专利名称：：紫背天葵叶片组织培养的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种紫背天葵叶片组织培养的方法及其专用培养基。
背景技术：
：紫背天葵，学名GynurabicolorDC，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜，为菊科三七草属多年生宿根草本植物。其整个植株呈紫绿色，叶长卵型，边缘有锯齿，叶面绿色略带紫，背面紫红色具蜡质，有光泽，是有药用价值的野生蔬菜。紫背天葵作为一种值得推广的高营养保健蔬菜，含有较为丰富全面的营养成分，除一般蔬菜所具有的营养物质外，还富含可提高动物抗病能力，并对恶性生长细胞具有中度抗性的黄酮类化合物及铁、锰、锌等对人体有益的微量元素。在我国南方一些地区更是把紫背天葵作为一种补血的“良药”，是产后妇女食用的主要蔬菜之一。同时它也是很好的天然红色素原料，这种色素就是花青素。随着众多的合成色素被发现有毒害作用以及人们保健意识的增强，传统工业合成色素的应用范围逐步缩小，前期影响广泛的“苏丹红”事件使人们谈“红”色变；植物体花青素作为一种天然色素，安全、无毒、资源丰富，具有相当的营养和药理作用，对人类健康影响广泛，在食品、化妆品以及医药等方面有着巨大的应用潜力。紫背天葵可用扦插及种子繁殖，但主要采用扦插繁殖。但是长期使用无性繁殖易感染病菌，需用种子繁殖更新，或用组培技术脱毒重新育苗。组培技术具有繁殖速度快、不受季节影响等优点，同时建立高效的再生体系也是植物遗传转化的前提，利用转基因技术可以丰富种质资源，提高作物的抗逆性或改良其品质。对现有文献进行检索发现，林碧英、林义章在《植物生理学通讯》2003年第39卷第4期346页发表了题为“紫背天葵的组织培养和快速繁殖”；陈银龙等在《现代农业科技》2006年7月刊发表了“紫背天葵的组培快繁技术”，但两者所采用的外植体均为在带芽茎段，属于快繁技术，并不属于经典组织培养方法。遗传转化过程中，以叶片等为外植体的经典组培方法，要比以带芽茎段为外植体的快繁方法更有利于减少产生嵌合体，假阳性的现象。迄今为止，国内外尚未有紫背天葵以叶片为外植体的组织培养的报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种紫背天葵叶片诱导愈伤组织的专用培养基。本发明的紫背天葵叶片的愈伤组织诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基2，4-D、6_BA、碳源和凝胶剂；上述愈伤组织诱导培养基中2，4-D的终浓度是l-3mg/L、6-BA终浓度是0.2_lmg/L；上述愈伤组织诱导培养基中的MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。表1.MS基本培养液的溶质<table>tableseeoriginaldocumentpage4</table>上述紫背天葵叶片的愈伤组织诱导培养基中2，4-D的终浓度优选是2mg/L，6_BA的终浓度优选是0.5mg/L。上述紫背天葵叶片的愈伤组织诱导培养基中凝胶剂可以是琼脂、卡拉胶或Gelrite等，优选可是琼脂；所述琼脂的终浓度是7_9g/L；愈伤组织诱导培养基中的碳源可以是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，优选为蔗糖，蔗糖的终浓度是20-40g/L。本发明的另一目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种以紫背天葵叶片为外植体进行生产紫背天葵再生苗的方法。本发明的生产紫背天葵再生苗的方法，包括以下步骤1)将紫背天葵叶片置于上述愈伤组织诱导培养基上培养，诱导得到愈伤组织；2)将步骤1)得到的愈伤组织在分化培养基上培养，获得丛生芽；3)将步骤2)中获得的丛生芽进行诱导生根培养得到再生苗。上述步骤1)、步骤2)和步骤3)中培养的培养条件均可为温度为24-27°C，光照时间为14-18小时/天，光照强度为2000-30001UX。上述步骤2)中，分化培养基是在MS基本培养液中添加噻苯隆(TDZ，N_苯基-N'-1，2，3-噻二唑-5脲)48而3、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中噻苯隆(TDZ)的终浓度为0.2-0.8mg/L,AgNO3的终浓度为2_6mg/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。上述分化培养基中噻苯隆(TDZ)的终浓度优选为0.5mg/L,AgNO3的终浓度优选为4mg/L。本发明方法还在步骤2)和步骤3)之间还包括一丛生芽的伸长培养，所述伸长培养是将步骤2)得到的丛生芽接种到伸长培养基上培养，得到伸长的丛生芽。上述伸长培养的培养条件与步骤1)、步骤2)和步骤3)的培养条件一致。上述伸长培养基是在MS基本培养液中添加噻苯隆(TDZ)、AgNO3、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中噻苯隆(TDZ)的终浓度为0.2mg/L,AgNO3的终浓度为4mg/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。上述诱导生根培养是在生根培养基中进行的，所采用的生根培养基是在MS基本培养液中添加碳源和凝胶剂得到的固体培养基，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示ο本发明的方法还包括预处理步骤，该预处理步骤是将紫背天葵叶片置于70%(ν/ν)的酒精里灭菌20-40秒，用无菌水冲洗，再用滴加了吐温的0.1%(ν/ν)的升汞浸泡6-10分钟后，用无菌水冲洗干净。本发明中所采用的培养基(即分化培养基、伸长培养基和生根培养基)中的碳源可为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，优选为蔗糖，蔗糖的用量为在培养基中的终浓度为20-40g/L；凝胶剂可为琼脂、卡拉胶或Gelrite等，优选是琼脂，琼脂的用量可为在培养基中的终浓度为7-9g/L；凝胶剂的用量以能达到培养基的硬度为基础，可适当调整用里。本发明的诱导愈伤组织的培养基可有效地诱导紫背天葵叶片形成愈伤组织，由实施例1可知，其愈伤组织的诱导率达到了100%，愈伤组织的分化率达69%以上，分化得到丛生芽的增殖倍数平均为7.12，生根培养的生根率最高可达到100%。本发明第一次建立紫背天葵的经典组培体系，以紫背天葵叶片作为外植体进行繁殖，取材方便，来源充足，可高频率的诱导出大量的紫背天葵再生植株，产生的植株易于生根，再生植株成活率高，最高可达95%以上。而且具有再生植株变异性小，遗传稳定性高，若进行遗传转化，比以腋芽为外植体的再生系统的有假阳性率低的优点。本发明为扩大紫背天葵繁殖系数、种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础。图1为本发明实施例1紫背天葵叶片外植体的切割方法。图2为本发明实施例1诱导的愈伤组织。图3为本发明实施例1由愈伤组织分化的不定芽。图4为本发明实施例1紫背天葵再生苗。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、紫背天葵再生苗的获得及其统计观察1、愈伤组织的制备1)外植体的预处理选取幼嫩平展的紫背天葵(品种为红叶，购于北京市农林科学院蔬菜中心)叶片为外植体，先在70%(体积百分比)的酒精里灭菌30s，用无菌水冲洗5次，再用滴加了吐温的0.(体积百分比)的升汞浸泡8min，然后用无菌水冲洗干净。2)愈伤组织的获得将上述步骤1)中预处理好的紫背天葵叶片剪成IcmXIcm左右(切割方法如图1所示)的小块，叶背朝下的接种在紫背天葵叶片诱导愈伤组织的培养基上，在温度为26°C，光照强度为25001ux，光照时间为16小时/天的培养条件下培养约12天，得到愈伤组织(如图2所示)。上述紫背天葵叶片诱导愈伤组织的培养基是在MS基本培养液中添加2，4_D、6-BA、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；其中各物质的终浓度为2，4-D为2mg/L，6-BA为0.5mg/L，蔗糖为30g/L，琼脂为8g/L；培养基的pH为5.9，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。3)统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤2)中愈伤组织的诱导情况，实验结果见下表2。从表2可以看出，紫背天葵叶片在培养12天左右开始出现愈伤组织，培养20天后愈伤组织的诱导率可达到100%。表2.培养20天后愈伤组织的诱导率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</table>2、愈伤组织分化丛生芽及统计观察1)丛生芽的分化将上述步骤1中步骤2)得到的愈伤组织培养生长40天时，转接到分化培养基上，在温度为26°C，光照强度为25001UX，光照时间为16小时/天的培养条件下培养约42天时开始出现芽点，分化得到丛生芽(如图3所示)。在分化诱导丛生芽的过程中为得到所需数量的丛生芽，可每30天在相同培养基(即本实施例的分化培养基)上继代一次，也可根据各愈伤组织分化情况及时进行继代。上述分化培养基是在MS基本培养液中添加TDZ(噻苯隆，购自北京绿生源科技有限公司)、AgNO3、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；其中TDZ的终浓度为0.5mg/L,AgNO3的终浓度为4mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为8g/L；培养基的pH为5.9，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。2)统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤2中步骤1)丛生芽的分化情况。愈伤组织培养约42天时开始出现芽点，但其中只有70%的外植体能分化，这些外植体上可陆续分化出8-15不定芽，培养60天后，统计实验结果见下表3，从表3可以看出，愈伤组织的分化率可达到69%以上，分化得到丛生芽的增殖倍数平均为7.12。表3.分化培养的分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</table>3、伸长培养将步骤2中步骤1)诱导出的丛生芽进行分割，每2-5株一丛，转接到伸长培养基上，在温度为26°C，光照强度为25001UX，光照时间为16小时/天的培养条件下，诱导培养30天，得到伸长的丛生芽。上述伸长培养基是在MS基本培养液中添加TDZ(噻苯隆，购自北京绿生源科技有限公司)、AgNO3、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；其中TDZ的终浓度为0.2mg/L,AgNO3的终浓度为4mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为8g/L，培养基的pH为5.9，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。4、生根培养及统计观察1)生根培养得到再生苗将上述步骤3中得到的伸长至1.5-2cm的丛生芽植株分离成单株，转到生根培养基中，在温度为26°C，光照强度为25001UX，光照时间为16小时/天的培养条件下诱导生根培养约30天，最终得到紫背天葵再生苗。上述生根培养基是在MS基本培养液中添加蔗糖和琼脂得到的固体培养基，其中蔗糖的终浓度是30g/L，琼脂的终浓度是8g/L，培养基的PH=5.9；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。2)统计观察实验重复3次，统计观察上述步骤4中步骤1)的生根培养情况。培养30天后，统计实验结果见下表4，从表4可以看出生根培养丛生芽的生根率分别为100%，96%，92%，最高可达到100%，每株植株平均生根5.0根。表5.生根培养的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table>5、炼苗移栽将上述步骤4中得到的再生苗，进行炼苗，开盖将其与空气接触，26°C下生长5天；然后用流水洗去掉再生苗根系上的培养基，将其移栽到消毒栽培基质(蛭石草炭=11，体积比)中培养，得到紫背天葵再生植株(如图4所示)，再生植株的成活率可达95%以上。权利要求一种紫背天葵叶片的愈伤组织诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基2，4-D、6-BA、碳源和凝胶剂；所述愈伤组织诱导培养基中2，4-D的终浓度是1-3mg/L、6-BA终浓度是0.2-1mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。2.根据权利要求2所述的愈伤组织诱导培养基，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基中2，4-D的终浓度是2mg/L，6-BA的终浓度是0.5mg/L。3.根据权利要求1或2所述的愈伤组织诱导培养基，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基中凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选是琼脂；所述琼脂的终浓度是7_9g/L；所述愈伤组织诱导培养基中碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度是20-40g/L。4.一种生产紫背天葵再生苗的方法，包括以下步骤1)将紫背天葵叶片置于权利要求1-3中任一所述的愈伤组织诱导培养基上培养，诱导得到愈伤组织；2)将步骤1)得到的愈伤组织在分化培养基上培养，获得丛生芽；3)将步骤2)中获得的丛生芽进行诱导生根得到再生苗。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)中，所述分化培养基是在MS基本培养液中添加噻苯隆、AgNO3、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中噻苯隆的终浓度为0.2-0.8mg/L,AgNO3的终浓度为2_6mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述分化培养基中噻苯隆的终浓度为0.5mg/L，AgNO3的终浓度为4mg/L。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述分化培养基中，所述凝胶剂是琼月旨、卡拉胶或Gelrite，优选为琼脂，所述琼脂的终浓度为7_9g/L；所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，所述蔗糖的终浓度为20-40g/L。8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法在步骤2)和步骤3)之间还包括一丛生芽的伸长培养，所述伸长培养是将步骤2)得到的丛生芽接种到伸长培养基上培养，得到伸长的丛生芽。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述伸长培养基是在MS基本培养液中添加噻苯隆、AgNO3、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中噻苯隆的终浓度为0.2mg/L,AgNO3的终浓度为4mg/L；所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，所述蔗糖的终浓度为20-40g/L；所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选为琼脂，所述琼脂的终浓度为7_9g/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。10.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述诱导生根是在生根培养基中进行的，所述生根培养基是在MS基本培养液中添加碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖，所述蔗糖的终浓度为20-40g/L；所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选为琼脂，所述琼脂的终浓度为7_9g/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。全文摘要本发明公开了一种紫背天葵叶片组织培养的方法及其专用培养基。本发明提供的紫背天葵叶片诱导愈伤组织的培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基2，4-D、6-BA、碳源和凝胶剂；培养基中2，4-D的终浓度是1-3mg/L、6-BA终浓度是0.2-1mg/L。本发明的方法是将紫背天葵叶片置于诱导愈伤组织的培养基上培养得到愈伤组织后，进行分化培养得到丛生芽，丛生芽再诱导生根得到再生苗。本发明建立紫背天葵的经典组培体系，以紫背天葵叶片作为外植体进行繁殖，取材方便，来源充足，可高频率的诱导出大量的紫背天葵再生植株，产生的植株易于生根，再生植株成活率高，最高可达95％以上。文档编号A01H4/00GK101836593SQ20101019785公开日2010年9月22日申请日期2010年6月3日优先权日2010年6月3日发明者刘莉莎,温常龙,王玉珏,程琳,赵永钦,赵立群,郭仰东申请人:中国农业大学