具有缩短的Raphanus片段(SRF)的新的芸苔属Ogura恢复系的制作方法

专利名称：具有缩短的Raphanus片段(SRF)的新的芸苔属Ogura恢复系的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有缩短的Raphanus片段的新的芸苔属系，该缩短的Raphanus片段 包括用于Ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因。本发明还涉及缩短任何植物中包含目的 基因的外源插入物的新的育种方法。
背景技术：
来自芸苔属(Brassica)植物的含油种子是日益重要的作物。作为植物油的来源， 其目前在商业市场容量中只位于大豆和棕榈科之后。油可以用于多种用途，例如沙拉油或 烹调油。提取油时，粕可以用作饲料来源。称为油菜籽的芸苔属种子，在其最初形式时，对人体是有害的，这是由于其油中相 对高水平的芥酸和粕中相对高水平的硫代葡萄糖苷。芥酸在天然栽培品种中是普遍存在 的，含量为总脂肪酸成分重量的30-50%。硫代葡萄糖苷在芸苔属种子中是不需要的，因为 其在油的提取和消化过程中，通过酶的裂解可以导致抗营养物分解产物的产生。植物科研 工作者鉴定出低芥酸菜籽油的种质来源，攻克了芥酸问题(StefanSSOn，“The Development of Improved Rapeseed Cultivars (改良油菜籽栽培品种的培育)·，x‘High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils (高芥酸和低芥酸菜籽油)”中(第 6 章)，由 John K. G. Kramer, Frank D. Sauer 和 Wallace J. Pigden编辑·加拿大学术出版社(Academic Press Canada)，多伦多 (1983))。最近，植物科研工作者致力于将总硫代葡萄糖苷在含水量8. 5%的整粒种子中的 含量降低至少于20ymol/g的水平。这可以通过核共振成像(NRI)或高效液相色谱(HPLC) 来测定(国际标准化组织，参考号ISO 91671 1992)。特别吸引植物科研工作者的是所谓的“双低(double-low) ”品种该品种油中的 芥酸低并且在油提取后残留的固体粕中硫代葡萄糖苷低(即芥酸含量低于总脂肪酸成分 重量的2%，并且硫代葡萄糖苷在无油粕中的含量低于30ymol/g)。在加拿大首次培育出 的这些更高品质的油菜种类，称为加拿大油菜(canola)。另外，植物科研工作者已经尝试改善菜籽油的脂肪酸特征(profile) (Robbelen, “Changes and Limitations of Breeding for Improved Polyenic Fatty Acids Content in Rapeseed (油菜籽中改良的多烯脂肪酸含量的育种改变和局限性).” "Biotechnology for the Oils and Fats Industry (用于油类和脂肪产业的生物技术)”(第10章)， edited by Colin Ratledge, Peter Dawson and James Rattray(Colin Ratledge、Peter Dawson 禾口 James Rattray 编辑)，American Oil Chemists' Society(美国石油化学家 学会)，(1984) ； Rat ledge, Colin, Dawson, Peter 禾口 Rattray，James, (1984)(用于油类 和脂肪产业的生物技术).American Oil Chemists' Society(美国石油化学家学会)， Champaign ；328pp ；Robbelen and Nitsch. Genetical and Physiological Investigations on Mutants for Polyenic Fatty Acids in Rapeseed, Brassica napus L.(甘蓝型油菜菜 籽中多烯脂肪酸突变体的遗传学和生理学调查)Z.Planzenzuchta. ,75 =93-105, (1975)； Rako and McGregor. “Opportunities and Problems in Modification of Levels ofRapeseed C18 Unsaturated Fatty Acids (油菜籽C18不饱和脂肪酸的水平的改变的机遇 和问题).”J.Am. Oil Chem. Soc. (1973)50(10) :400_403)。这些参考文献是该尝试的代表。目前，自由授粉品种和芸苔属杂种都在栽培。在培育改良的芸苔属杂种中，育种 者可以利用不同的授粉控制系统，例如自交不亲和(Si)、细胞质雄性不育(CMS)和核雄性 不育(NMS)芸苔属植物作为母本。在杂种作物育种中，植物育种者探索从雄性系和雌性系 的结合或杂交中能导致更高作物产量(谷类或生物质)的杂种优势(heterosis或hybrid vigor)现象。使用这些植物，育种者尝试改善种子生产的效率和Fl杂种的品质以及降低育 种成本。当在二元杂交中不使用SI、CMS或匪S植物进行杂交时，在子代(progeny，Fl代) 获得和分离所需要的性状更为困难，因为亲本能够经历异花授粉和自花授粉。如果亲本中 的一个是不能产生花粉的SI、CMS或NMS植物，那么只会发生异花授粉。如果亲本是相同品 质的并且育种者进行单交，那么通过在二元杂交中去除一个亲本品种的花粉，植物育种者 可以保证获得相同品质的杂种种子。在一个实例中，Fl杂种的产生包括将CMS芸苔属母本和产生花粉的芸苔属父本进 行杂交。但是为了有效繁殖，Fl杂种的父本必须具有育性恢复基因(Rf基因)。Rf基因的 存在意味着Fl代不会完全地或部分地不育，以便可以发生自花授粉或异花授粉。Fl代的自 花授粉对于确保Fl植物为种植者提供优异的产量来说是理想的。Fl代的自花授粉对于确 保所需要的性状是可遗传的和稳定的来说也是理想的。一种细胞质雄性不育并用于育种的芸苔属植物是Ogura(OGU)细胞质雄性不育 (Pe11an-Delourme, et al. ， (1987)Male fertility restoration in Brassica napus with radish cytoplasmic male sterility Proc. 7th Int. Rapeseed Conf. , Poznan, Poland, 199-203)。Ogura细胞质雄性不育植物的育性恢复系已经被位于法国雷恩市 (Rennes)的法国国力农业科学院(Institut National de Recherche Agricole(INRA)) 从萝卜(Raphanus sativus(radish))转移至丨J 芸苔属(Pelletier and Primard, (1987) "Molecular, Phenotypic and Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed (油菜籽内线粒体重组体的分子、表型和遗传特征)."Proc. 7th Int Rapeseed Conf. , Poznau, Poland 113-118)。源自萝卜的恢复基因Rf 1的描述见于 WO 92/05251 和 Delourme, et al. ， (1991) "Radish Cytoplasmic Male Sterility in Rapeseed :Breeding Restorer Lines with a Good Female Fertility (油菜轩中的萝卜 细胞质雄性不育具有良好雌性能育性的育种恢复系)."Proc 8thlnt. Rapeseed Conf.， Saskatoon, Canada. 1506—1510。但是，当Ogura Raphanus恢复基因从萝卜转移到芸苔属时，大段Raphanus基因 组也渗入到芸苔属中。这个大Raphanus基因组片段不但携带了恢复基因而且还携带了 很多不希望的性状。例如，早期恢复系种质是不适当的，因为携带该大Raphanus片段的 近交种和杂种恢复系的硫代葡萄糖苷水平升高并且该恢复系与结籽_每个长角果胚珠的 数目的降低有关(Pellan-Delourme and Renard, (1988) "Cytoplasmic male sterility in rapeseed(Brassica napus L. ) :Female fertility of restored rapeseed with ‘‘Ogura，，and cybrids cytoplasms)，，，Genome 30 234~238 ；Delourme, et al. , (1994), "Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica napus L. )Theor.Appl. Gener. 88 :741_748)。在杂种的情况下，即使母本具的硫代葡萄糖苷含量降低时，硫代 葡萄糖苷水平依然升高。所述水平通常大于无油粕的30 μ mol/g,超过世界上大部分监管机 构所允许的种子注册的硫代葡萄糖苷水平。因此，早期恢复系种质可以用于研究用途，不能 直接培育加拿大油菜品质的商业杂种品种。对于Ogura细胞质不育，INRA列出了与获具有低硫代葡萄糖苷水平的恢复系有 ^^SXt (Delourme, et al. , (1994) "Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica napus L. )Theor. Appl. Gener. 88 741-748 ；Delourme, et al., (1995)"Breeding Double Low Restorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L.(油菜籽(甘蓝型油菜)的萝卜细胞质雄性不育中双低恢 复系的育种))，，，Proc. 9th Int. Rapeseed Conf.，Cambridge, England)。IRNA 表明这些困 难是由于在其育种材料中雄性育性恢复和硫代葡萄糖苷含量的关联造成的。IRNA建议更多 的萝卜的遗传信息需要从其恢复系中去除。(Delourme，etal.，(1995) "Breeding Double Low Restorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L.)(油菜籽(甘蓝型油菜)的萝卜细胞质雄性不育双低恢复系的育种)”，Proc. 9th Int. Rapeseed Conf.，Cambridge，England)。尽管在前些年对恢复系进行了改良，但是对 恢复系进行的同工酶研究表明，该大段萝卜遗传信息仍然保留在恢复基因周围(Delourme， et al. , (1994) "Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica napus L. ) ”，Theor. Appl. Gener. 88 :741_748)。INRA尝试培育硫代葡萄糖苷水平降低的恢复系。其报道了具有15 μ mol/g的杂 合恢复系(Delourme ,et al. , (1995) "Breeding Double Low Restorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L. ) (_胃禾子
的萝卜细胞质雄性不育双低恢复系的育种)”，Proc. 9th Int. Rapeseed Conf.，Cambridge， England) 0但是，(i)该恢复系对于恢复基因是杂合(Rfrf)的不是纯合(RfRf)的，(ii)该 恢复系是单交植物(single hybrid plant)而不是近交系，(iii)只有单独的数据点表明 该恢复系具有低硫代葡萄糖苷水平，而不是多数据点来支持低硫代葡萄糖苷水平，(iv)没 有数据证明低硫代葡萄糖苷性状是否会传递给该恢复系的子代，并且(ν)该恢复系是在单 一环境中选择和评价的_即没有证明在田间试验时所述低硫代葡萄糖苷性状在连续代中 是稳定的。因此，该最初的芸苔属Ogura恢复系不适于商业用途。出于本公开的目的，该材 料称为“最初的(original)”芸苔属恢复系。改良的恢复系由Charne, et al.，(1998)WO 98/27806 "Oilseed Brassica Containing an improved fertility restorer gene for Ogura cytoplastic male sterility (含有针对Ogura细胞质雄性不育的改良的育性恢复基因的含油种子芸苔属)，， 制造。所述改良的恢复系具有Ogura细胞质雄性不育的纯合的(固定的)恢复基因(RfRf) 并且含油种子是低硫代葡萄糖苷的。因为该恢复系是纯合的(RfRf)，所以其可以用于培育 恢复系近交种，或者作为雄性近交种，用于制造用于商业产品培育的单交种(single cross hybrid)组合。硫代葡萄糖苷水平低于不同国家在加拿大油菜标准中制定的硫代葡萄糖苷 水平，并且育种者可以使用改良的恢复系来生产具有低硫代葡萄糖苷水平含油种子的芸苔
8属近交种和杂种。这对于农作业者是有益的，他们可以种植授粉后产生具有低硫代葡萄糖 苷水平含油种子的芸苔属杂种。该育种成果去除了约三分之二的最初的Raphanus片段。这 是基于14个RFLP、AFLP和SCAR标记中丢失了 10个而估计的(W098/56948Tulsieram，et al. ,1998-12-17)。但是，该材料中的Raphanus片段仍然是不必要地大。为了本公开的目 的，该材料称为“第一期重组(first phase recombinant) ”芸苔属恢复系或种质。尽管在“第一期重组”恢复系种质中有所改良，但是仍然与不利的农艺学性能 有关。这些不利的性状可以来自该Raphanus片段内与能育性无关的基因。实际上，只 有Raphanus片段中的恢复基因是加拿大油菜CMS授粉系统所需要的。因此，恢复系中的 Raphanus片段越短，该恢复系预期的表现就越好。Ogura 恢复基因已经被 DNA LandMarks Inc. /McGill University (美国专利申请 公开第2003/0126646A1号，WO 03/006622A2)、三菱(Mitsubishi)(美国专利申请公开第 2004/0117868A1号)和INRA(WO 2004/039988A1)分离和克隆。该基因可以用于转化芸苔
属植物。其他人已尝试产生具有缩短的Raphanus片段的恢复系。例如，法国国力农业科 学院(INRA)通过将具有Pgi-2等位基因缺失的恢复系“R211”杂交并与双低甘蓝型油菜 (B. napus)系Drakkar杂交而培育了具有缩短的Raphanus片段的系。子代植物在减数分离 前用Y射线照射以诱导重组。这产生了一种子代植物“R2000”，其中来自甘蓝(Brassica oleracea)的 Pgi-2 基因发生重组(W0 2005/002324 和 Theor. Appl. Genet (2005) 111 736-746)。但是，R2000中的Raphanus片段大于本申请人培育的并在上文描述的第一期重 组恢复系材料中的Raphanus片段。另一个实例，即Syngenta的WO 05074671描述了在其BLRl重组事件中缩短的 Raphanus片段。该BLRl重组事件只是通过杂交和选择来产生，然后用分子标记筛选；没有 使用诱变。但是Raphanus片段可以进一步缩短。发明概述本发明一方面提供了包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植物， 其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段缺乏 选自以下的标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、 RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。所述芸苔 属植物可以缺乏Raphanus片段中的0PC2标记。本发明另一方面提供了包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植 物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段 (i)缺乏选自以下的标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33， 并且(ii)包含选自以下的分子标记RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、 RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、RMBl 1、RMB12、RMCOl、RMC02、RMC03、Ξ38Μ60、RMC04、 RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22 和 RMC23。所述芸 苔属植物可以称为R1439或其后代或通过将R1439与另一植物杂交产生的植物，R1439的代 表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41510。该芸苔属植物的子代(progeny)或后代 植物(descendent plant)可以包含缺乏选自以下的标记的Raphanus片段RMAOl、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC09、RMC10、RMClU RMC12、 RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、 RMC32 和 RMC33。本发明的另一方面是提供包含针对Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属 植物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段
(i)缺乏选自以下的标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMAlO、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33，并且
(ii)包含选自以下的分子标记RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、 RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、RMBl 1、RMB12、RMCOl、RMC02、RMC03、Ξ38Μ60、RMC04、RMC05、 RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMClU RMC12、RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC17、 RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22和RMC23。所述芸苔属植物可以称为R1815或其后代 或通过将R1815与另一植物杂交产生的植物，R1815的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB 登录号为41511。子代或后代植物可以包含缺乏选自以下的标记的Raphanus片段RMA01、 RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMAlO、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、 RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。本发明另一方面提供了包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植 物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段
(i)缺乏选自以下的标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMAlO、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33，并且
(ii)包含选自以下的分子标记RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、 RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、RMBl 1、RMB12、RMCOl、RMC02、RMC03、Ξ38Μ60、RMC04、RMC05、 RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15 和 RMC16。所述芸 苔属植物可以称为R1931或其后代或通过将R1931与另一植物杂交产生的植物，R1931的代 表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41512。子代或后代植物可以包含缺乏选自以下 的标记的 Raphanus 片段RMAO1、RMAO2、RMAO3、RMAO4、RMAO5、RMAO6、RMAO7、RMAO8、RMAO9、 RMAlO、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22、RMC23、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、 RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。任何上述芸苔属植物可以是甘蓝型油菜、芜菁(B. rapa)或芥菜(B. juncea)。所述 植物可以是近交种或杂种。本发明另一方面提供了来自任何上述芸苔属植物的芸苔属种子。另一方面提供了 来自任何上述芸苔属植物的植物细胞或上述植物的部分，所述部分可以选自核酸序列、组 织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、含油种子、小孢子、营养部分，无论是成熟的还是胚的。本发明另一方面提供了任一上述芸苔属植物的压碎的芸苔属种子的集合 (assemblage)。本发明另一方面提供了任何上述芸苔属植物的种子在制备油和/或粕中的用途。本发明另一方面提供了生产油的方法，其包括(i)压碎称为R1439、R1815或 R1931且NCIMB登录号分别为41510、41511和41512的植物系所产生的的种子，或者R1439、 R1815或R1931的后代所产生的种子或者通过将R1439、R1815或R1931与另一植物杂交产 生的植物所产生的种子；并且(ii)从所述种子中提取油。所述方法还可以包括(i)将所述油精炼、漂白和除臭的步骤。本发明另一方面提供了任何上述植物在栽培农作物中的用途。本发明另一方面提供了栽培芸苔属植物的方法，其包括(i)播种称为R1439、 R1815或R1931且NCIMB登录号分别为41510、41511和41512的种子，或者来自R1439、 R1815或R1931的后代的种子或者来自将R1439、R1815或R1931与另一植物杂交所产生的 植物的种子；并且(ii)在芸苔属生长条件下，栽培所得到的植物。本发明另一方面提供了任何上述植物在芸苔属系育种中的用途。所述育种可以选 自常规育种、系谱育种、杂交、自花授粉、加倍单倍体、单粒传法、回交和通过遗传转化育种。本发明另一方面提供了具有用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属 植物的育种方法，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所 述 Raphanus 片段缺乏选自以下的分子标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、 RMA07、RMA08、RMA09、RMAlO、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、 RMC32和RMC33，所述育种方法包括(i)将任何上述植物与另一芸苔属植物杂交，产生第一 代子代植物；(ii)筛选所述第一代子代植物的Ogura Raphanus恢复基因；以及(iii)任选 地重复步骤(i)和(ii)。所述第一代子代植物可以是近交植物。所述第一代子代植物可以 是杂种植物。还提供通过此方法所产生的子代植物。本发明另一方面提供了与第一植物中的Raphanus片段相比，具有缩短的 Raphanus片段的新系的育种方法，其中新系中缩短的Raphanus片段包括Ogura育性恢复 基因，所述方法包括(i)诱变具有Raphanus片段的第一植物的第一种群，所述Raphanus片 段具有用于细胞质雄性不育的Ogura育性恢复基因；(ii)筛选在所述Raphanus片段中缺 失Ogura育性恢复基因的第一种群，从而鉴定在Raphanus片段中缺失Ogura育性恢复基因 的第二植物；(iii)将在Raphanus片段中缺失Ogura恢复基因的第二植物与包含Raphanus 片段的所述第一植物杂交，所述Raphanus片段具有用于细胞质雄性不育的Ogura育性恢复 基因；(iv)鉴定与第一植物相比，具有缩短的Raphanus片段的第三植物，其中所述缩短的 Raphanus片段包括所述恢复基因，以及(ν)对第三植物进行育种以产生具有缩短的、包括 Ogura育性恢复基因的Raphanus片段的新系。第一植物可以是R1439、R1815或R1931。第 三植物可以缺乏选自以下的分子标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、 RMA08、RMA09、RMAlO、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和RMC33。还提供了通过此方法所产生的新系。本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :158中列出的任何序列所 示的序列的分离的核酸。本发明另一方面了提供了包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 158中列出的任何序列 所示的序列的分离的核酸在分子标记开发中的用途。本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :158中列出的任何序列所 示的序列的分离的核酸作为引物的用途。本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :158中列出的任何序列所 示的序列的分离的核酸作为探针的用途。本发明另一方面提供了用一个或多个SEQ ID NOS 1至158的序列筛选植物以表 征Raphanus片段的用途。
本发明另一方面提供了筛选植物来表征Raphanus片段的方法，其包括(i)将至 少一个选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 158的引物序列与植物基因组杂交；(ii)实施PCR 检测；以及(iii)表征Raphanus片段。本发明另一方面提供了在具有Raphanus片段的基因组中产生缺失突变体的方 法，所述Raphanus片段具有Ogura育性恢复基因，所述方法包括(i)提供细胞群，其中所 述细胞对于Raphanus片段是杂合的并且所述细胞具有Ogura CMS细胞质；(ii)诱变所述 细胞进行以产生诱变的细胞；(iii)由诱变的细胞产生植物；以及(iv)筛选所述植物的不 育性以鉴定缺失突变体中缺失的Ogura育性恢复基因，其中所述诱变的Ogura基因不能恢 复具有Ogura CMS细胞质的植物中的能育性。诱变细胞的步骤可以包括照射。还提供通过 此方法所产生的缺失突变体。本发明另一方面提供了使具有Ogura恢复基因的Raphanus片段重组的方法，其 包括(i)提供在核基因组中具有Raphanus片段的植物，该Raphanus片段具有Ogura恢复 基因；(ii)将(i)的植物与核基因组中具有Raphanus片段的植物杂交，该Raphanus片段 中的Ogura恢复基因已经缺失；以及(iii)鉴定Raphanus片段已经发生重组的子代。(i) 的植物对于具有Ogura恢复基因的Raphanus片段可以是纯合的(RfRf)，(ii)的植物对于 Ogura恢复基因缺失的Raphanus片段可以是纯合的(RfRf")，来自对于Raphanus片段是 杂合的(Rf Rf")第一子代种群的子代，以允许(a)具有Ogura恢复基因的Raphanus片段 (Rf)和(b) Ogura恢复基因缺失的Raphanus片段(Rf~)以有效速率进行重组。该方法还可 以包括，将(a)不含有Raphanus片段(rfrf)且具有Ogura CMS细胞质的植物用(b)来自 对于核基因组中具有Ogura恢复基因的Raphanus片段和没有Ogura恢复基因的Raphanus 片段都是杂合的(RfRD的上述子代植物的花粉进行授粉，以产生在Ogura CMS细胞质中 对于Raphanus基因是杂合的第二子代种群，其中第二种群包含约50%具有rfRf基因型的 植物，约50%具有rfRf"基因型的植物以及Raphanus片段发生重组的一些子代(rfRf*)， 并且其中第二子代中Raphanus片段的分析得以促进，因为在分析Raphanus片段时没有干 扰。分析前，可以筛选第二种群子代植物的能育性。该方法还可以包括鉴定包含纯合的重 组Raphanus片段的植物的步骤。还提供了此方法所产生的具有重组Raphanus片段的子代 植物。本发明另一方面提供了用于缩短第一植物中外源插入物的方法，其中外源插入物 包括目的基因，所述方法包括(i)诱变具有包括目的基因的外源插入物的第一植物，以产 生具有缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物的第二植物；(ii)将第二植物与第一植物 杂交以产生第一种群，其中来自第一植物的外源插入物和来自第二植物的部分缺失的外源 插入物都可以重组；(iii)将第一种群的植物与不具有外源插入物的植物杂交以产生第二 植物种群；以及(iv)筛选第二植物种群以鉴定具有比第一植物中的外源插入物更短的外 源插入物的第三植物，其中所述第三植物中更短的外源插入物包括目的基因。本发明另一方面提供了具有比第一植物中的外源插入物短的外源插入物的新系 的育种方法，其中外源插入物包括目的基因，所述方法包括(i)诱变具有包括目的基因的 外源插入物的第一植物，以产生具有缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物的第二植物； (ii)将第二植物与所述第一植物杂交以产生第一种群，其中来自第一植物的外源插入物和 来自第二植物的部分缺失的外源插入物都可以重组；(iii)将第一种群的植物与不具有外源插入物的植物杂交以产生第二植物种群；以及(iv)筛选第二植物种群，以鉴定具有比第 一植物中的外源插入物短的外源插入物的第三植物，其中第三植物中更短的外源插入物包 括目的基因。之前的两个方法还可以包括产生包围并包括外源插入物的基因组区的遗传信息 的步骤。遗传信息的产生可以选自产生分子标记、序列信息和遗传图谱。第一植物经历步 骤(i)中的诱变后对于目的基因可以是杂合的。第一植物在步骤(ii)中与第二植物杂交 后对于目的基因可以是纯合的。第二植物在步骤(ii)中与第一植物杂交后对于缺乏目的 基因的、部分缺失的外源插入物可以是纯合的。所述方法在步骤(ii)后还可以包括使用所 述遗传信息鉴定具有来自第一植物的外源插入物和来自第二植物的部分缺失的外源插入 物的植物的步骤。所述方法还可以包括增加步骤(ii)的种子的步骤。所述方法还可以包 括对第三植物进行育种以产生商业系的步骤。外源插入物可以是Raphanus插入物，并且目 的基因可以是Ogura育性恢复基因。外源插入物可以包括选自以下的目的基因抗病性、抗 虫性、耐旱性、耐热性、抗裂荚性和改善的谷物质量。还提供了以上两方法中任一方法所产 生的第三植物。本发明另一方面提供了选自SEQ ID NOS 159至237的分子标记。本发明另一方面提供了一个或多个SEQ ID NOS 159至237的序列筛选植物以表 征Raphanus片段的用途。本发明另一方面提供了表征具有包含Ogura育性恢复基因的Raphanus片段的植 物基因组的方法，其包括(i)利用选自SEQ ID NO 159至SEQ ID NO 237的序列筛选所述 植物基因组，以及(ii)表征Raphanus片段。本发明另一方面提供了用于表征包含选自SEQ ID NOS :159至237的标记的 Raphanus片段的标记/引物的组合。本发明另一方面提供了用于表征包含选自SEQ ID NOS 1至158的引物的 Raphanus片段的试剂盒。所述试剂盒还可以包含标记信息。本发明另一方面提供了包含R1439、R1815或R1931重组事件的芸苔属植物。附图简要说明本发明将结合附图进行描述，其中


图1说明在⑴最初的芸苔属Ogura恢复系(NW3002)、(ii)第一期重组芸苔属 Ogura恢复系(NW1717)和(iii)具有缩短的Raphanus片段(SRF)的新的第二期重组芸苔 属Ogura恢复系中所作的改良。图2表示与NW1717中第一期重组Raphanus片段和最初的系NW3002相比，突变体 系Rl、R2和R5以及SRF系R1439、R1815和R1931中丢失的分子标记。图3表示缩短的Raphanus片段(SRF)开发的杂交图。图4表示描述用于缩短外源插入物的一般方法的连续图。定义CMS 表示细胞质雄性不育并且是一类可用于杂种种子生产的雄性不育。重叠群是通过组装染色体的重叠的测序片段而生成的DNA的连续序列。重叠群 还是代表基因组的重叠区的一组克隆。术语重叠群还可以用于表示显示染色体重叠区位置 的染色体图谱，连续的DNA节段在该位置处重叠。重叠群图谱很重要，因为其提供了通过检
13查一系列重叠克隆来研究基因组的完整并通常大的节段的能力，然后所述重叠克隆提供关 于该区的完整连续的信息，例如物理尺度和方向。保持系(也称为B-系)(Maintainer line (also known as B-Iine))保持系是携 带天然细胞质(即非CMS)并且携带与细胞质雄性不育(CMS)系相同的核遗传性的系。当 与CMS系杂交时，其“保持”CMS系子代的不育性。因此，其与CMS系具有基本上相同的核遗 传信息，但不是雄性不育。所述保持系是能育植物并且可以产生其自身的能育子代。最初的恢复系(也称为最初的芸苔属Ogura恢复系)这些系是最初的芸苔属 Ogura恢复系，并且当恢复基因在纯合条件下存在时，携带高硫代葡萄糖苷性状。因此这些 系不能商业化或用于商业种子生产。这些系的实例是
图1所示的NW3002。第一期重组恢复系或种质(也称为第一期重组芸苔属Ogura恢复系或种质)基 于标记测量，这些系含有小于最初的恢复系的Raphanus片段。当恢复基因在纯合条件下 时，这些系不携带高硫代葡萄糖苷性状。因此，这些系可在商业上使用。这些系的实例公 Jf^ Charne, et al.， (1998)WO 98/27806 "Oilseed Brassica Containing an improved fertility restorer gene for Ogura cytoplastic male sterility (含有针对 Ogura 细 胞质雄性不育的改良的育性恢复基因的含油种子芸苔属)”中。另一实例是
图1所示的 NW1717。第一期重组恢复系与具有缩短的Raphanus片段的第二期重组恢复系的区别在于 存在很多标记，例如(i)
图1所示的0PC2标记和(ii)图2所示的标记RMC24至RMC33，包 括 RMC24 和 RMC33，以及 RMA01 至 RMA10，包括 RMA01 和 RMA10。缺失突变体系(Rf")这些系含有突变的Raphanus片段，其中所述片段上的 Raphanus恢复基因和其他Raphanus基因缺失。为本申请人的教导的目的，这些系称为Rf~。 当突变的Raphanus片段(除去恢复基因)在纯合条件下时，突变体系称为Rf~Rr，并且当 其细胞质是Ogura CMS时，这些系是不育的。当突变的Raphanus片段在杂合条件下时，所述 系称为Rf~Rf或Rf~rf，这对本领域技术人员是已知的。例如，Rf~Rf表示一个等位基因包含 所述突变的Raphanus片段(除去恢复基因)，并且另一等位基因包含第一期重组Raphanus 片段(具有恢复基因)。在Rf~Rf的情况下，当其细胞质是Ogura CMS时，所述系是能育的。 Rf'rf表示一个等位基因包含突变的Raphanus片段(除去恢复基因)，并且另一等位基因 根本不含有Raphanus片段。对于Rfrf，当其细胞质是Ogura CMS时，所述系是不育的。这 些突变体系用于产生具有缩短的Raphanus片段(SRF)的系，所述Raphanus片段包含恢复 基因(参见下文)。第二期重组恢复系或种质(也称为第二期重组芸苔属Ogura恢复系，具有缩短的 Raphanus片段(SRF)的第二期重组芸苔属Ogura恢复系或Rf*)这些系含有约一半的第一 期重组恢复系中发现的Raphanus片段(通过丢失的标记的数目估计)，并且包括Raphanus 恢复基因。这些系的实例包括
图1所示的本发明的R1439、R1815和R1931。为本申请人教 导的目的，这些系称为Rf*。当SRF在纯合条件下时，所述系称为Rf*Rf*。当SRF在杂合条 件下时，所述系称为Rf*Rf或Rf*rf，其中Rf*Rf是指包含具有SRF的一个等位基因和具有 来自第一期重组系的Raphanus片段的另一等位基因的系，Rf*rf指包含具有SRF的等位基 因和根本不含有Raphanus片段的另一等位基因的系。无论Rf*Rf*、Rf*Rf或Rf*rf，当其 细胞质是Ogura CMS时，所有这些SRF系都是能育的。不同实施方案的描述
最初的芸苔属Ogura恢复系由INRA通过将Ogura恢复基因从萝卜转移到甘 M M^ M W (Pelletier, et al. , (1987) "Molecular, Phenotypic and Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed(油菜轩内线粒体重组 体的分子、表型和遗传特征)”Proc. 7th Int Rapeseed Conf. , Poznau, Poland 113-118)。 这些系包括赋予高硫代葡萄糖苷性状的一个基因或多个基因。在
图1中，这些最初的系以 NW3002作为示例。第一期重组芸苔属Ogura恢复系由不同研究所培育，本申请人是其中之一。第 一期重组恢复系去除了赋予高硫代葡萄糖苷性状的一个基因或多个基因。在
图1中，这 些第一期重组恢复系以NW1717作为示例。但是，所述第一期重组恢复系仍然携带大量的 Raphanus基因组(
图1)。此外，某些系伴有不希望的农艺学特性。这些不希望的性状可以 来自剩余的Raphanus片段中的基因或者来自芸苔属染色体上基因的去除/破坏。本教导涉及具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组芸苔属Ogura恢复系。 第二期重组芸苔属Ogura恢复系通过以下步骤培育(i)使用细菌人工染色体(BAC)重叠 群为第一期重组恢复系中的Raphanus片段制备物理图谱(数据未显示)，(ii)用高密度 标记在第一期重组恢复系中对Raphanus片段作图，(iii)产生第一期重组芸苔属Ogura恢 复系的敲除突变种群，(iv)筛选敲除突变种群并鉴定具有第一期重组Raphanus片段包括 Ogura恢复基因的不同缺失的突变体系，(ν)将突变体系与第一期重组恢复系杂交以提供 在Raphanus基因座重组的机会，并产生具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组恢 复系，(vi)在具有Ogura恢复基因和缩短的Raphanus片段(SRF)的系中鉴定新的重组， (vii)表征具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组恢复系，(viii)测试具有SRF的 第二期重组恢复系的更好的能育性、胚胎发生和农艺学，以及(ix)将新的第二期重组恢复 系与另外的系杂交以产生商业系。提供了以下实施例，作为本发明的具体示例。但是，应当理解，本发明不限于实施 例中所示的具体细节。实施例1.制备第一期重组芸苔属Ogura恢复系NW1717中Raphanus片段的高密 度标记图。图2显示了第一期重组芸苔属Ogura恢复系NW1717上的高密度标记。标记特异 性用一组系谱系即6个恢复系和6个非恢复系进行了研究。只有那些对Ogura恢复系是特 异的标记才用于筛选敲除突变种群和随后本发明的SRF材料(参见下文)。
权利要求
1.包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属(Brassica)植物，其中所述育 性基因位于从萝卜(Raphanus sativa)基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片 段缺乏选自以下的标记RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC3URMC32 和 RMC33。
2.如权利要求1所述的芸苔属植物，其中所述Raphanus片段缺乏0PC2标记。
3.如权利要求1所述的芸苔属植物，其中所述Raphanus片段包含选自以下的分子标 记RMBO1、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、 RMBl 1、RMB12、RMCOl、RMCO2, RMC03、Ξ38Μ60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC17、 RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22 和 RMC23。
4.如权利要求1所述的芸苔属植物，其中所述Raphanus片段包含选自以下的分子标 记RMBO1、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、 RMB11、RMB12、RMCO1、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、 RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22 和 RMC23。
5.如权利要求1所述的芸苔属植物，其中所述Raphanus片段包含选自以下的分子标 记RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、 RMB11、RMB12、RMCO1、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、 RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15 和 RMC16。
6.称为R1439的权利要求3所述的芸苔属植物或其后代或通过将R1439与另一植物杂 交产生的植物，所述R1439的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41510。
7.如权利要求6所述的芸苔属植物的子代或后代植物，其中所述子代或后代植物包含 缺乏选自以下的标记的 Raphanus 片段RMAO1、RMAO2、RMAO3、RMAO4、RMAO5、RMAO6、RMAO7、 RMA08、RMA09、RMA10、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC24、0PC2、 RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。
8.称为R1815的权利要求4所述的芸苔属植物或其后代或通过将R1815与另一植物杂 交产生的植物，所述R1815的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41511。
9.如权利要求8所述的芸苔属植物的子代或后代植物，其中所述子代或后代植物包含 缺乏选自以下的标记的 Raphanus 片段RMAO1、RMAO2、RMAO3、RMAO4、RMAO5、RMAO6、RMAO7、 RMA08、RMA09、RMAlO、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。
10.称为R1931的如权利要求5所述的芸苔属植物或其后代或通过将R1931与另一植 物杂交产生的植物，所述R1931的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41512。
11.如权利要求10所述的芸苔属植物的子代或后代植物，其中所述子代或后代植物 包含缺乏选自以下的标记的 Raphanus 片段RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、 RMA07、RMA08、RMA09、RMAlO、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22、RMC23、RMC24、0PC2、 RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。
12.使用如权利要求1所述的植物产生的近交芸苔属植物。
13.使用如权利要求1所述的植物产生的杂种芸苔属植物。
14.来自如权利要求1所述的芸苔属植物的芸苔属种子。
15.来自如权利要求1所述的芸苔属植物的植物细胞。
16.如权利要求1所述的芸苔属植物的部分。
17.压碎的如权利要求14所述的芸苔属种子的集合。
18.生产油的方法，包括⑴压碎称为R1439、R1815或R1931且NCIMB登录号分别为41510,41511和41512的 植物系所产生的种子，或者R1439、R1815或R1931的后代所产生的种子或者通过将R1439、 R1815或R1931与另一植物杂交产生的植物所产生的种子；并且( )从所述种子中提取油。
19.如权利要求1中所述的植物在芸苔属系育种中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述育种选自常规育种、系谱育种、杂交、自花授 粉、加倍单倍体、单粒传法、回交和通过遗传转化育种。
21.与第一植物中的Raphanus片段相比，具有缩短的Raphanus片段的新系的育种方 法，其中所述新系中所述缩短的Raphanus片段包括Ogura育性恢复基因，所述方法包括(i)诱变具有Raphanus片段的所述第一植物的第一种群，所述Raphanus片段具有 Ogura育性恢复基因；(ii)筛选在所述Raphanus片段中缺失所述Ogura育性恢复基因的所述第一种群，从而 鉴定在所述Raphanus片段中缺失所述Ogura育性恢复基因的第二植物；(iii)将在所述Raphanus片段中缺失Ogura恢复基因的所述第二植物与包含具有 Ogura育性恢复基因的所述Raphanus片段的所述第一植物进行杂交；(iv)鉴定与所述第一植物相比，具有缩短的Raphanus片段的第三植物，其中所述缩短 的Raphanus片段包括所述恢复基因，以及(ν)对所述第三植物进行育种以产生具有缩短的、包括Ogura育性恢复基因的 Raphanus片段的新系。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述第一植物是R1439。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述第一植物是R1815。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述第一植物是R1931。
25.通过如权利要求21所述的方法产生的新系。
26.分离的核酸，包含SEQID NO :1至SEQ ID NO :158中列出的任何序列所示的序列。
27.如权利要求沈所述的分离的核酸在分子标记开发中的用途。
28.如权利要求沈所述的分离的核酸筛选植物以表征Raphanus片段的用途。
29.在具有Raphanus片段的基因组中产生缺失突变体的方法，所述Raphanus片段具有 Ogura育性恢复基因，所述方法包括(i)提供细胞群，其中所述细胞对于所述Raphanus片段是杂合的，并且所述细胞具有 Ogura CMS细胞质；( )诱变所述细胞以产生诱变的细胞；(iii)由所述诱变的细胞产生植物；(iv)筛选所述植物的不育性以鉴定缺失突变体中缺失的Ogura育性恢复基因，其中所 述诱变的Ogura基因不能恢复具有所述Ogura CMS细胞质的植物中的能育性。
30.通过如权利要求四所述的方法产生的缺失突变体。
31.使具有Ogura恢复基因的Raphanus片段重组的方法，包括(i)提供在核基因组中具有Raphanus片段的植物，所述Raphanus片段具有Ogura恢复基因；( )将(i)的植物与在核基因组中具有Raphanus片段的植物杂交，所述Raphanus片 段中的Ogura恢复基因已经缺失；以及(iii)鉴定所述Raphanus片段已经发生重组的子代。
32.如权利要求31所述的方法，其中(i)的植物对于具有Ogura恢复基因的所 述Raphanus片段是纯合的(RfRf)，(ii)的植物对于所述Ogura恢复基因已经缺失的 Raphanus片段是纯合的(RfRD，且来自第一子代种群的子代是杂合的(Rf Rf~)，以允许 (a)具有Ogura恢复基因的所述Raphanus片段(Rf)和(b)所述Ogura恢复基因已经缺失 的Raphanus片段(Rf~)以有效的速率进行重组。
33.如权利要求32所述的方法，其还包括将(a)不含有Raphanus片段(rfrf)并且具有 Ogura CMS细胞质的植物用(b)来自如权利要求34所述的对于Raphanus片段Ogura恢复基 因是杂合的(RfRD子代植物的花粉进行授粉，以产生第二子代种群，其中所述第二种群 包含约50%具有rfRf基因型的植物，约50%具有rfRf"基因型的植物以及所述Raphanus 片段已发生重组(rfRf*)的一些子代，并且其中促进了所述第二种群中所述Raphanus片段 的分析，因为在分析所述Raphanus片段时没有干扰。
34.具有比第一植物的外源插入物更短的外源插入物的新系的育种方法，其中所述外 源插入物包括目的基因，所述方法包括(i)诱变具有包括目的基因的所述外源插入物的所述第一植物以产生具有缺乏所述目 的基因的部分缺失的外源插入物的第二植物；( )将所述第二植物与所述第一植物杂交以产生第一种群，其中来自所述第一植物的 所述外源插入物和来自所述第二植物的所述部分缺失的外源插入物都可以发生重组；(iii)将所述第一种群的植物与不具有所述外源插入物的植物杂交以产生第二植物种群；(iv)筛选所述第二植物种群以鉴定具有比所述第一植物中的所述外源插入物更短的 外源插入物的第三植物，其中所述第三植物中更短的外源插入物包括目的基因。以及(ν)繁殖所述第三植物以产生新系。
35.如权利要求34所述的方法，其还包括产生包围并包括所述外源插入物的基因组区 的遗传信息的步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述产生遗传信息可以选自产生分子标记、序列 信息和遗传图谱。
37.如权利要求35所述的方法，其还包括在步骤(ii)后使用所述遗传信息鉴定具有来 自所述第一植物的外源插入物和来自所述第二植物的部分缺失的外源插入物的植物的步马聚ο
38.如权利要求34所述的方法，其中所述外源插入物包括选自以下的性状的目的基 因抗病性、抗虫性、耐旱性、耐热性、抗裂荚性和改善的谷物质量。
39.如权利要求34所述的新系在进一步育种中的用途。
40.选自SEQID NOS :159至237的分子标记。
41.一个或多个如权利要求40所述的标记筛选植物以表征Raphanus片段的用途。
42.包含重组事件R1439的芸苔属植物。
43.包含重组事件R1815的芸苔属植物。
44.包含重组事件R1931的芸苔属植物。
全文摘要
提供了具有缩短的Raphanus片段的新的芸苔属Ogura育性恢复系。该新的系缺乏OPC2标记并能够在Ogura细胞质雄性不育(cms)植物中完全恢复能育性。改良的系使用新的育种方法培育。新的育种方法可以用于缩短任何植物中包含目的基因的外源插入物。
文档编号A01H5/00GK102083989SQ200980109801
公开日2011年6月1日 申请日期2009年2月5日 优先权日2008年2月6日
发明者张永平, 洛马斯·塔尔斯尔曼, 贾扬提拉勒·D·帕特尔 申请人:先锋国际良种公司