专利名称：一种复合型昆虫病毒增效剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种复合型昆虫病毒增效剂，本发 明还涉及该增效剂的制备方法。
背景技术：
杆状病毒在害虫的可持续治理中呈现出诱人的前景，国内外已经有多种杆状病毒 应用于害虫的生物防治。其中NPV已经被成功地应用于害虫的防治。NPV是我国第一个商 品化昆虫病毒杀虫剂，具有使用安全，害虫不产生抗药性等优点。但病毒对昆虫的致死作用 相对缓慢，通常在1周 2周，在这种情况下，尽管害虫最终被病毒杀死，但害虫被致死前往 往已经对农林作物造成了不可挽回的经济损失，这也正是昆虫病毒杀虫剂在生产应用上的 主要瓶颈问题之一，许多昆虫病毒杀虫剂因此而不被生产单位所采纳。因此，研究和利用昆 虫病毒的增效剂，来缩短害虫的致死时间、增强昆虫病毒的杀虫效率，最大程度地挽回害虫 对农林作物造成的损失具有重要的现实意义。CryIAB毒蛋白是来源苏云金杆菌的昆虫特异性毒素蛋白，其作用目前认为是对昆 虫的中肠结构产生了破坏，而对人畜无害(Xu W. T. et al. ,Food andChemical Toxicology, 2009,47(7) :1459-1465)。对该蛋白的研究主要集中在将该蛋白编码基因转入植物获得抗 虫转基因植物(Peferoen M. ,Trends inBiotechnology, 1997,15 (5) 173-177) 但目前的 研究发现，一些昆虫已经对CryIAB产生了抗性，意味着单用CryIAB毒蛋白防治害虫并不可 靠(ffu X.Y.et al. ,Journal of Invertebrate Pathology, 2009,102(1) :44_49)。但禾 Ij 用 CryIAB毒蛋白作为病毒的增效剂截止目前尚无报道。斑蝥素(Cantharidin，CltlH12O4)是来源于鞘翅目(Coleopera)芫菁科(Meloidae) 昆虫体内的一种天然单萜类昆虫毒素，是斑蝥体内的防卫性物质。斑蝥素的化学名称为exo 型，1，2顺式-二甲基，3，6-氧桥六氢化邻苯二甲酸酐；分子量为196. 2。斑蝥素目前主要 的应用和研究在医药上，已经有斑蝥素及其衍生物的医药产品，主要作为为抗癌有效物质， 对多种癌症有治疗作用，除抗癌外，尚有治疗病毒性慢性乙型肝炎、白血病、狂犬病、皮肤感 染的作用。在农药方面，斑蝥素具有一定的的杀虫作用，斑蝥素对多种害虫表现有拒食、胃 毒和一定的触杀作用。斑蝥素添加饲喂后可引起菜蛾幼虫某些细胞及组织发生病变，其中 最为明显的是中肠组织(张志勇，植物保护学报，1998，25 (2) 166-170) 0通过对粘虫中肠 组织病理学观察结果，为研究斑蝥素对昆虫的作用方式提供了最直观的证据，斑蝥素的胃 毒作用能引起粘虫瘫痪并大量失水而死亡，对试虫中肠细胞膜和内膜系统的破坏作用可能 是斑蝥素的主要致毒机理之一，主要表现在它很容易穿过细胞膜结构，可能与杯状细胞和 其它细胞内的线粒体上某个位点有亲合性，阻断了杯状细胞和线粒体的正常功能，引起相 关的代谢失调或受阻，进而引起杯状细胞和线粒体的解体死亡(张雅林，昆虫学报，2003， 46 [3] :272-276)。由于CryIAB毒蛋白和斑蝥素都是作用于昆虫中肠的毒素，能够对昆虫中 肠结构造成一定程度的破坏；而昆虫病毒侵染虫体也是通过中肠组织侵入，CryIAB毒蛋白 和斑蝥素是否有助于病毒的侵染，是本发明的切入点。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合型昆虫病毒增效剂，能够达到提高昆虫病毒杀虫剂 杀虫活性、提高防治效果的作用。本发明的另一目的是提供一种上述增效剂的制备方法。本发明所采用的技术方案是，一种复合型昆虫病毒增效剂，按照体积百分比，由以 下组分组成毒素蛋白水溶液2% -8%斑蝥素乳油0.3% -1. 5%Tween-80 乳化剂1 % _3 %其余为IXPBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100%。本发明所采用的另一技术方案是，一种制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，具体 按照以下步骤实施步骤1 制备毒素蛋白水溶液1)构建表达毒素蛋白基因工程菌株；2)诱导表达毒素蛋白；3)收集表达毒素蛋白；4)制备活性毒素蛋白水溶液；步骤2 制备复合型昆虫病毒增效剂按照体积百分比，量取2% -8%的步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0. 3% -1. 5%的 斑蝥素乳油，1 % _3 %的Tween-80乳化剂，其余为1 X PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比 之和为100 %，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂。本发明的特点还在于，其中的构建表达毒素蛋白基因工程菌株，具体按照以下步骤实施从分离的 Bacillus thuringiensis中克隆获得CryIAB基因，通过基因克隆、测序鉴定无误后，构建 表达载体PET-28a-CryIAB，表达载体电击转化E. coli BL21，获得含有CryIAB毒素蛋白基 因的工程菌株 E. coli BL21-28a-CryIAB。其中的诱导表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施挑取工程菌株E. coliBL21单 菌落，接种在IOml含有100ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37°C、200r/min振荡培 养过夜，按体积百分比为接种于含lOOug/ml氨苄青霉素IL液体LB培养基中，37°C、 260r/min培养至菌液0D600为0. 3-0. 5时，加入适当浓度的IPTG，进行诱导表达，25-35°C， 200-320rpm，诱导 4_8hr。其中的收集表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施IL表达菌经过6000rpm离心 5min收集，IOOmlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去培养基成分，重复以上过程1_2次，离 心收集菌体，10ml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎菌体，强度10-20HZ，处理3_10s，间隔 lmin，重复2-6次，获得粗裂解液，以粗裂解液作为CryIAB毒素蛋白母液。其中的制备活性毒素蛋白水溶液，具体按照以下步骤实施1L粗裂解CryIAB毒素 蛋白母液中添加苯甲酸钠0. 5-1. 5g。其中的斑蝥素乳油的质量浓度为0. 1%。
本发明的有益效果是，利用基因工程表达的CryIAB毒素蛋白和斑蝥素复配作为 昆虫杆状病毒的生物增效剂，对昆虫NPV和GV病毒均具有明显的增效作用，可显著缩短病 毒对害虫的致死时间，对研发绿色环保的生物农药和可持续农业的发展具有积极意义。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细说明。基因工程表达的CryIAB毒蛋白和斑蝥素在极其微量的添加水平(10 80ug/L) 对试虫虽然没有明显的毒杀作用，但可以明显缩短昆虫病毒NPV或GV对害虫的致死时间。 因此，利用基因工程表达的C毒素蛋白和斑蝥素作为昆虫病毒生物增效剂，就可以有效地 克服了传统病毒防治中害虫感染后发病时间长、造成经济损失相对化学农药较大的缺点。本发明复合型昆虫病毒增效剂，按照体积百分比，由以下组分组成毒素蛋白水溶液(0. 5g/L) 2% -8%斑蝥素乳油(0.) 0. 3% -1. 5%Tween-80 乳化剂1 % _3 %其余为1 XPBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100%。本发明复合型昆虫病毒增效剂的制备方法，具体按照以下步骤实施步骤1 a.制备毒素蛋白水溶液(1)毒素蛋白基因来源与表达毒素蛋白基因工程菌株构建从分离的Bacillus thuringiensis中克隆获得CryIAB基因，通过基因克隆、测序 鉴定无误后，构建表达载体PET-28a-CryIAB。表达载体电击转化成Ε. coliBL21，获得含有 CryIAB毒素蛋白基因的工程菌株E. coliBL21-28a_CryIAB。CryIAB基因的序列为ATGGATAACAATCCGAACATCAATGAATGCATTCCTTATAATTGTTTAAG
TAACCCTGAAGTAGAAGTATTAGGTGGAGAAAGAATAGAAACTGGTTACACCCCAATCGATATTTCCTTGTCGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTGAATTTGTTCCCGGTGCTGGATTTGTGTTAGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTTTTGGTCCCTCTCAATGGGACGCATTTCTTGTACAAATTGAACAGTTAATTAACCAAAGAATAGAAGAATTCGCTAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTAGAAGGACTAAGCAATCTTTATCAAATTTACGCAGAATCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGATCCTACTAATCCAGCATTAAGAGAAGAGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCCCTTACAACCGCTATTCCTCTTTTTGCAGTTCAAAATTATCAAGTTCCTCTTTTATCAGTATATGTTCAAGCTGCAAATTTACATTTATCAGTTTTGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAAA
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ATGCGAAGCGACTTAGTGATGAGCGGAATTTACTTCAAGATCCAAACTTTAGAGGGATCAATAGACAACTAGACCGTGGCTGGAGAGGAAGTACGGATATTACCATCCAAGGAGGCGATGACGTATTCAAAGAGAATTACGTTACGCTATTGGGTACCTTTGATGAGTGCTATCCAACGTATTTATATCAAAAAATAGATGAGTCGAAATTAAAAGCCTATACCCGTTACCAATTAAGAGGGTATATCGAAGATAGTCAAGACTTAGAAATCTATTTAATTCGCTACAATGCCAAACACGAAACAGTAAATGTGCCAGGTACGGGTTCCTTATGGCCGCTTTCAGCCCCAAGTCCAATCGGAAAATGTGCCCATCATTCCCATCATTTCTCCTTGGACATTGATGTTGGATGTACAGACTTAAATGAGGACTTAGGTGTATGGGTGATATTCAAGATTAAGACGCAAGATGGCCATGCAAGACTAGGAAATCTAGAATTTCTCGAAGAGAAACCATTAGTAGGAGAAGCACTAGCTCGTGTGAAAAGAGCGGAGAAAAAATGGAGAGACAAACGTGAAAAATTGGAATGGGAAACAAATATTGTTTATAAAGAGGCAAAAGAATCTGTAGATGCTTTATTTGTAAACTCTCAATATGATAGATTACAAGCGGATACCAA
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7毒素蛋白10_40mg/L，含斑蝥素3-15mg/L。使用浓度稀释1000倍。即以1%。比例添加到 使用的病毒悬浮液中。增效剂主要成分的使用终浓度为毒素蛋白10-40ug/L，含斑蝥素 3_15ug/L。实施例1步骤1:a.制备毒素蛋白水溶液(1)诱导表达毒素蛋白挑取工程菌株E. coli BL21-28a-CryIAB单菌落，接种在IOml含有100ug/ml氨苄 青霉素的液体LB培养基中，37°C、200r/min振荡培养过夜。按(V/V)接种于含IOOug/ ml氨苄青霉素IL液体LB培养基中，37°C、260r/min培养至菌液0D600为0. 3-0. 5时，加入 适当浓度的IPTG (终浓度IOuM)，进行诱导表达，25-35°C，200-320rpm，诱导4_8hr。(2)表达蛋白的收集IL表达菌经过6000rpm离心5min收集，IOOmlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去 培养基成分；重复以上过程1-2次。离心收集菌体，IOml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎 菌体(强度10-20HZ ；处理3-lOs，间隔lmin，重复2_6次)，获得粗裂解液。以粗裂解液作 为CryIAB毒素蛋白母液。经过测定表达的毒蛋白含量约0. 5g/L。(3)活性蛋白水溶液制备IL粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0. 5-1. 5g。b.制备斑蝥素乳油称取1克斑蝥素溶解于300ml 二甲基甲酰胺，溶解后加入lOOmlTween-80，用苯甲 醇补足至1L，配制得0. 斑蝥素乳油1L。步骤2 制备复合型昆虫病毒增效剂按照体积百分比，量取2%步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0. 3%的步骤1制备的 斑蝥素乳油，1 %的Tween-80乳化剂，其余为1 XPBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和 为100%，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白10mg/L，含 斑蝥素3mg/L。使用浓度稀释1000倍。即以1%。比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效 剂主要成分的使用终浓度为毒素蛋白lOug/L，含斑蝥素3ug/L。实施例2步骤1:a.制备毒素蛋白水溶液(1)诱导表达毒素蛋白挑取工程菌株E. coli BL21-28a-CryIAB单菌落，接种在IOml含有100ug/ml氨苄 青霉素的液体LB培养基中，37°C、200r/min振荡培养过夜。按(V/V)接种于含IOOug/ ml氨苄青霉素IL液体LB培养基中，37°C、260r/min培养至菌液0D600为0. 3-0. 5时，加入 适当浓度的IPTG (终浓度IOuM)，进行诱导表达，25-35°C，200-320rpm，诱导4_8hr。(2)表达蛋白的收集IL表达菌经过6000rpm离心5min收集，IOOmlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去 培养基成分；重复以上过程1-2次。离心收集菌体，IOml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎 菌体(强度10-20HZ ；处理3-lOs，间隔lmin，重复2_6次)，获得粗裂解液。以粗裂解液作为CryIAB毒素蛋白母液。经过测定表达的毒蛋白含量约0. 5g/L。(3)活性蛋白水溶液制备IL粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0. 5-1. 5g。b.制备斑蝥素乳油称取1克斑蝥素溶解于300ml 二甲基甲酰胺，溶解后加入lOOmlTween-80，用苯甲 醇补足至1L，配制得0. 斑蝥素乳油1L。按照体积百分比，量取8%步骤1制备的毒素蛋白水溶液，1. 5%的步骤1制备的 斑蝥素乳油，3%的Tween-80乳化剂，其余为1 XPBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和 为100%，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白40mg/L，含 斑蝥素15mg/L。使用浓度稀释1000倍。即以1%。比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效 剂主要成分的使用终浓度为毒素蛋白40ug/L，含斑蝥素15ug/L。实施例3步骤1 a.制备毒素蛋白水溶液(1)诱导表达毒素蛋白挑取工程菌株E. coli BL21-28a-CryIAB单菌落，接种在IOml含有100ug/ml氨苄 青霉素的液体LB培养基中，37°C、200r/min振荡培养过夜。按(V/V)接种于含IOOug/ ml氨苄青霉素IL液体LB培养基中，37°C、260r/min培养至菌液0D600为0. 3-0. 5时，加入 适当浓度的IPTG (终浓度IOuM)，进行诱导表达，25-35°C，200-320rpm，诱导4_8hr。(2)表达蛋白的收集IL表达菌经过6000rpm离心5min收集，IOOmlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去 培养基成分；重复以上过程1-2次。离心收集菌体，IOml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎 菌体(强度10-20HZ ；处理3-lOs，间隔lmin，重复2_6次)，获得粗裂解液。以粗裂解液作 为CryIAB毒素蛋白母液。经过测定表达的毒蛋白含量约0. 5g/L。(3)活性蛋白水溶液制备IL粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0. 5-1. 5g。b.制备斑蝥素乳油称取1克斑蝥素溶解于300ml 二甲基甲酰胺，溶解后加入lOOmlTween-80，用苯甲 醇补足至1L，配制得0. 斑蝥素乳油1L。按照体积百分比，称取5%步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0. 7%的步骤1制备的 斑蝥素乳油，2%的Tween-80乳化剂，其余为1 XPBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和 为100%，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白25mg/L，含 斑蝥素7mg/L。使用浓度稀释1000倍。即以1%。比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效 剂主要成分的使用终浓度为毒素蛋白25ug/L，含斑蝥素7ug/L。本发明病毒增效剂分别以棉铃虫核型多角体病毒HearNPV和小菜蛾颗粒体病毒 PxGV为例，进行室内生物测定，以明确本发明增效剂和病毒复配后的增效作用。①HearNPV增效试验供试药剂按以下处理，分别口服感染试虫，每处理幼虫40只X3个重复
A.病毒对照病毒HearNPV用1 XPBS稀释至终浓度为1 X 103PIB/mloB.增效剂对照复合型病毒增效剂用IXPBS稀释1000倍。C.病毒+增效剂组合病毒HearNPV用IXPBS稀释至终浓度为1 X 103PIB/ml, 和复合型病毒增效剂按999 1的比例混合。D.阴性对照(无病毒或增效剂)1XPBS缓冲液。试虫与感染方法2龄蜕皮后饥饿处理12hr的3龄棉铃虫，独立放置于饲养格中，分别将以上A、B、 C、D不同处理的药液5ul加到人工饲料块上，确保每只试虫将含药液的饲料块完全取食后， 再加入新的无毒饲料，按常规方法养殖。数据统计与分析逐日统计试虫的死亡率，用增效剂对照死亡率校正个药剂处理组的死亡率，计算 LT5tl和LT9tl，采用DPS系统进行数据分析处理。结果显示上述三种不同配比的增效剂，病毒 +增效剂组合比病毒对照组的LT5tl和LT9tl分别至少缩短了 1. 45d和1. 89d，LT50和LT9tl比对 照缩短达到29%和21%以上；增效剂对照组死亡率与阴性对照基本一致，无显著差异，表 明低浓度的毒素蛋白和斑蝥素对试虫的死亡率无明显影响。②PxGV增效试验供试药剂按以下处理，分别口服感染试虫，每处理幼虫40只X3个重复A.病毒对照病毒PxGV用IXPBS稀释至终浓度为IX 104PIB/ml。B.增效剂对照复合型病毒增效剂用IXPBS稀释1000倍。C.病毒+增效剂组合病毒PxGV用IX PBS稀释至终浓度为1 X 104PIB/ml，和复 合型病毒增效剂按999 1的比例混合。D.阴性对照(无病毒或增效剂)1XPBS缓冲液。试虫与感染方法2龄蜕皮后饥饿处理12hr的3龄小菜蛾，分别将以上A、B、C、D不同处理的药液5ul 加到人工饲料块上，确保每只试虫将含药液的饲料块完全取食后，再加入新的无毒饲料，按 常规方法养殖。数据统计与分析逐日统计试虫的死亡率，用增效剂对照死亡率校正个药剂处理组的死亡率，计算 LT5tl和LT9tl，采用DPS系统进行数据分析处理。结果显示上述三种不同配比的增效剂，病毒 +增效剂组合比病毒对照组的LT5tl和LT9tl分别至少缩短了 1. 38d(23%以上)和2. 97d(27% 以上)；而增效剂对照组死亡率与阴性对照基本一致，无显著差异，表明低浓度的毒素蛋白 和斑蝥素对试虫的死亡率无明显影响。
权利要求
一种复合型昆虫病毒增效剂，其特征在于，按照体积百分比，由以下组分组成毒素蛋白水溶液2％ 8％斑蝥素乳油0.3％ 1.5％Tween 80乳化剂1％ 3％其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％。
2.根据权利要求1所述的复合型昆虫病毒增效剂，其特征在于，所述的斑蝥素乳油的 质量浓度为0. 1%。
3.一种制备权利要求1所述的复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，具体按照 以下步骤实施步骤1 制备毒素蛋白水溶液1)构建表达毒素蛋白基因工程菌株；2)诱导表达毒素蛋白；3)收集表达毒素蛋白；4)制备活性毒素蛋白水溶液；步骤2 制备复合型昆虫病毒增效剂按照体积百分比，量取2% -8%的步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0. 3% -1. 5%的斑蝥 素乳油，1 %-3%的Tween-80乳化剂，其余为1 XPBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和 为100%，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂。
4.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的 步骤1中构建表达毒素蛋白基因工程菌株，具体按照以下步骤实施从分离的Bacillus thuringiensis中克隆获得CryIAB基因，通过基因克隆、测序鉴定无误后，构建表达载体 PET-28a-CryIAB，表达载体电击转化E. coliBL21，获得含有CryIAB毒素蛋白基因的工程菌 株E.coli BL21-28a-CryIAB。
5.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步 骤1中诱导表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施挑取工程菌株E. coli BL21单菌落，接 种在IOml含有100ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37°C、200r/min振荡培养过夜，按 体积百分比为接种于含100ug/ml氨苄青霉素IL液体LB培养基中，37°C、260r/min培 养至菌液0D600为0. 3-0. 5时，加入适当浓度的IPTG，进行诱导表达，25-35°C，200-320rpm, 诱导4-8hr。
6.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步 骤1中收集表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施1L表达菌经过6000rpm离心5min收 集，IOOmlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去培养基成分，重复以上过程1-2次，离心收集 菌体，IOml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎菌体，强度10-20HZ，处理3-lOs，间隔lmin，重 复2-6次，获得粗裂解液，以粗裂解液作为CryIAB毒素蛋白母液。
7.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步 骤1中制备活性毒素蛋白水溶液，具体按照以下步骤实施IL粗裂解 CryIAB毒素蛋白母液 中添加苯甲酸钠0. 5-1. 5g。
8.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的斑 蝥素乳油的质量浓度为0. 1%。
全文摘要
本发明公开的一种复合型昆虫病毒增效剂，按照体积百分比，由以下组分组成毒素蛋白水溶液2％-8％，斑蝥素乳油0.3％-1.5％，Tween-80乳化剂1％-3％，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％。制备该增效剂的方法，具体按照以下步骤实施构建表达毒素蛋白基因工程菌株；诱导表达毒素蛋白；收集表达毒素蛋白；制备活性毒素蛋白水溶液；将上述组分混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂。本发明复合型昆虫病毒增效剂及其制备方法，制备过程简单，制备得到的增效剂能够达到提高昆虫病毒杀虫剂杀虫活性、提高防治效果的作用。
文档编号A01P7/04GK101919409SQ201010013630
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者刘强, 张雅林, 徐红星, 李坚, 王敦, 甘恩宇, 项林平 申请人:西北农林科技大学