专利名称：一种制备担子菌原生质体的试剂盒及其使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学研究领域，具体涉及一种制备担子菌原生质体的试剂盒及 其使用方法和应用。
背景技术：
原生质体的制备是细胞生物学研究领域的最广泛和最基本的技术。现有技术中常 用市售的蜗牛酶和纤维素酶等混合使用来制备原生质体，但制得原生质体的量比较少，活 力不高，且耗时。目前，国内外尚无适合制备担子菌原生质体的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备担子菌原生质体的试剂盒，该试剂盒用高活力的 酶，在最佳的酶解条件下，能快速制备出大量高质量的担子菌原生质体。本发明的目的还在于提供上述试剂盒的应用和使用方法，其应用领域广，使用方 法操作快速、简易，得率高。本发明提供的制备担子菌原生质体的试剂盒，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液Rl 或等渗缓冲液R2，所述的等渗缓冲液Rl包括硫酸镁和磷酸缓冲液，所述的等渗缓冲液R2包 括氯化钾和磷酸缓冲液。本发明所述的硫酸镁和氯化钾的摩尔浓度为5. 5 6. 0mol/Lo优选的，硫酸镁和氯化钾的摩尔浓度为6. 0mol/Lo本发明所述的磷酸缓冲液的PH为5. 6 5. 8，所述的磷酸缓冲液通过磷酸二氢钠 和磷酸氢二钠水溶液配制获得。优选的，磷酸缓冲液的PH为5. 8。等渗缓冲液Rl或等渗缓冲液R2的制备方法为按量取七水硫酸镁、磷酸二氢钠和 磷酸氢二钠(分析纯)，加双蒸水搅拌溶解后定容，采用湿热灭菌法，103. 4千帕蒸汽压温度 达121. 3°C，维持15 20min灭菌后装于塑料瓶，4°C保存。本发明提供的上述试剂盒在制备侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄 伞、云芝、蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳的原生质体中的应用。本发明提供的上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)按常规方法培养菌丝；(2)取常规培养的菌丝，过滤，用无菌水冲洗，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、 金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液Rl洗涤，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2洗 涤，将洗涤后菌丝置于离心管中，室温下离心后，收集菌丝；(3)对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，将担子菌裂解酶用溶液Rl配制成溶液后过滤除菌，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，将担子菌裂解酶用 溶液R2配制成溶液后过滤除菌，收集滤液到无菌离心管中，并加入收集的菌丝；(4)将离心管置于水浴中，间歇振摇进行水解反应；
(5)反应结束后，将反应液加入离心管中，离心后收集原生质体，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液Rl定容，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白 木耳，用溶液R2定容；(6)采用血球计数法计算原生质体的量，并冷藏保存备用。在上述步骤中步骤(3)中配制含担子菌裂解酶的Rl或R2溶液的质量浓度为10 15mg/mL。步骤(3)中过滤除菌用的微孔滤膜的直径为0. 22 μ m。步骤(3)中菌丝和含担子菌裂解酶的Rl或R2溶液的料液比为90 110mg/ml。步骤⑷中水浴的温度为28 30°C，反应时间为1. 5 2h。步骤⑵和步骤(5)中离心管的转速为lOOOrpm，离心时间为lOmin。本发明具有下述优点(1)操作快速、简易高效高质价廉，整个过程只需要约2h ；(2)得量高，反应2h所得到原生质体量约为IO5 IO6个/毫升酶液；(3)活性高，制备的原生质体保存在4°C冰箱，可存活3 5天；(4)细胞生长状态好，可满足对目的基因进行细胞融合、细胞学定位、免疫共沉淀、 Western杂交等多种研究目的。
具体实施例方式以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施 例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，如担子 菌裂解酶也可用其它类同的溶壁酶来取代，缓冲液的其他常规制备方法等，均可实现本发 明的目的。实施例1本实施例提供的制备担子菌原生质体的试剂盒，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液 Rl，等渗缓冲液Rl包括硫酸镁和磷酸缓冲液，硫酸镁的摩尔浓度为5. 5 6. Omol/L,最佳硫 酸镁浓度为6mol/L，磷酸缓冲液的PH为5. 6 5. 8，PH最佳为5. 8，硫酸镁溶液和磷酸缓冲 液的配制方法如下七水硫酸镁14. 8g，Na2HPO4 ·12Η20(分析纯)0. 57g,NaH2PO4 ·2Η20(分 析纯)2.87g，双蒸水80ml，搅拌溶解后，用双蒸水定容至100ml，采用湿热灭菌法，103. 4 千帕蒸汽压温度达121. 3°C，维持15 20min灭菌后装于塑料瓶，4°C保存。本实施例提供的上述试剂盒在制备侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽 黄伞或云芝的原生质体中的应用。本实施例提供的上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)按常规方法培养菌丝；(2)取常规培养的菌丝，过滤，用无菌水冲洗，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、 金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液Rl洗涤，洗涤后菌丝置于离心管中，室温下离心后，收集 菌丝；(3)对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，将担子菌裂解酶 用溶液Rl配制成溶液后过滤除菌，收集滤液到无菌离心管中，并加入收集的菌丝；(4)将离心管置于水浴中，间歇振摇进行水解反应；
(5)反应结束后，将反应液加入离心管中，离心后收集原生质体，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液R2定容；(6)采用血球计数法计算原生质体的量，并冷藏保存备用。在上述步骤中步骤(3)中配制的担子菌裂解酶Rl的质量浓度为10mg/mL。步骤(3)中过滤除菌用的微孔滤膜的直径为0. 22 μ m。步骤(3)中菌丝和担子菌裂解酶的Rl的料液比为100mg/ml。步骤(4)中水浴的温度为30°C，反应时间为1. 5h。步骤⑵和步骤(5)中离心管的转速为lOOOrpm，离心时间为lOmin。实施例2本实施例提供的制备担子菌原生质体的试剂盒，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液 R2，等渗缓冲液R2包括氯化钾和磷酸缓冲液，氯化钾的摩尔浓度为5. 5 6. Omol/L，最佳氯 化钾浓度为6mol/L，磷酸缓冲液的PH为5. 6 5. 8，PH最佳为5. 8，氯化钾溶液和磷酸缓冲 液的配制方法如下取氯化钾4. 5g，Na2HPO4 · 12H20(分析纯)0. 57g，NaH2PO4 · 2H20(分析 纯)2.87g，双蒸水80ml，搅拌溶解后，用双蒸水定容至100ml，采用湿热灭菌法，103. 4千 帕蒸汽压温度达121. 3°C，维持15 20分钟灭菌后装于塑料瓶，4°C保存。本实施例提供的上述试剂盒在制备蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳的原生质体中 的应用。本实施例提供的上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)按常规方法培养菌丝；(2)取常规培养的菌丝，过滤，用无菌水冲洗，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳， 用溶液R2洗涤，洗涤后菌丝置于离心管中，室温下离心后，收集菌丝；(3)对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2配制成溶液后过滤除菌，收集滤 液到无菌离心管中，并加入收集的菌丝；(4)将离心管置于水浴中，间歇振摇进行水解反应；(5)反应结束后，将反应液加入离心管中，离心后收集原生质体，对蘑菇、香菇、鸡 纵、灵芝或白木耳，用溶液R2定容；(6)采用血球计数法计算原生质体的量，并冷藏保存备用。在上述步骤中步骤(3)中配制的担子菌裂解酶Rl的质量浓度为15mg/mL。步骤(3)中过滤除菌用的微孔滤膜的直径为0. 22 μ m。步骤(3)中菌丝和担子菌裂解酶的Rl的重量体积比大概为95mg/ml。步骤(4)中水浴的温度为28°C，反应时间为2h。步骤⑵和步骤(5)中离心管的转速为lOOOrpm，离心时间为lOmin。实施例3本实施例提供的制备担子菌原生质体的试剂盒，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液 Rl或等渗缓冲液R2，等渗缓冲液Rl包括硫酸镁和磷酸缓冲液，等渗缓冲液R2包括氯化钾 和磷酸缓冲液。硫酸镁和氯化钾的摩尔浓度为5. 5 6. Omol/L,磷酸缓冲液的PH为5. 6 5. 8，磷酸缓冲液通过磷酸二氢钠和磷酸氢二钠加双蒸水配制获得。等渗缓冲液Rl或等渗缓冲液R2的制备方法为按量取七水硫酸镁或氯化钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(分析纯)，加双蒸水搅拌溶解后定容，采用湿热灭菌法，103. 4千帕蒸 汽压温度达121. 3°C，维持15 20min灭菌后装于塑料瓶，4°C保存。本实施例提供的上述试剂盒在制备侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽 黄伞、云芝、蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳的原生质体中的应用。本实施例提供的上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)按常规方法培养菌丝；(2)取经常规培养的菌丝，过滤，用无菌纯水冲洗菌丝2次，再用溶液R (根据菌的 不同选择合适的溶液Rl或R2)洗涤1次；(3)将菌丝置于无菌离心管中，室温以IOOOrpm离心IOmin去水分，并收集菌丝；(4)将担子菌裂解酶用溶液R配制成10 15mg/mL的溶液，经0. 22 μ m的微孔滤 膜过滤除菌，收集滤液到1. 5ml无菌离心管中，并取收集的菌丝IOOmg左右，保持菌丝和担 子菌裂解酶的R溶液的料液比为90 110mg/ml，将菌丝加入到该溶液中；(5)将离心管置于28 30°C水浴中，间歇振摇，水解反应1. 5 2h。(6)反应结束后，将反应液加入特制的离心管中，IOOOrpm离心lOmin，收集原生质 体，并用溶液R定容。(7)血球计数法计算原生质体的量，4°C保存备用。本实施例提供的试剂盒操作快速、简易，整个过程只需要约2h ；得量高，反应2h可 所得到原生质体量约为IO5 IO6个/毫升酶液。活性高，制备的原生质体保存在4°C冰箱， 可存活3 5天(原生质体的活力用染色法鉴定)。
权利要求
一种制备担子菌原生质体的试剂盒，其特征在于，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液R1或等渗缓冲液R2，所述的等渗缓冲液R1包括硫酸镁和磷酸缓冲液，所述的等渗缓冲液R2包括氯化钾和磷酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的制备担子菌原生质体的试剂盒，其特征在于，所述的硫酸镁 和氯化钾的摩尔浓度为5. 5 6. Omol/Lο
3.根据权利要求2所述的制备担子菌原生质体的试剂盒，其特征在于，所述的磷酸缓 冲液的PH为5. 6 5. 8，所述的磷酸缓冲液通过磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制获得。
4.权利要求1-3所述的试剂盒在制备侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄 伞、云芝、蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳的原生质体中的应用。
5.权利要求1-3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤(1)按常规方法培养菌丝；(2)取常规培养的菌丝，过滤，用无菌水冲洗，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针 菇、光帽黄伞或云芝，用溶液Rl洗涤，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2洗涤，将 洗涤后菌丝置于离心管中，室温下离心后，收集菌丝；(3)对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，将担子菌裂解酶用溶 液Rl配制成溶液后过滤除菌，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，将担子菌裂解酶用溶液 R2配制成溶液后过滤除菌，收集滤液到无菌离心管中，并加入收集的菌丝；(4)将离心管置于水浴中，间歇振摇进行水解反应；(5)反应结束后，将反应液加入离心管中，离心后收集原生质体，对侧耳、黑木耳、毛木 耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液Rl定容，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木 耳，用溶液R2定容；(6)采用血球计数法计算原生质体的量，并冷藏保存备用。
6.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中配制的含担子菌 裂解酶的Rl或R2溶液的质量浓度为10 15mg/mL。
7.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中过滤除菌用的微 孔滤膜的直径为0. 22 μ m。
8.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中菌丝和含担子菌 裂解酶的Rl或R2溶液的料液比为90 110mg/ml。
9.根据权利要求5所述的担子菌原生质体的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4) 中水浴的温度为28 30°C，反应时间为1. 5 2h。
10.根据权利要求5所述的担子菌原生质体的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤 (2)和步骤(5)中离心管的转速为lOOOrpm，离心时间为lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种制备担子菌原生质体的试剂盒，该试剂盒含有担子菌裂解酶等的溶壁酶和等渗缓冲液R1或等渗缓冲液R2，所述的等渗缓冲液R1包括硫酸镁和磷酸缓冲液，所述的等渗缓冲液R2包括氯化钾和磷酸缓冲液；还公开了上述试剂盒的应用及使用方法；该试剂盒操作快速、简易高效高质价廉，整个过程只需要约2h；得率高，细胞生长状态好，可满足对目的基因进行细胞融合、细胞学定位、免疫共沉淀、Western杂交等多种研究的目的。
文档编号A01G1/04GK101803530SQ201010129750
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月18日 优先权日2010年3月18日
发明者尹海滨 申请人:广州市元通医药科技有限公司