专利名称：：花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
技术领域：
：本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，特别是涉及一种花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法。
背景技术：
：花椰菜(j5ra柳&o/eraceflL.var.6o^y似)因味道鲜美、营养丰富而在世界各地普遍栽培。传统选育花椰菜杂交新品种的育种周期一般需6~8年，其中选育亲本材料就需5~6年。利用小孢子培养方法能快速创制二倍体再生植株的亲本材料，可显著提高育种效率，縮短育种周期至35年。以往国内外对花椰菜小孢子培养技术己有报道。1992年花椰菜小孢子培养首获成功(DuijsJC,"a/.Euphytica,1992,60:45-55)，但出胚率较低。1999年在培养基中加入活性碳后提高了小孢子的产胚率(SilvaDiasJC.Euphytica,1999,108:65-69)。国内也有花椰菜小孢子培养的报道(顾宏辉等，浙江大学学报(农业与生命科学版)，2004,30(1):34-38;顾宏辉等，浙江农业学报，2006，18(5):365-368;顾宏辉等，农业生物技术学报,2007,15(2):301-305;张晓芬等，中国蔬菜，2005(1):16-17;方淑桂等，福建农业学报，2006,21(2):138-142;赵前程等.河南农业科学，2007(7):77-79)。此外，2003年孙德岭等提出了"利用游离小孢子培养技术培养花椰菜再生植株的方法"的发明专利申请(申请号03129987)，但上述的研究报道和专利申请主要涉及了小孢子培养的胚胎发生与植株再生，而并没有涉及如何提高花椰菜小孢子再生植株二倍体发生频率的方法。通过小孢子培养获得的花椰菜再生植株有单倍体、二倍体、四倍体及嵌合体等多种类型，除基因型差异外，二倍体的发生频率一般仅有50%左右，因而会明显降低小孢子培养育种的利用效率。但通过小孢子培养获得的二倍体植株是纯合的，其性状稳定，后代性状不会分离。因此，寻求一种提高花椰菜小孢子再生植株二倍体率的培养方法对育种来讲具有重要的应用价值。
发明内容本发明目的是，针对现有花椰菜小孢子培养技术体系中所存在的再生植株二倍体率低的缺陷，提供一种能提高花椰菜小孢子再生植株二倍体率的培养基及培养方法，并以该高二倍体率的再生植株为育种亲本，进而达到提高花椰菜育种进程与效率的目的。本发明目的通过以下技术方案来实现。花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，该方法按如下步骤进行-(1)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含重量为1)花蕾预处理培养基NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L+0.05~0.2%秋水仙碱+l3%DMSO，pH5.6~6.0，过滤灭菌；2)胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，pH5.6~6.0，过滤灭菌；3)胚状体分化培养基B5液体培养基+trans-ZT0.52mg/L+IAA0.050.2mg/L+BAP0.5~2.0mg/L+木糖125~500mg/L+蔗糖或白糖2030g/L+琼脂糖2~5g/L，pH5.66.0,高温灭菌；4)萌发、生根培养基85液体培养基+蔗糖或白糖203(^/1^+琼脂610g/L，pH5.66.Q，高温灭菌；(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养-1)供体植株与花蕾的选择选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；2)花蕾灭菌用5.2。/。活性氯次氯酸钠50mL/L+95。/。酒精100mL/L+吐温20100pL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；3)花蕾预处理培养将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在4。C下培养15d;4)花蕾小孢子的分离、混配与分装在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入IOmL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用40pm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按1000rpm离心3分钟，弃上清液；再加10mL胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1.5个花蕾后，再按每4mL培养基中加入由>^]^13液体培养基+琼脂糖2-58几+lg/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液0.05mL的比例，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液分装于直径为6mm或9mm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，5)小孢子胚状体的培养将分装好的培养皿置于31-33。C恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25"C恒温培养箱，暗培养l-2周至胚状体出现；再在25'C黑暗下50rpm振荡培养l-2周，至子叶型胚状体形成；6)再生植株的分化与萌发培养在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25'C下培养5-10d至胚状体膨大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；7)再生植株的生根培养与移栽切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25。C下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2:l配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25'C下培养l周；8)再生植株的倍性检测取移栽成活再生植株的嫩叶，用partecPA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材料用于育种。本发明的有益效果是1、提高了花椰菜小孢子培养的出胚率，最高可达80个胚/蕾，对照为60个胚/蕾；2、提高了胚状体的出苗率，平均达80%，对照为50%;3、提高了小孢子再生植株的二倍体率，平均二倍体再生植株数占总植株数的70%以上，对照为50%左右。具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1:(花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法1)该方法按如下步骤进行(1)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含重量为1)花蕾预处理培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L+0.P/。秋水仙碱+2%DMSO，pH5.6，过滤灭菌。其中NLN-13培养基配方见表1;2)胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH5.8,过滤灭菌；3)胚状体分化培养基B5液体培养基+trans-ZT1.0mg/L+IAA0.1mg/L十BAP1.0mg/L+木糖25011^/1^+白糖30§/1^+琼脂糖3g/L，pH5.6，高温灭菌；其中B5培养基配方见表1;4)萌发、生根培养基85液体培养基+白糖30§/1>琼脂8g/L，pH6.0，高温灭菌；表lNLN-13、Bs培养基配方<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养O供体植株与花蕾的选择选择抽苔开花时生长在525°C、日光照14小时左右、NPK营养均衡充足、植株与花蕾生长健康，无明显病情的花椰菜作供体；并从中摘取花瓣与花药长度比为0.8，处于单核中晚期的花蕾15个；2)花蕾灭菌先用5.2%活性氯次氯酸钠50mL/L+95%酒精100mL/L+吐温20lOOpL配制成灭菌液；在摇床上将15个花蕾放入含灭菌液20mL的培养瓶中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；3)花蕾预处理培养将灭菌后花蕾置于含花蕾预处理培养基4mL的培养皿中，parafilm膜封口，并放入冰箱冷藏室4。C下培养2d;4)花蕾小孢子的分离、混配与分装在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入IOmL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用40iim无菌尼龙滤网过滤于50mL离心管中，按1000rpm离心3分钟弃上清液；再加入10mL胚状体诱导培养基继续按1000rpm离心3分钟弃上清液；加入胚状体诱导培养基40mL，使平均每4mL培养基中含1.5个花蕾，再加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖3g/L十lg/L活性炭配制，经高温灭菌而成的活性炭混合液0.5mL(使平均每4mL胚状体诱导培养基中加入活性炭混合液0.05mL)，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液分装于10个直径为6mm的无菌塑料培养皿中，加盖后用pamfilm膜封口，备用；5)小孢子胚状体的培养将分装好的培养皿置于32'C恒温培养箱中，暗培养48小时；后置于25"C恒温培养箱，暗培养l-2周至肉眼可见胚状体出现；再在25r黑暗下50rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成；6)再生植株的分化与萌发培养在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25'C下培养7d至胚状体膨大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；7)再生植株的生根培养与移栽切取萌发有正常生长点的再生植株，插于生根培养基中，在每天光照16小时、25。C下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2:l配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25"C下培养1周；8)再生植株的倍性检测取移栽成活再生植株的嫩叶lcm2，用德国产partecPA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材料用于育种。用本例方法培养获得的花椰菜小孢子再生植株共1065株，经倍性检测，其中二倍体的再生植株数共有773株，二倍体率占总株数的72.6%。实施例2:(花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法2)本实施例中，所述花蕾预处理培养基为NLN-13液体培养基+白糖130g/L+0.05%秋水仙碱+3%DMSO，pH为6.0;选取15个单核中期花蕾，花瓣与花药长度比为0.6;花蕾在含花蕾预处理培养基的培养皿中，在冰箱冷藏室4。C条件下培养5d;小孢子分离后，加入40mL胚状体诱导培养基，pH为5.6，并加入0.5mL由NLN-13液体培养基+琼脂糖5g/L+lg/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mly每皿分装于直径为6mm的无菌塑料培养皿中，共10皿，加盖后用parafilm膜封口；将培养皿置于33"C条件下培养ld;获得的胚状体置于胚状体分化培养基B5+trans-ZT0.5mg/L+IAA0.05mg/L+BAP0.5mg/L+木糖500mg/L+蔗糖20g/L+琼脂糖2g/L，pH为6.0中，在每天16小时光照25。C条件下培养5d;后移入萌发培养基B5+蔗糖20g/L，琼脂6g/L，pH5.6中进行再生植株的萌发培养；NLN-13、B5培养基配方同表l;其余步骤工艺均同于实施例1。实施例3:(花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法3)本实施例花蕾预处理培养基为NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L+0.2%秋水仙碱+l%DMSO,pH为5.8;选取15个单核晚期花蕾，花瓣与花药长度比为1.0;花蕾在含花蕾预处理培养基的培养皿中，在冰箱冷藏室4"C条件下培养ld;小孢子分离后，加入40mL胚状体诱导培养基，pH为6.0，并如入0.5mL由NLN-13液体培养基+琼脂糖2g/L+lg/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mL/li皿分装于直径为9mm的无菌玻璃培养皿中，共10皿，加盖后用pamfilm膜封口；将培养液置于3rC条件下培养3d;获得的胚状体置于胚状体分化培养基B5+tranS-ZT2mg/L+IAA0.2mg/L+BAP2.0mg/L+木糖125mg/L+蔗糖25g/L+琼脂糖5g/L,pH为5.8中，在每天16小时光照25"C条件下培养10d;后移入萌发培养基B5+蔗糖25g/L，琼脂10g/L，pH5.8中进行再生植株的萌发培养；NLN-13、Bs培养基配方同表l;其余步骤工艺均同于实施例1。实施例4:(二倍体育种亲本材料在花椰菜育种中的应用)对小孢子培养获得的二倍体再生植株进行农艺性状的观察记录；在开花期，对二倍体再生植株进行大量的杂交，进行测配组合。其中c07595植株半直立，叶片自覆性好，植株长势中，叶深绿色，单球均重0.55kg，球扁平，乳白色，抗霜霉病，自交不亲和，来年3月25日始花；c07715植株生长势中，直立，株型紧凑，单球均重0.36kg，球扁平，乳白色，感霜霉病，叶片深绿色，自交亲和。杂交后50天收获杂交种子，并于当年8月播种进行杂交组合评价。杂交Fi代C017植株生长势强，半直立，生长整齐，花球扁平，乳白色，单球均重1.2kg，较抗霜霉病，花球商品性好。权利要求1、花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，其特征在于该方法按如下步骤进行(1)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含重量为1)花蕾预处理培养基NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L+0.05～0.2％秋水仙碱+1～3％DMSO，pH5.6～6.0，过滤灭菌；2)胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，pH5.6～6.0，过滤灭菌；3)胚状体分化培养基B5液体培养基+trans-ZT0.5～2mg/L+IAA0.05～0.2mg/L+BAP0.5～2mg/L+木糖125～500mg/L+蔗糖或白糖20～30g/L+琼脂糖2～5g/L，pH5.6～6.0，高温灭菌；4)萌发、生根培养基B5液体培养基+蔗糖或白糖20～30g/L+琼脂6～10g/L，pH5.6～6.0，高温灭菌；(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养1)供体植株与花蕾的选择选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；2)花蕾灭菌用5.2％活性氯次氯酸钠50mL/L+95％酒精100mL/L+吐温20100μL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；3)花蕾预处理培养将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在4℃下培养1～5d；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按1000rpm离心3分钟，弃上清液；再加10mL胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1.5个花蕾后，再按每4mL培养基中加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖2-5g/L+1g/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液0.05mL的比例，混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为6mm或9mm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；5)小孢子胚状体的培养将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1-2周至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成；6)再生植株的分化与萌发培养在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25℃下培养5-10d至胚状体膨大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；7)再生植株的生根培养与移栽切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2∶1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；8)再生植株的倍性检测取移栽成活再生植株的嫩叶，用partecPA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材料用于育种。全文摘要本发明公开了花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，属于植物组织培养
技术领域：
。该方法包括(1)培养基的配制；(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养1)供体植株与花蕾的选择；2)花蕾灭菌；3)花蕾预处理培养；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装；5)小孢子胚状体的培养；6)再生植株的分化与萌发培养；7)再生植株的生根培养与移栽及8)再生植株的倍性检测。本发明显著提高了青花菜小孢子培养的出胚率、出苗率与再生植株的二倍体率，由常规的60个胚/蕾、50％与50％左右分别提高为80个胚/蕾、80％及70％以上，从而可提高花椰菜的育种效率。该方法可在蔬菜育种单位或企业中推广应用。文档编号A01H4/00GK101617631SQ20091010172公开日2010年1月6日申请日期2009年8月13日优先权日2009年8月13日发明者张晓辉,朱丹华,王建升,盛小光,虞慧芳,赵振卿,顾宏辉申请人:浙江省农业科学院