素，提高作物营养。地球表面矿物含铁丰富，但土壤中能够直接为植物和微生物利用的铁却不多。土壤中铁的主要以三价铁(Fe+,状态存在，在pH为7.4时其溶解度为10"8M，此浓度下的铁一般无法满足土壤微生物繁衍和植物生长发育的需要。然而这些植物促生菌可分泌一种专门结合铁的小分子蛋白可从土壤中收集铁，这种物质被称为嗜铁素，铁一旦于嗜铁素相结合则形成可溶性"铁-嗜铁素"复合体，可通过植物和微生物细胞膜的特殊通道进入生物体内，氧化铁在体内还原后被释放并参与生物代谢。2.植物生长调节功能。植物组织的分化生长均依赖与其生物化学信号-植物激素的调节，这些激素可以来自于植物体内的自身分泌，称之为内源激素；亦可以来自于体外的其他来源，称之为外源激素。植物激素主要分为生长素、赤霉素和乙烯三大类，这些促生菌通过干扰植物的内源激素或提供外源激素而影响作物生长发育，植物促生菌主要通过调节植物生长素和乙烯水平来达到促进作物生长发育目的。1)植物促生菌利用植物根际的分泌物质，包括对植物生长有害的分泌物，转化有害的分泌物为对植物生长有利的生长激素如吲哚-3-乙酸(IAA)，提供给植物，促进植物生长发育。促进植物根系生长是植物促生菌的一个主要特征。植物根围的促生菌可合成吲哚3-乙酸并提供给植物根系，成为促进根系生长的外源吲哚3-乙酸。研究表明，低水平的吲哚3-乙酸(1(T9-10-12M)可促进植物初生根生长，而更高浓度的吲哚3-乙酸可促进植物次生根和不定根生长。无论初生根还是次生根与不定根的快速生长发育，都将使植物幼苗的根系吸收系统得到迅速的建立，从而使植物幼苗快速获得定植和同化环境的能力。2)植物促生菌调节和控制植物体内的植物生长抑制物质乙稀的产生。乙烯的正常生理功能是协助打破种子休眠、促进植物成熟和衰老。植物在一生大部分生长发育阶段只需很低水平的的乙烯，只是在接近成熟和衰老阶段才大量合成乙烯。然而，当植物在生长发育阶段如遇不良环境因素如干旱，高盐，有毒污染物、机械损伤或病虫害侵袭时会产生大量乙烯作为植物对环境的一种生理应激反应。乙烯的过量产生将导致植物生长发育受阻或死亡。在大多数农作物生产中大量乙烯的产生将导致农业生产遭受严重的经济损失。高等植物体内乙烯的合成途径为ACC(l-氨基环丙烷-l-羧酸)，经ACC氧化酶氧化后形成乙烯和氢氰酸。植物促生菌UW3和UW4可分泌ACC脱氨酶。这种酶可将植物乙烯前体ACC分解成为a-丁酮酸和氨。通过ACC脱氨酶，植物促生菌将ACC作为N源利用，从而可大大减少了植物有害乙烯的产生，促进植物的生长发育。3.这些植物促生菌(UW3，UW4)与植物根系的共生形成了很强的营养及空间竞争力。这些植物促生菌与植物根共生的关系在植物根或种子周围具有很强的营养及空间竞争能力，并通过此方式抑制病原菌的繁衍和发展。所述的竞争机制有(1)合成抗生素有效地抑制周围其他微生物的繁衍。(2)产生一系列低分子代谢物抑制病原真菌的生存和繁衍。(3)合成产生抗真菌酶类如几丁质酶，P-l,3葡聚酶，蛋白酶，脂肪酶等来消灭或抑制真菌。(4)通过植物促生菌的处理诱导植物系统抗病性能。本发明的生物制剂的具体指标如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>嗜铁素测定方法嗜铁素测定是基于嗜铁素对铁的高度亲和性的原理。利用含有S/Fe3+的染料HDTMA(hexadecyltrimethylammoniumbromide),当HDTMA中的Fe3+被更高度亲和性的化合物置换后，HDTMA的蓝色会变为桔黄色。当量的HDTMA加入定量的菌细胞溶液中，20小时后，利用分光仪检测630nrn光吸收值的变化，利用当量的HDTMA的标准曲线计算出HDTMA中的Fe3+被置换的当量，即是定量菌细胞可生产的嗜铁素的量(B.Schwyn&J.B.Neilands，1987Anal.Biochem.160pp47-56)。IAA测定方法促生菌细胞含有IAA合成酶，可利用L-色氨酸为底物合成IAA。IAA的测定是利用L-色氨酸为底物促生IAA合成。当量的L-色氨酸溶液加入定量的菌细胞溶液中，20分钟后，把菌细胞滤出，利用分光仪检测上清液在535nm光区吸收值的变化，利用IAA的当量标准曲线，计算出IAA产生的当量(C丄.Patten&B.R.Glick，2002AppliedEnviron.Microbiol.68-8pp3795-3801)。ACC脱氨酶测定方法促生菌细胞含有l-氨基环丙烷-l-羧酸的脱氨酶，分解l-氨基环丙垸-l-羧酸为氨基和丁酮酸。定量蛋白浓度的细胞溶液加入当量的ACC溶液中，20分钟后，加入2.4-DNP停止反应，利用分光仪检测在540nm光区吸收值的变化，利用的丁酮酸当量标准曲线，计算出丁酮酸产生的当量，而得知ACC脱氨酶的活性(D.M.Penrose&B.R.Glick,2003Physio.Plant118pp10-15)。本发明还提f共了植物促生菌尸wW(sfcwzo"(awcec/n'"aUW3禾口尸jewcfomo"asUW4的植物促生菌的菌液以及含有植物促生菌尸wwt/omo"oycetH"aUW3和尸化w^mo"wUW4的菌液的生物制剂的获得方法，该方法包括植物促生菌的菌液的制备和生物制剂的制备，该植物促生菌的菌液为含有植物促生菌尸sewcfomo"osce&f"aUW3禾口i^ewfo附owosUW4的溶液，所述UW3和UW4的菌数比例为1-2:2-1，该生物制剂为包括植物促生菌的菌液和复合载体材料(包括有机质、腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂、包埋材料中任意两种或两种以上的组合)的混合物，上述复合载体材料和植物促生菌的菌液的比例为植物促生菌的菌数至少1亿/每克复合载体材料。本发明的生物制剂的制备方法包括将含有植物促生菌/^wAmo"wcedn'mUW3和尸^w必wowospwfWaUW4的溶液，该溶液中UW3和UW4的菌数比例为l-2:2-1，与有机质、腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂以及包埋材料混合，再加入成粒剂，成粒，干燥，即得。本发明的植物促生菌UW3和UW4从土壤中与其他菌的分离原理是基于UW3和UW4含有ACC(l-氨基环丙烷-l-羧酸)脱氨酶，可利用ACC的氨基为氮源分离制备本发明的植物促生菌(UW3和UW4)的选择性平板培养基。上述生物制剂的制备方法其实质上包括植物促生菌的菌液UW3和UW4的分离制备，以及其后的生物制剂的制备两部分，具体为(1).取1克植物根际土壤，浸入50mlPAF提取溶液中，再置入250ml容器中；该PAF提取溶液为含有朊间质蛋白胨、干酪素水解物、MgS04、K2HP04和甘油的组合物溶液；(2).将上述含有50mlPAF提取溶液的三角瓶在25;t2。C下震荡；(3).取lml上述步骤(2)震荡后的PAF提取溶液，再溶入含有50mlPAF提取溶液的250ml容器中，在25去2'C下，震荡；(4).取1ml上述步骤(3)得到的PAF提取溶液，溶入含有50mlDF盐溶液的250ml容器中，在25玄2i:下震荡；该DF盐溶液为含有磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、葡萄糖、葡糖酸、柠檬酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、三氧化钼和硫酸铰的溶液；(5).取lml上述步骤(4)得到的提取溶液，再溶入50ml不含硫酸铵但含3.0niMl-氨基环丙烷-l-羧酸的上述DF盐溶液的容器中，在25拿2。C下震荡；(6).取0.01ml上述步骤(5)得到的提取溶液，接入含有0.03mMACC的DF盐的平板凝胶培养基上，在30;t2-C培养2-4天；(7).取步骤(6)的培养基上生长的菌落，其为植物促生菌尸化z^omo"wce<i/-/"aU"W3禾口i^ei^omowwpwdflbUW4的菌禾中；(8).取上述步骤7得到的菌种，接种在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在25;hTC温度下培养震荡24小时，得到培养溶液；(9).在4。C下离心步骤(8)的培养溶液；(10).用DF液冲洗步骤(9)离心沉淀的细胞；该DF液的成分包括蔗糖、琥珀酸、EDTA、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化镁；(11).在4。C下再离心步骤(10)得到的DF细胞溶液；(12).用DF盐液溶解离心沉淀的细胞，加入3.0mM的ACC，得到含菌细胞DF盐溶液；(13).步骤(12)得到的含菌细胞DF盐溶液，在25;h2'C下培养、震荡；(14).在4"C离心步骤(13)得到的DF培养溶液，得到离心沉淀的细胞；(15).用10mlDF盐液溶解步骤(13)得到的离心沉淀的细胞得到含菌细胞DF盐溶液；(16)潜步骤(15)得到的含菌细胞DF盐溶液于2財2'C接种发酵，得到工业发酵后的植物促生菌的菌液；上述植物促生菌的菌液中菌数达到20-30亿/ml;(17).将步骤(16)得到的植物促生菌的菌液与1535%的有机质、1232%的腐殖酸、1232%的腐熟有机质、522%的络合置换剂以及0.011%的包埋材料混合，再加入828%的成粒剂，通过造粒机成粒，干燥，得到本发明所述的生物制剂。在经过上述步骤(1)-(6)的分离后一般可得到的一个或者两个以及两个以上的单一菌落，每个特定形态的菌落在通过鉴定以前，可暂时认为其是单一的种或小种，UW3和UW4是其中2个。本发明的发明人利用16srRNA基因程序的方法来鉴定UW3和UW4的存在并将其分离(可再与基因库或者其他权威认证的Aew^wzowosce^7'wa种和尸化w必woww;wW"种的基因序列进行比对)。16srRNA基因程序的方法是本领域公知方法，16srRNA基因程序的具体方法可参见2006年4月1日科学出版社出版的《堆肥环境生物与控制》以及收载于2005年7月19日的《环境分子生物学技术》实验报告"用16SrRNA基因文库法鉴定土壤微生物(土壤总DNA提取)"一文。上述鉴定方法即可将本发明上述步骤(1)-(6)得到的与土壤中的其他菌分离出来的植物促生菌UW3和UW4确定为Pseudomonasputida属种和Pseudomonascedrina属禾中。从形态学上分析，UW4是粉色到桃红色的菌落群，UW3是奶油色的菌落群，因此，将UW3和UW4与其他菌借助16srRNA基因程序的方法来鉴定和分离出来后，凭借形态学的菌落特征，即可将UW3和UW4分离幵来。PseudomonasputidaUW3属于革兰氏阴性菌，为杆状的腐生营养的土壤细菌，16srRNA基因程序分析鉴定后，归于Pseudomonasputida属种(P.putidagroup)cPseudomonascedrinaUW4属于革兰氏阴性菌，为土壤中分离出的杆状的细菌，16srRNA基因程序分析鉴定后，归于Pseudomonascedrina属种(P.fluor6scensgroup)。也可再经过本领域常规的检测ACC脱氨酶的方法，鉴定上述步骤7得到的菌为本发明的植物促生菌UW3和UW4，UW3和UW4中含有ACC脱氨酶。上述的植物根际土壤为不受地理位置限制的任何区域的植物根际土壤。本发明的植物促生菌UW3和UW4与其他菌分离是基于UW3和UW4含有ACC(l-氨基环丙烷-l-羧酸)脱氨酶，可利用ACC的氨基为氮源制备植物促生菌UW3和UW4的选择性平板培养基。把含有土壤微生物的浸出液接种在选择性平板培养基上，生长的菌落即为含有ACC脱氨酶的UW3和UW4，其具有对t直物的促生作用(Penrose&Glick,2003PhysiologiaPlantarum118pp10-15)。在本发明的优选实施例中，具体的植物促生菌的获得方法以及本发明的含有植物促生菌的菌液的生物制剂的制备方法步骤如下1.取1克植物根际土壤浸入50ml提取溶液(PAF)中，置入250ml三角瓶中；其中该提取溶液(PAF)中含有IO克朊间质蛋白胨(proteosepeptone)，10克干酪素水解物(caseinhydrolysate)，1.5克MgS04，1.5克K2HP04，10ml甘油(glycerol);以上组成以l-100mlPAF计，例如可以是以1、10、50或者100mlPAF溶液计；2.将上述含有50ml提取溶液的250ml三角瓶在25t2。C室温下，200rpm，震荡24小时；3.取1ml上述步骤2震荡后的提取溶液，再溶入含有50ml提取溶液(PAF)的250ml三角瓶中，在25;h2。C室温下，200rpm，震荡24小时；4.取1ml上述步骤3得到的提取溶液，溶入含有50mlDFsalt溶液的250ml三角瓶中，在25:^2。C室温下，200rpm，震荡24小时；其中，DFsalt溶液含有4.0gK2HPO4，6.0gNa2HPO4，0.2gMgSO4，，2.0g葡萄糖(glucose),2.0g葡糖酸(gluconicacid)，2.0g拧檬酸(citricacid)，1mgFeSO4,0.01mgH3B03,1mgMnS04,0.2mgZnS04,0.1mgCuS04，0.01mgMo03，，pH7.2，2.0g(NH4)2S04;以上组成以1-lOOmlDF溶液计，例如可以是以l、10、50或者100mlDF溶液计；5.取1ml上述步骤4得到的提取溶液，再溶入50ml不含有2.0g(NH4)2S04,含有3.0mMACC的上述DFsalt溶液，该溶液装在三角瓶中，在25;t2。C室温，200rpm，震荡24小时；6.取0.01ml上述步骤5得到的提取溶液，接入含有0.03mMACC的DFsalt平板凝胶培养基上，在30^:2'C室温培养3天；7.取步骤6的培养基上生长的菌落，即为本发明分离的植物促生菌17i^ewdo伤o"asceA/""UW3禾口i^ew(iow。"os/wf/<iaUW4。UW3和UW4可于以下步骤中接种在Trypticsoybeanbroth(TSB)培养液中。胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB):胰蛋白胨1.5%(g/100ml)，大豆蛋白胨0.5%(g/100ml),氯化钠0.5%(g/100ml),用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经12rC压力蒸汽灭菌后使用。促生菌的制备方法促生菌的制备分为两步ACC脱氨酶的诱导和生产用菌液的制备。在菌液发酵生产以前，准备好的种菌接种在诱导的培养基中，发酵诱导24小时，诱导的培养基是由DF培养基和ACC组成。经过诱导种菌接种在生产发酵胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Trypticsoybeanbroth(TSB,DifcoLaboratoies)培养基)中震荡发酵24小时，28^2'C，200r.p.m.发酵菌液中菌数达到20-30亿/毫升。(Penrose&Glick，2003PhysiologiaPlantarum118pp10-15)。方法步骤1.取上述分离步骤7得到的单一菌种，接种20ml上述胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Trypticsoybeanbroth(TSB))培养溶液，在25;t2。C室温培养震荡24小时；2.之后，在4。C下离心(TSB)培养溶液，8000rpm，IO分钟；3.用10mlDF液洗离心沉淀的细胞；该DF液主要用于棒状杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.25M,琥珀酸0.25M，EDTA0.001M,K2HPO40.02M,KH2PO40.11M,MgCl20.01M;4.在4。C下再离心DF细胞溶液，8000rpm，5分钟；5.用10mlDF盐液溶离心沉淀的细胞，力口入3.0mMACC;6.步骤5得到的含菌细胞DF盐溶液，在25去2r室温培养，震荡24小时；7.在4。C下离心步骤6得到的DF培养溶液，8000rpm，10分钟；8，用10mlDF盐液溶解步骤7的离心沉淀的细胞；9.即可得到含菌细胞DF盐溶液；其可加入15%甘油在-80°。保存，用于接种发酵，接种发酵28^:2X:，200rpm，24小时，发酵菌液中菌数可达20-30亿/毫升。对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M，顺丁烯二酸0.02M,MgCl20.02M)，而本发明的促生菌则需要釆用DF溶液。本发明还提供了含有植物促生菌的生物制剂的制备方法，包括以下步骤将上述工业发酵后的菌液(菌数可达到20-30亿/毫升)与1535%的有机质、1232%的腐殖酸、1232%的腐熟有机质、522%的络合置换剂以及0.011%的包埋材料混合，再加入828%的成粒剂，圆盘造粒机成粒，干燥(优选风干的干燥方式)，即可得到本发明的颗粒状的微生物肥料。本发明的有益效果根据上述方案，利用优筛训化多功能植物促生菌尸w^bwo"wce^7'朋UW3和/^w^w7o"os/w"^UW4生产生物制剂，用于农业生产，以促进植物生长(提高产量)，提高肥效(节肥)和提高植物的抗逆能力如旱涝灾害，盐碱，药残(土壤沙漠化，盐碱化以及农药残留污染的治理和修复)，这些细菌的特殊功能在以下几个方面对作物生产，可达到如下有益效果一，提高作物营养和肥料增效的功能利用植物促生菌生产生长素IAA功能促进植物根系生长以促进并调节作物的营养功能，因此，利用植物促生菌生产的生物制剂可用于农业生产做化肥增效剂。除了他们的良好溶磷，固氮功能外，这些菌可以嗜铁和其他植物难以吸收的微量元素，提高作物营养。促生菌生产生长素IAA可促进植物初生根和次生根与不定根的快速生长发育，使植物幼苗的根系吸收系统得到迅速的建立，从而使植物幼苗快速获得定植和同化环境中各种营养元素的能力。本发明的生物制剂做化肥增效剂2KG/亩或10%化肥用量与化肥如二铵、尿素施用，可减少化肥施量30。％，能够达到或超过100%化肥用量的作物产量和生物量。不同施肥处理的作物生物量和产量的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>二，提高作物抗盐碱和盐碱土改良的功能利用植物促生菌调节和控制植物体内乙稀的产生，做盐碱地土壤改良剂，提高作物对盐碱的抵抗能力，促进作物生长，增加产量。当植物生长在盐碱土地上，会生产大量乙烯，乙烯的过量产生抑制植物生长和发育。在农作物生产中大量乙烯的产生将导致农业生产遭受严重的经济损失。而接种植物促生菌的植物，体内乙烯的合成途径会被植物促生菌分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶将植物乙烯前体ACC分解成为丁酮酸和氨。通过ACC脱氨酶，植物促生菌将ACC作为N源利用，从而可大大减少了植物生长抑制物资乙烯的产生，促进植物在盐碱条件下的生长发育，提高植物抗盐碱能力，促进作物生长，增加产量。不同盐碱地的生物菌剂处理的作物生物量和产量的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>利用植物促生菌生产盐碱地土壤改良剂,有明显提高植物抗盐碱能力，可提高作物抗盐碱程度0.3%盐份，提高作物抗导电率(ECe):5dS/m。本改良剂可达到如下效果l)在盐碱化无植物覆盖的土地上，可减轻盐碱对作物的影响，恢复土地的植被覆盖；2)在盐碱化的严重的低产土地，可控制盐碱对作物的影响，提高作物抗盐性，大幅度地增加产量；3)在轻度盐碱化作物生产的土地上，可修复盐碱，恢复因盐碱对作物的影响而造成的减产。三，提高作物抗药残的能力和土壤降残解毒的功能这些植物促生菌与植物根共生的关系在植物根或种子周围具有很强的营养及空间竞争能力，并通过此方式在菌和作物根系形成共生后，生长在根系周围的微生物形成个微生物"膜"可有效的降解土壤农药残留和解出药残的毒害作用。不同农药残留土地的生物菌剂处理的出苗、生物量和产量的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>四，提高作物抗病的能力和抑制病菌的侵染的功能这些植物促生菌与植物根共生的关系在植物根或种子周围具有很强的营养及空间竞争能力，并通过此方式抑制病原菌的繁衍和发展。生物菌剂对不同类作物的根腐病的防治效果和农药处理的对比不同处理出苗率(%)发病率(％)产量(%)禾谷作物无处理对照74,5±12.336.5±14.2100禾谷作物化学处理85.6±7.319.1±7.9116.9±3.8禾谷作物菌剂处理2kg/亩82.3±5.120.9±5.4U5.7土7.8豆类作物无处理对照73.肚10.139.9±13.900豆类作物化学处理84.6±9.925.6±10.2U9.5士7.5豆类作物菌剂处理2kg/亩89.8±12.128.0±15.7123.7±11.4蔬菜作物无处理对照56.7±23.559.1±30.4100蔬菜作物化学处理74.9±15.742.5±17.9130.3±15,6蔬菜作物菌剂处理2kg/亩70.5±13.632.3±12.6139.4±19,0五，做作物抗灾害的生理调节剂利用植物促生菌调节和控制植物体内乙稀的产生，提高作物在极端的逆环境下的适宜能力，促进作物生长，增加产量。当植物生长在旱涝环境的压力下，会生产大量乙烯抑制植物生长和发育，将导致农作物减产。而接种植物促生菌的植物，可大大减少了植物生长抑制物资乙烯的产生，促进植物在旱灾、涝灾条件下的生长发育，促进作物生长，增加作物产量，提高产品品质。生物菌剂在旱裸环境下调节对提高作物干物质积累的作用效果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本发明提供了植物促生菌UW3和UW4在制备促进植物生长的制剂的应用。本发明还提供了上述生物制剂在农业上的应用，尤其是对于促进植物生长方面的作用。本发明的植物促生菌UW3+UW4的联合使用以及含有该植物促生菌UW3和UW4的生物制剂可减少30y。化肥使用，并可以保持和提高作物的产量；可减少50%的抗病农药使用量，而且增产效果好于100%化学农药；可以明显的提高植物抗盐碱能力和盐碱土改良的功能、可提高作物抗盐碱程度0.3%盐份(导电率(ECe):5dS/m);可以恢复盐碱化土地的植被覆盖，恢复因盐碱对作物的影响而造成的减产，修复盐碱土地；恢复因药残对作物的影响而造成的减产；可大幅度增加产量，提高作物抗药残的能力，促进植物根际解毒微生物的生长和土壤的降残解毒的功能。本发明的生物制剂做为作物抗旱涝灾害的生理调节剂，提高了作物在极端的逆环境下的适宜能力，有明显的提高植物抗旱涝灾害的能力，而减少因旱涝灾害的影响而造成的减产。具体实施例方式以下结合实施例详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。实施例l.本发明的生物制剂的组成复合载体材料25°/。的草炭(有机质)、22%的腐殖酸、22%的腐熟有机质、12°/。的络合置换剂(酶解(消化)蛋白8%+硫酸钙4%)、0.05%的甲基纤维素、余量的成粒剂。菌液含有菌数比l:1的UW3和UW4的菌种溶液，浓度2亿菌数/0.05ml。制备方法1.先将UW3和UW4的菌种进行工业发酵，制成发酵菌液，方法如下(1).取l克植物根际土壤，浸入50mlPAF提取溶液中，再置入250ml容器中；该PAF提取溶液为含有朊间质蛋白胨、干酪素水解物、MgS04、K2HP04和甘油的组合物溶液；(2).将上述含有50mlPAF提取溶液的三角瓶在25;h2。C下震荡；(3).取lml上述步骤(2)震荡后的PAF提取溶液，再溶入含有50mlPAF提取溶液的250ml容器中，在25^2'C下，震荡；(4).取lml上述步骤(3)得到的PAF提取溶液，溶入含有50mlDF盐溶液的250ml容器中，在25主2'C下震荡；该DF盐溶液为含有磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、葡萄糖、葡糖酸、柠檬酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、三氧化钼和硫酸铵的溶液；(5).取lml上述步骤(4)得到的提取溶液，再溶入50ml不含有硫酸铵但含有3.0mMl-氨基环丙烷-l-羧酸的上述DF盐溶液的容器中，25;h2X:下震荡；(6).取O.Olml上述步骤(5)得到的提取溶液，接入含有0.03mMACC的DF盐的平板凝胶培养基上，在30;t2'C培养2-4天；(7).取步骤(6)的培养基上生长的菌落，其为植物促生菌i^Womo"wce<iW"aUW3禾口尸"W(iomowas/wricfaUW4的菌禾中；(8).取上述步骤7得到的菌种，接种在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在25WC温度下培养震荡24小时，得到培养溶液；(9).在4'C下离心步骤(8)的培养溶液；(10).用DF液冲洗步骤(9)离心沉淀的细胞；该DF液的成分包括蔗糖、琥珀酸、EDTA、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化镁；(11).在4'C下再离心步骤(10)得到的DF细胞溶液；(12).用DF盐液溶解离心沉淀的细胞，加入3.0mM的ACC，得到含菌细胞DF盐溶液；(13).步骤(12)得到的含菌细胞DF盐溶液，在25;t2'C下培养、震荡；(14).在4'C离心步骤(13)得到的DF培养溶液，得到离心沉淀的细胞；(15).用10mlDF盐液溶解步骤(13)得到的离心沉淀的细胞得到含菌细胞DF盐溶液；(16)潜步骤(15)得到的含菌细胞DF盐溶液于28^:2'C接种发酵，得到工业发酵后的植物促生菌的菌液；该菌液中菌数达到20-30亿/ml;(17).再将复合载体材料25%的草炭(有机质)、22%的腐殖酸、22°/。的腐熟有机质、12%的络合置换剂、0.05%的甲基纤维素混合；(18).将每克复合载体材料加发酵菌液0.05ml,达到2亿菌数/l克复合载体材料；再加入成粒剂，制成颗粒，干燥后即为含有植物生菌的生物制剂。24经16srRNA基因程序分析鉴定验证，以及从形态学(morphologically)上分析，UW4是粉红到桃红色的菌落群，UW3是奶油色的菌落群，可将UW3和UW4分离幵来。上述得到的发酵菌液以及生物制剂中含有的菌株为UW3和UW4。实施例2.本发明的生物制剂的组成复合载体材料27%的草炭(有机质)、20%的腐殖酸、20%的腐熟有机质、13°/。的络合置换剂(其中酶解(消化)蛋白10%+硫酸钙3%)、0.05°/。的甲基纤维素、余量的成粒剂；菌液含有2:1(菌数比例)的UW3和UW4的菌种溶液，浓度为0.01ml达到2亿菌数。制备方法.-参照实施例l，制备发酵菌液的土壤与实施例l的植物根际土壤不同，与实施例l的土壤所处地理位置的经纬度相差很大的地域的植物根际土壤。经16srRNA基因程序分析鉴定验证，上述得到的发酵菌液以及生物制剂中含有的菌株为UW3和UW4。实施例3.本发明的生物制剂的组成复合载体材料22%的草炭(有机质)、22%的腐殖酸、22%的腐熟有机质、16°/。的络合置换剂(其中酶解(消化)蛋白11°/。+硫酸钙5%)、0.05%的甲基纤维素、余量的成粒剂；菌液含有l:2(菌数比例)的UW3和UW4的菌种溶液，浓度为0.1ml达到2亿菌数。制备方法-参照实施例l，制备发酵菌液的土壤与实施例1和2的植物根际土壤不同，与实施例1和2的土壤所处地理位置的经纬度相差很大的地域的植物根际土壤。经16srRNA基因程序分析鉴定验证，上述得到的发酵菌液以及生物制剂中含有的菌株为UW3和UW4。权利要求1.一种生物制剂，其包括含有植物促生菌的菌液和复合载体材料，其中，该菌液为含有植物促生菌PseudomonascedrinaUW3和PseudomonasputidaUW4的溶液，所述UW3和UW4的菌数比例为1-22-1，该复合载体材料包括有机质、腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂、包埋材料中任意两种或两种以上的组合，上述复合载体材料和菌液的比例为植物促生菌的菌数至少1亿/每克复合载体材料。2.权利要求1上述的生物制剂，其中，以复合载体材料的重量为100%为基准，所述的复合载体材料包括以下重量百分比的成分1535%的有机质、1232%的腐殖酸、1232%的腐熟有机质、522%的络合置换剂和0.011%的包埋材料。3.权利要求2所述的生物制剂，其中，以复合载体材料的重量为100%计，所述的复合载体材料还包括828%的成粒剂。4.权利要求1所述的生物制剂，其中，所述的有机质包括草炭。5.权利要求1所述的生物制剂，其中所述的/^^fomo"ascecHraUW3在美国农业研究菌种保藏中心保藏，保藏编号为NRRLB-50192;所述的尸wz^omo"os/^^^UW4在美国农业研究菌种保藏中心保藏，保藏编号为NRRLB-50193。6.制备权利要求1所述的生物制剂的方法，其中该方法包括将含有植物促生菌i^ewdomowascecH"aUW3禾口尸sewcfowowayUW4的溶液，该溶液中UW3和UW4的菌数比例为1-2:2-1，与有机质、腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂以及包埋材料混合，再加入成粒剂，成粒，干燥，即得。7.权利要求6所述的制备方法，其中包括(1).取l克植物根际土壤，浸入50mlPAF提取溶液中，再置入250ml容器中；该PAF提取溶液为含有朊间质蛋白胨、干酪素水解物、MgS04、K2HP04和甘油的组合物溶液；(2).将上述含有50mlPAF提取溶液的三角瓶在25;h2。C下震荡；(3).取lml上述步骤(2)震荡后的PAF提取溶液，再溶入含有50mlPAF提取溶液的250ml容器中，在25^:2'C下，震荡；(4).取lml上述步骤(3)得到的PAF提取溶液，溶入含有50mlDF盐溶液的250ml容器中，在25^TC下震荡；该DF盐溶液为含有磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、葡萄糖、葡糖酸、柠檬酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、三氧化钼和硫酸铵的溶液；(5).取lml上述步骤(4)得到的提取溶液，再溶入50ml不含有硫酸铵但含有3.0mMl-氨基环丙烷-l-羧酸的上述DF盐溶液的容器中，在25;t2'C下震荡；(6).取0.01ml上述步骤(5)得到的提取溶液，接入含有0.03mMACC的DF盐的平板凝胶培养基上，在30^:2。C培养2-4天；(7).取步骤(6)的培养基上生长的菌落，其为植物促生菌UW3禾口i^ewctomowas/w"<iaUW4的菌禾中；(8).取上述步骤7得到的菌种，接种在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在25;tTC温度下培养震荡24小时，得到培养溶液；(9).在4'C下离心步骤(8)的培养溶液；(10).用DF液冲洗步骤(9)离心沉淀的细胞；该DF液的成分包括蔗糖、琥珀酸、EDTA、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化镁；(11).在4t:下再离心步骤(10)得到的DF细胞溶液；(12).用DF盐液溶解离心沉淀的细胞，加入3.0mM的ACC，得到含菌细胞DF盐溶液；(13).步骤(12)得到的含菌细胞DF盐溶液，在25主2'C下培养、震荡；(14).在4'C离心步骤(13)得到的DF培养溶液，得到离心沉淀的细胞；(15).用10mlDF盐液溶解步骤(13)得到的离心沉淀的细胞得到含菌细胞DF盐溶液；(16).将步骤(15)得到的含菌细胞DF盐溶液在28土2t:下接种发酵，得到工业发酵后的植物促生菌的菌液；该植物促生菌的菌液中菌数达到20-30亿/ml;(17).将步骤(16)得到的植物促生菌的菌液与1535%的有机质、1232%的腐殖酸、1232%的腐熟有机质、522%的络合置换剂以及0.011%的包埋材料混合，再加入828%的成粒剂，造粒，干燥，得到所述的生物制剂。8.权利要求1所述的生物制剂在促进植物生长方面的应用。全文摘要本发明提供了一种植物促生菌和含有该植物促生菌的生物制剂，以及上述菌种和生物制剂的制备方法；该生物制剂含有复合载体材料和菌液，复合载体材料包括有机质、腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂、包埋材料，菌液为含有植物促生菌包括菌数比例为1-2∶2-1的UW3和UW4的溶液，复合载体材料加菌液使植物促生菌的菌数达到至少1亿/每克复合载体材料，得到该生物制剂；该生物制剂用于农业生产可以促进植物生长，提高产量，提高肥效和提高植物的抗逆能力。文档编号C05F11/08GK101497542SQ20081018132公开日2009年8月5日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者黄晓东申请人:黄晓东