专利名称：一种利用叶绿体转基因技术的机械化杂交稻制种方法
技术领域：
本发明涉及一种利用叶绿体转基因技术的机械化杂交稻制种方法。
背景技术：
我国现行杂交水稻制种技术，自播种至收获完全依靠人工操作。父母本分期播种， 多为先栽父本，后栽母本；母本多行，父本双行。工序繁杂，整个制种过程需要足够的劳动力 做保证，只适宜在劳动密集型的农村推广应用，大型农场因缺少足够的劳动力而不能制种。 而且，由于父本的因素，减少了制种产量。本发明将使这种现状得到根本的改变，不依赖于 劳动力而实现机械化，制种产量也将有大幅度提高，虽然采取了转基因技术但不是转基因 种子。这种杂交水稻制种技术，是将叶绿体携带苯达松抗性基因RNAi的杂交稻父本(恢 复系)和母本(不育系)按照一定的比例均勻混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育 秧和大田栽培管理，可以抛秧、机插，也可以直播，大大简化栽插工序。当父母本进入扬花期 并自然完成授粉后，适时向田间喷施除草剂苯达松，携带苯达松敏感基因的水稻父本遇上 苯达松会很快死亡，而未携带该基因的母本则安然无恙，正常生长，直至成熟，最后进行机 械化收割。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用转基因技术机械化生产非转基因杂交稻种子的 方法。将水稻除草剂苯达松抗性基因的RNAi转化到水稻恢复系的叶绿体中，育成苯达松敏 感(致死)的水稻恢复系，作为机械化制种亲本。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是首先构建苯达松抗性基因RNAi载体，利用叶绿体转基因技术，获得叶绿体携带苯 达松抗性基因RNAi的杂交稻父本(恢复系)，同步选育与该恢复系播始历期相近的三系和 两系不育系，选育的恢复系杂交用三系或两系不育系进行测交，种植测交F1和相应的苯达 松敏感恢复系，观察F1的经济性状和父本的敏感程度，成熟期取样考种，进行优势鉴定，选 育强优势组合。制种时苯达松敏感父本(恢复系)和母本(不育系)按照一定的比例均勻混合， 一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以抛秧、机插，也可以直播，大 大简化栽插工序。当父母本进入扬花期并自然完成授粉后，适时向田间喷施除草剂苯达松， 携带苯达松敏感基因的水稻父本遇上苯达松会很快死亡，而未携带该基因的母本则安然无 恙，正常生长，直至成熟，最后进行机械化收割。本发明的技术效果在于采用本发明方法利用了转基因技术，但生产的是非转基 因杂交稻种子；制种时，转基因父本的花粉不含有转基因成分，不会造成转基因的扩散漂 移，有利于生物安全；制种时，转基因父本后期被杀灭，无转基因产品产生；可以减少制种 操作程序，可以进行机械化操作，减轻劳动强度，降低种子生产成本，整体提高水稻种业的效益。
具体实施例方式实验过程1苯达松抗性基因RNAi载体构建根据苯达松抗性基因Bel的cDNA序列，设计两对合适引物，并依据植物RNAi双元 载体pRNAi-Ubi在引物中加入适合内切酶；以cDNA为模板进行PCR扩增，回收两个扩增产 物后，分别克隆到pGEM -TEasy Vector质粒(Promega)上；再将这两个片断酶切下来，并 分别反向和正向插入pRNAi-Ubi载体质粒中。所构建RNAi载体质粒命名为pRNAi-Ubi-Bel， 并导入农杆菌菌株EHA105。2水稻叶绿体遗传转化2.1植物材料选择用于叶绿体遗传转化的水稻(Oryza sativa L.)品种选择易于转化的杂交水稻骨 干恢复系，包括但不限于9311、明恢86、R207。2. 2水稻胚性愈伤组织的诱导取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min，再于0. 1% 升汞中浸泡15min (或再转入20%的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min)，超净工作台 中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放 35粒，28°C暗培养4-5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周 继代一次，共继代2-3次。成熟胚去壳，，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。28°C暗培养至长出愈伤组 织。选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。(第三代开始可以选择适当的胚性 愈伤用于农杆菌转化。2. 3愈伤组织的预培养取生长旺盛的胚性愈伤组织(从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2_3mm的胚 性愈伤颗粒)转接到预培养培养基，27°C暗培养3-4天。生长旺盛的愈伤用于转化。2. 4粒子轰击法按照PDS 1100/He型号基因枪的操作手册进行。2. 4. 1金粉悬浮液的制备称取60mg金粉于1. 5ml Eppendorf管中，加入Iml纯酒精，振荡2分钟，然后 10，OOOrpm离心1分钟沉淀金粉。去上清后再重复3次。最后1次改用无菌dd H2O0悬浮 金粉于Iml dd H2O,贮存于-20°C备用。2. 4. 2DNA-金粉悬浮液制备取50ul金粉悬浮液，按下列顺序依次加入:5ul DNA(lug/ul)，250ul 2. 5mol/L CaCl2, 20ul 0. lmol/L亚精胺。混勻后置于冰上数分钟。振荡3分钟后，离心3秒钟，去上 清，用250ul纯酒精洗一遍，最后加入60ul纯酒精，混勻后贮存于_20°C备用。2. 4. 3粒子轰击先将整个装置用酒精清洗消毒。用酒精棉球擦拭枪体和样品室，将铜网、载体膜、 可裂膜用70%酒精浸泡15分钟，于无菌滤纸上晾干。
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将载体膜安放于载体中，在载体膜中央滴加已制备好的DNA-金粉悬浮液5-lOul， 待其晾干后备用。装好可裂膜、铜网及载体，放入待轰击样品，调整轰击距离，根据我们摸索的结果， 距离选用6 8cm为佳。打开进气阀，调压至所需值，打开真空泵，抽真空至25 28in. Hg， 即可进行轰击。轰击完成后，解除负压，取出样品，用石蜡膜封严培养皿。培养3天后，转至筛选培养基。2. 5抗性愈伤的筛选将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。培养4-8周，多数愈 伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在 选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。2. 6抗性愈伤的分化培养经抗生素筛选长出的抗性愈伤，转入分化培养基中继续培养，26°C -28°C，12h光 照，12h黑暗条件下培养。2. 7转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼 芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待 苗高7 IOcm时，打开瓶盖于温室中炼苗5 7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净 跟上的培养基，移至温室盆栽(铁盘中)。注意保湿，以提高移栽成活率。3转基因植株的分子检测3. IDNA大规模抽提水稻DNA抽提采用CTAB法(Murry and Thompson, 1980)。称取新鲜叶片2-4克，剪 碎后放入-20°C预冷的研钵中，用液氮磨成粉末，转入预冷的磨样瓶中于-20°C保存备用。 提取时加入预热至100°C的IOml 1. 5XCTAB，迅速搅勻，于56°C水浴保温摇床振荡20分钟， 然后用等体积氯仿异戊醇(24 1)抽提。离心后，上清液再用1/10体积预热至56°C的 10% CTAB缓冲液及等体积的氯仿异戊醇(24 1)抽提一次，然后上清加入CTAB沉 淀DNA，离心后加入添加有RNase A的lmol/L NaCl溶解DNA，于56°C过夜完全溶解酒精沉 淀后，溶于适量TE中，用DNA微量测定仪(DNAFluorometer)测定DNA浓度，平衡DNA浓度 至250ng/ul，存于4°C备用。抽提烟草DNA时，在1. 5X CTAB中加入1 % (V/V)的B-疏基乙醇。其它步骤同水稻。3. 2PCR 分析合成了适合引物。PCR 反应体系DNA 30_90ng，IOx Buffer 2. Oul, ImM dNTP 1. 8ul，25mM MgCl2 1. 5ul，IOuM primer 两种各 0. 5ul，Tag 酶 1. 5U,然后加 dd h20 至 20ul
反应体积。PCR循环条件:94°C，变性3分钟；94°C，1分钟，55°C (检测Psag12〕或68°C (检测 NPTII)，1. 5分钟，72°C，1. 5分钟，40个循环；72°C，延伸5分钟。电泳检测用1. 4%琼脂糖凝胶电泳，照相记录电泳结果。3. 3Southern 印迹分析
取水稻总DNA 2. 5ug(烟草总DNA量略多)，用限制性内切酶XbaI 37°C酶解20hr 左右，经电泳检测酶切完全后，用0. 6 0. 8%琼脂糖(Sigma公司生产)凝胶电泳，经 12-16hr电泳后，凝胶用0. 2N HCl变性10分钟，用0. 4N NaOH溶液将凝胶上的DNA片段转 移至尼龙膜Hybond-N+上。转移20小时，将尼龙膜用2X SSC漂洗2次，各5分钟，膜晾干 后于80-100°C真空烘烤3hr，取出冷却后置于4°C冰箱中保存备用。预杂交先将尼龙膜用2X SSC漂洗，凉干后装入杂交袋中，加入IO-ISml (依膜的 张数1-6张)预热至65°C的杂交缓冲液。赶气泡后，于65°C空气摇床中预杂交6hr左右。探针标记用随机引物法按下列步骤进行标记。探针DNA lOOng，加入dd H2O 至IOul, 100°C变性10分钟，冰浴5分钟冷却后，加入dNTP(A+G+T) 3ul,随机引物缓冲液 5. Oul，Klenow Fragment酶2U，最后加入a-32P-dCTP10_40uCi (按杂交膜数量)，混勻后于 25°C保温3小时以上。杂交加600ul杂交液到标记好的探针溶液中，打开管盖，100°C变性10分钟后，倒 入杂交袋中，65 °C杂交6hr。洗膜、压片杂交完毕后，将膜从杂交袋中取出，用洗膜液IX SSC,0.2% SDS室温 漂洗1次，然后再用预热至65°c的洗膜液于65°C保温摇床中热洗1-2次，每次15分钟。凉 干后用保鲜膜包膜，压片后于-20°C放射自显影约4-7天。探针DNA制备。探针DNA选自质粒pSG516上的启动子PSAei2的HinDIII酶切片段。 电泳分离酶切片段后，用S印haglas Band Prep Kit回收琼脂糖凝胶上所需片段。部分实 验采用primerSAG12 PCR扩增片段作为探针，使用Wizard PCR Preps kit回收扩增片段。3. 4组织化学法检测报道基因⑶S的表达共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的阳性鉴定、转基因植株的⑶S酶活性测定 以及Psmi2-GUS转基因植株⑶S酶活性的叶片衰老特异性表达都用组织化学法测定。将待 测定的材料，如愈伤或叶片，浸入适量X-Gluc溶液，于37°C保温过夜后，在体视显微镜下观 察，拍照记录。若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空，染色效果将更好。如材料存在色素干 扰问题，染色后用酒精脱色，使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存。X-Gluc 染色液0. 2mol/L NaPO4 缓冲液，pH7. 0 (0. 2mol/L Na2HPO4,62ml ；0. 2mol/ L NaH2PO4, 38ml) ；0. lmol/L K3 [Fe (CN) 6] ；0. 1Mo1/LK4 [Fe (CN) 6]. 3H20 ； 1. OMol/L Na2EPTA ； 0. 1% X-Gluc ；加水至所需体积。4°C贮存备用。3. 5叶绿体转化水稻植株的鉴定从转化植株中分离水稻叶绿体并从提取叶绿体基因组DNA。以此为模板，利用设计 的引物，按常规反应条件在PTC-200PCR热循环仪(MJ公司)上进行PCR反应，检测转化植 株中转基因的导入。将从转化植株中的叶绿体基因组DNA进行酶切、电泳、转移至硝酸纤维 素膜Hybond-N。利用随机引物标记试剂盒(Promega公司)和[α-32P] dATP (北京亚辉公 司)，随机引物法制备α -32Ρ标记的转基因片段，作为分子探针，按照Sambrook等分子克隆 方法进行转化植株的Southern杂交分析。以转化植株中提取的叶绿体基因组DNA为模板， 利用引物进行PCR扩增反应，根据扩增片段的大小鉴定转化植株中转基因的定点整合及同 质化程度。4叶绿体转化水稻植株后代的遗传学分析分别以转基因水稻为母本和父本，与非转基因的野生型水稻杂交，将杂交后代种
6子表面消毒、去壳后分别置于含MS抗性培养基(添加相应抗生素)的培养皿(Φ9)中萌发， 转移至12h光照、25°C的光照培养箱中，观察种子萌发和幼苗生长状况。同一培养基中放置 两种杂交后代种子各16粒，另设置2皿作为重复。5恢复系用于制种试验将叶绿体携带苯达松抗性基因Bel的RNAi的恢复系应用于杂交稻制种，父母本按 一定比例进行混播，授粉后喷施除草剂苯达松，杀死父本，进行机械化收割。
权利要求
一种叶绿体含除草剂抗性基因RNAi的杂交稻恢复系的制备方法，包括以下步骤将水稻除草剂苯达松抗性基因的RNAi转化到杂交稻恢复系的叶绿体中，育成母体遗传特性的苯达松敏感(致死)的水稻恢复系，杂交稻制种时，父母本按一定比例进行混播，授粉后喷施除草剂，杀死父本，进行机械化收割，获得的是非转基因杂交稻种子。
2.根据权利要求1所述的叶绿体含除草剂抗性基因RNAi的杂交稻恢复系的制备方法， 其特征在于利用除草剂苯达松抗性基因Bel。
3.根据权利要求1所述的叶绿体含除草剂抗性基因RNAi的杂交稻恢复系的制备方法， 其特征在于构建苯达松抗性基因Bel的RNAi载体。
4.根据权利要求1所述的叶绿体含除草剂抗性基因RNAi的水稻恢复系的制备方法，其 特征在于利用叶绿体转基因技术，将苯达松抗性基因Bel的RNAi载体转化杂交稻恢复系 叶绿体中。
全文摘要
本发明公开一种利用叶绿体转基因技术的机械化杂交稻制种方法。将水稻除草剂苯达松抗性基因的RNAi转化到水稻恢复系的叶绿体中，育成苯达松敏感(致死)的水稻恢复系。这种恢复系具有苯达松敏感性母体遗传的特性，并且花粉不携带转基因，因此用这种恢复系配制的杂交种是非转基因的。杂交稻制种时，父母本按一定比例进行混播，授粉后喷施除草剂苯达松，杀死父本，进行机械化收割。这种机械化制种技术不仅大大减轻了农民的劳动强度，减少操作程序，由于提前杀灭父本而提高了制种产量，降低种子的生产成本，而且利用转基因技术生产出的是非转基因杂交稻种子。
文档编号A01H1/02GK101928724SQ20091004373
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月20日 优先权日2009年6月20日
发明者唐丽, 廖翠猛, 曹孟良, 李丁, 袁隆平, 谢灵灵, 邢俊杰 申请人:湖南西城杂交水稻基因科技有限公司