专利名称：：一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物及其方法
技术领域：
：本发明涉及植物种子无菌播种
技术领域：
，尤其涉及一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物及其方法。蕙兰种子无菌萌发的优化培养基配方及促进萌发的方法。
背景技术：
：蕙兰(Ov^i力'鹏/3力er/)又称夏蕙、九节兰等，是中国兰花的一大种类。因其香气馥郁，花形优美，铭品稀少，在东南亚地区被视为高档的盆栽花卉。蕙兰自然生长在山坡树林中，多数栽培品种均是由野生种自然变异筛选而来。由于人类长期的滥采乱挖和兰花赖以生存环境的不断恶变，再加上自身繁殖速度极其缓慢，我国野生蕙兰资源日趋紧缺，有些珍稀品种已濒临灭绝。只有通过有计划的培育、繁殖发展濒危、特有种类，才能避免该物种灭绝，并且满足当前国兰日益蓬勃的市场需求。通过种子播种萌发可以快速获得繁殖后代及筛选优良种性，进行物种繁衍和有效保护。种子无菌播种技术即在人工调控的环境下加速促进种子萌发及提高萌发率，尤其适合一些自然条件下萌发率极低的植物种子。多数兰科植物种子细小如粉尘，是至今所发现最小的种子之一，且构造均非常简单，没有胚乳，只有薄薄的一层种皮和少量仅供自身生长、发育所需要的养料，所以它的生命力很弱，自然条件下萌发率几乎为零。蕙兰种子自然萌发情况也不例外。所以，种子无菌播种技术尤其适合兰科植物。至今为止，兰科植物应用无菌播种与快速育苗等组织培养技术，已有成功的例子，如申请(专利)号为200510010765，
专利名称：为"珍贵杂交兰花的育种与繁殖方法"；申请(专利)号为200510022588，名称"春兰种子组织培养育苗方法"；一些洋兰如大花蕙兰、蝴蝶兰等均有无菌播种成功的例子。到目前为止，有关蕙兰种子无菌萌发和快速繁殖方面的报道甚少，仅见本人文章"蕙兰种子无菌萌发及植株再生"，《浙江农业学报》2008，20(4)，231235。但以上文章关于蕙兰种子无菌萌发的研究中只是粗略提到所选用基本培养基为改良MS，并没有公开改良MS的具体配方；并且对处理对象的播种前预处理和灭菌处理过程采用的方法操作较繁琐，极易造成污染。在现有报道的所有文献中仍存在蕙兰种子萌发率低(约为10%以下)、萌发周期长(半年至一年以上)、播种程序复杂(见本人报道)等问题，使其无法实现大规模工厂化生产。
发明内容本发明目的是要解决以上现有技术的缺陷，提出一种适于蕙兰种子高频率无菌萌发的优化培养基配方；本发明的另一目的是提出一种应用该配方对蕙兰种子进行高频、快速、简便、低成本萌发的方法。本发明提出的适于蕙兰种子无菌萌发的优化培养基由基本培养基及培养基添加物相配制而成，各成分含量为1)基本培养基选用自行改良MS培养基(具体组分见表1)，即在原来MS培养基的基础上，将MS基本培养基中的氯化钙440mg/L替换为硝酸钶500mg/L和氯化钾200mg/L;另外的大量元素成分不变，但含量都有所调整；微量元素、有机成分及铁盐成分及含量均同于MS基本培养基；蔗糖或白糖2030g/L，琼脂为57g/L，pH为5.05.6;2)种子萌发培养基基本培养基+6-BA0.51.0mg/L+NAA0.51.0mg/L+活性碳1g/L+椰子汁50100ml/L。蕙兰应用上述组培培养基进行快速无菌萌发的方法，包括如下步骤-1)培养基的配制，包括基本培养基与种子萌发培养基添加物含量为-(1)基本培养基改良MS，其中蔗糖2030g/L，琼脂为57g/L，pH为5.05.6;(2)萌发培养基基本培养基+6-BA0.51.0mg/L+NAA0.51.0mg/L+活性碳1g/L+椰子汁50100ml/L;2)处理对象的选取取自授粉后生长68个月的蒴果(尚未开裂)为处理对象；3)处理对象的预处理将处理对象于冰箱微冷冻层13'C条件下处理IO天。4)处理对象的无菌播种在无菌条件下将处理对象常规灭菌后用解剖刀纵切开，将种子接种在萌发培养基上。5)播种后处理将播种后的种子连同培养器皿放于暗培养条件下，温度2025'C。6)在无菌环境下，萌发后培养条件为温度2028'C，光强15002500LuX,光照时间1012h/d。本发明的有益效果是1)提出的蕙兰组培优化培养基针对性强、适用性好，种子萌发率高。通过改变基本培养基中大量元素成分、含量及添加适当的植物生长调节剂，将蕙兰种子萌发率由原来的5%以下提高到现在的20%以上，使高频率获得有益遗传性状成为可能，进而提高了育种效率。同时也可有效地挽救珍稀瀕危植物。2)该方法由于将蕙兰种子萌发时间縮短至23个月，进而大大縮短了蕙兰育种周期，使快速获得新的遗传改良成为可能。3)该方法操作简便，污染率降低到最小，适合工厂化播种生产蕙兰种苗。具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1(适于蕙兰种子无菌播种优化培养基及快速萌发方法1)1)培养基的配制，包括基本培养基与种子萌发培养基添加物含量为(1)基本培养基自行改良MS，其中蔗糖2030g/L，琼脂为6g/L，pH为5.2;(2)萌发培养基基本培养基+6-BAl.Omg/L+NAAl.Omg/L+活性碳1g/L+椰子汁50ml/L;2)处理对象的选取取自授粉后生长6个月尚未开裂的蒴果为处理对象；3)处理对象的预处理将处理对象于冰箱微冷冻层13'C条件下保存10天。4)处理对象的无菌播种从冰箱取出后用洗涤剂和自来水冲洗干净，在无菌条件下经75%酒精浸泡3.0min，再用0.1%升汞溶液灭菌15min，然后用无菌水冲洗35次，用解剖刀将处理对象纵切开，将种子均匀接种在萌发培养基上。5)播种后处理将播种后的种子连同培养器皿放于暗培养条件下，温度2025°C。培养期间如发现培养基表面较干燥，应及时添加无菌水，以保证种子处于湿润状态有利于及早萌发。6)在无菌环境下，萌发后培养条件为温度2028'C，光强15002500LuX，光照时间1012h/d。实施例2(适于蕙兰种子无菌播种优化培养基及快速萌发方法2)1)培养基的配制，包括基本培养基与种子萌发培养基添加物含量为(1)基本培养基改良MS，其中蔗糖30g/L，琼脂为5g/L，pH为5.6;(2)萌发培养基基本培养基+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性碳1g/L+椰子汁100ml/L;2)处理对象的选取取自授粉后生长7个月尚未开裂的蒴果为处理对象；3)处理对象的预处理将处理对象于冰箱微冷冻层i3t:条件下保存io天。4)处理对象的无菌播种从冰箱取出后用洗涤剂和自来水冲洗干净，在无菌条件下经75%酒精浸泡3.0min，再用0.1%升汞溶液灭菌15min，然后用无菌水冲洗35次，用解剖刀将处理对象纵切开，将种子均匀接种在萌发培养基上。5)播种后处理将播种后的种子连同培养器皿放于暗培养条件下，温度2025°C。培养期间如发现培养基表面较干燥，应及时添加无菌水，以保证种子处于湿润状态有利于及早萌发。6)在无菌环境下，萌发后培养条件为温度2028'C，光强20002500LuX，光照时间1012h/d。本发明采用上述种子无菌萌发培养基及与之配套的快速萌发方法后，种子萌发率高，从播种到萌发所需时间明显縮短且操作简便污染率低。表l改良MS基本培养基组分<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采取等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。权利要求1、一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物，其特征在于基本培养基和种子萌发培养基的各组分及每升所含重量为1)基本培养基选用自行改良MS，即在原来MS培养基的基础上，将MS基本培养基中的氯化钙440mg/L替换为硝酸钙500mg/L和氯化钾200mg/L；蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂为5～7g/L，pH为5.0～5.6；2)种子萌发培养基基本培养基+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.5～1.0mg/L，活性碳1g/L，椰子汁50-100m/L。2、一种适宜蕙兰种子无菌萌发的组培方法，其特征在于该方法按以下步骤进行1)培养基的配制，基本培养基和种子萌发培养基的各组分及每升所含重量为-(1)基本培养基选用自行改良MS，即在原来MS培养基的基础上，将MS基本培养基中的氯化钙440mg/L替换为硝酸钙500mg/L和氯化钾200mg/L;蔗糖或白糖2030g/L，琼脂为57g/L，pH为5.05.6;(2)种子萌发培养基基本培养基+6-BA0.51.0mg/L+NAA0.51.0mg/L，活性碳lg/L，椰子汁50m/L;2)处理对象的选取取自授粉后生长68个月尚未开裂的蒴果为处理对象；3)处理对象的预处理将处理对象于冰箱微冷冻层13'C保存10天；4)处理对象的无菌播种在无菌条件下将处理对象常规灭菌后用解剖刀纵切开，将种子接种在种子萌发培养基上；5)播种后处理将播种后的种子连同培养器皿放于暗培养条件下，温度2025'C;6)在无菌环境下，萌发后培养条件为温度2028"C，光强150025(K)LuX，光照时间1012h/d。3、根据权利要求2所述的适宜蕙兰种子无菌萌发的组培方法，其特征在于该方法按以下步骤进行1)培养基的配制，基本培养基和种子萌发培养基的各组分及每升所含重量为-(1)基本培养基改良MS，其中蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.4;(2)种子萌发培养基基本培养基+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+活性碳lg/L+椰子汁50ml/L;2)处理对象的选取取自授粉后生长68个月尚未开裂的蒴果为处理对象；3)处理对象的预处理将处理对象于冰箱微冷冻层13。C保存10天；4)处理对象的无菌播种在无菌条件下将处理对象常规灭菌后用解剖刀纵切开，将种子接种在种子萌发培养基上；5)播种后处理将播种后的种子连同培养器皿放于暗培养条件下，温度2025'C;6)在无菌环境下，萌发后培养条件为温度2028。C，光强15002500LuX，光照时间1012h/d。全文摘要本发明主要涉及一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物及其方法，基本培养基和种子萌发培养基的各组分及每升所含重量为基本培养基选用自行改良MS，即在原来MS培养基的基础上，将MS基本培养基中的氯化钙440mg/L替换为硝酸钙500mg/L和氯化钾200mg/L；蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂为5～7g/L，pH为5.0～5.6；种子萌发培养基基本培养基+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.5～1.0mg/L，活性碳1g/L，椰子汁50-100m/L。本发明的有益效果是1)提出的蕙兰组培优化培养基针对性强、适用性好，种子萌发率高。2)该方法大大缩短了蕙兰育种周期，使快速获得新的遗传改良成为可能。3)该方法操作简便，污染率降低到最小。文档编号A01G31/00GK101622955SQ200910101739公开日2010年1月13日申请日期2009年8月11日优先权日2009年8月11日发明者孙崇波,张姗姗,林森洪,秦德辉,郭方其,侠黎申请人:浙江省农业科学院