专利名称：一种生产铁皮石斛的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种生产铁皮石斛的方法，具体涉及运用植物组 织培养技术生产铁皮石斛的方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobiumcandidum Wall, ex Lindl.)为兰科(Orchidaceae)石斛 属(Dendrobium)多年生附生草本植物，又名黑节草，是我国濒危珍稀的中药材。早在东汉 时期的《神农本草经》中已记载石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳赢瘦、强阴、久服厚肠 胃”。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首，有 “千金草”之称。现代药理学研究表明，铁皮石斛含有的多种有效成分，具有抗肿瘤、降血糖、 降血压、降血脂，以及抗氧化和抗诱变等作用。由于铁皮石斛属于附生药材，植株20 30cm高，生长十分缓慢，在自然条件下种 子萌发率低于5%。因此，在通常的栽培条件下，铁皮石斛由种子到开花需要3 4年，而且 需要与某些真菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的 成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生铁皮石斛资源的掠夺式采挖，其 生境被严重破坏，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。研究发现，通过铁皮石斛拟原球茎的生长增殖，来生产大量拟原球茎，获取其药用 成分是可行的。铁皮石斛拟原球茎(protocorm-like bodies，即PLBs)是正在生长分化的 体细胞胚胎，具有与原植株相同的物质代谢和形态发育潜能。通过拟原球茎的增殖分化，生 产大量的组培苗，使铁皮石斛实现低成本高效率的繁殖，是目前解决铁皮石斛资源短缺的 主要途径之一。野生铁皮石斛已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁 采摘。为此研究铁皮石斛拟原球茎的培养，实现产业化显得十分重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生产铁皮石斛的方法，以克服铁皮石斛资源 短缺的问题。本发明是通过如下技术方案实现的本发明所提供的是一种固体组织培养铁皮石斛拟原球茎的方法，它包括如下步 骤(1)无菌苗的选择和处理从无菌瓶中取出株高约3 IOcm的种苗，无菌条件下用解剖剪刀将植株的茎剪成 Icm长的带节的外植体，叶或根剪成Icm长的外植体。(2)拟原球茎的诱导和增殖将切好的外植体平放接种到拟原球茎诱导培养基中，每个组合接10瓶，每培养瓶 接种5个外植体。诱导和增值培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂4. 5g/L+NAA 0. 5mg/L+6_BA2mg/L。调整？!1为5.8。控制培养温度为(25士 1) °C，光强50 μ mol ·πΓ2 .s—1，每天光照12h。(3)拟原球茎继代培养方法将诱导出的拟原球茎在原诱导培养基中继代一次后，转入继代培养基上继代培 养，培养条件 MS+NAA 1. Omg/ml+6-BA 0. 5mg/ml+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 4. 5g/L，光照时间 12h/ d，光强 100 μ mo 1 · πΓ2 · s、培养温度:25士 l°C，pH = 5.8。作为本发明固体组织培养铁皮石斛类原球茎的方法更优化的技术方案，对培养基 的配方比例和培养条件进行优化选择。所述的拟原球茎诱导和增值培养培养周期20 40天，培养温度20 30°C，光 照时间8 24小时/天，光照强度50 80 μ mol/πΓ2 · s—1 ；所述的诱导培养基为MS培 养基+蔗糖20 30g/L+琼脂4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-苄氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L, pH 值为 5. 5 6. 5 ；所述的继代培养培养周期20 40天，培养温度20 25°C，光照时间8 24 小时/天，光照强度50 80 μ mol/πΓ2 ·s—1 ；所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖30 40g/L+琼脂4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-苄氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L, pH值为 5. 5 6. 5。继代培养是本发明的重要技术环节，包括如下步骤(1)选取颜色鲜绿，生长同步、迅速的拟原球茎转接在继代培养基上；(2)拟原球茎生长曲线近似S型，铁皮石斛拟原球茎在0 10天呈延迟生长，10 40天呈对数生长，从培养的第14天开始细胞处于旺盛的分裂状态，在这阶段拟原球茎增值 十分迅速，后进入生长进入稳定期，拟原球茎鲜重增殖倍数为5倍以上。从培养的第30天 左右开始铁皮石斛拟原球茎干重增加缓慢，并逐渐降低。(3)拟原球茎中多糖的含量最初的20天里呈上升趋势，在第20天多糖含量达到最 大值85.6mg/g。随后在第20天到第35天含量保持平稳，35天后多糖含量开始下降。综合 考查拟原球茎的生长和多糖的积累情况，最佳继代和采收时间为30天。本发明的优点在于该方法容易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现批量生 产。选用配方合理的诱导培养基，拟原球茎的诱导率平均为99%，多糖含量比野生铁皮石斛 提高5倍以上。通过本发明方法生产铁皮石斛类原球茎，不变性，产量大，成本低，周期短， 极具市场竞争力。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1 一种固体组织培养铁皮石斛拟原球茎的方法，它包括如下步骤(1)无菌苗的选择和处理从无菌瓶中取出株高约3cm的种苗，无菌条件下用解剖剪刀将植株的茎剪成Icm 长的带节的外植体，叶或根剪成Icm长的外植体。(2)拟原球茎的诱导和增殖将切好的外植体平放接种到拟原球茎诱导培养基中，每个组合接10瓶，每培养瓶 接种5个外植体。诱导培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂4. 5g/L+NAA0. 5mg/L+6-BA 2mg/L。 调整ρΗ5· 8。控制培养温度(25 士 1) V，光强50 μ mol · m_2 · s—1，每天光照12h。
(3)拟原球茎继代培养方法将诱导出的拟原球茎在原诱导培养基中继代一次后，转入继代培养基上继代培 养，培养条件 MS+NAA 1. 5mg/ml+6-BA 1. 5mg/ml+ 蔗糖 22g/L+ 琼脂 4. 5g/L，光照时间 12h/ d，光强 100 μ mo 1 · πΓ2 · s、培养温度:25士 l°C，pH = 5.8。实施例2 —种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤(1)无菌苗的选择和处理从无菌瓶中取出株高约5cm的种苗，无菌条件下用解剖剪刀将植株的茎剪成 1. 5cm长的带节的外植体，叶或根剪成1. 5cm长的外植体。(2)拟原球茎的诱导和增殖将切好的外植体平放接种到拟原球茎诱导培养基中，每个组合接10瓶，每培养瓶 接种8个外植体。诱导培养基为MS+蔗糖25g/L+琼脂5. Og/L+NAAl. 5mg/L+6-BA 2. 5mg/L。 调整ρΗ5· 6。控制培养温度(25 士 1) V，光强60 μ mol · m_2 · s—1，每天光照12h。(3)拟原球茎继代培养方法将诱导出的拟原球茎在原诱导培养基中继代一次后，转入继代培养基上继代培 养，接种量 80士 10g/L，培养条件 MS+NAA 1. Omg/ml+6-BA 0. 5mg/ml+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 5g/L，光照时间 12h/d，光强 100 μ mol · m_2 · s—1，培养温度:25士 l°C，pH= 5.8。实施例3 对野生铁皮石斛、实施例1和实施例2培养得到的铁皮石斛拟原球茎石 斛多糖含量进行检测，具体检测方法包括如下步骤(1)提取称取野生铁皮石斛或铁皮石斛拟原球茎适量，加入20倍体积的蒸馏水， 在80°C水浴下浸提2小时，过滤得提取液。残渣按上述步骤重复提取2次，合并三次提取所 得滤液，待用。(2) 5%苯酚溶液的配制称取苯酚100g，加铝片0. Ig和碳酸氢钠0. 05g，常压蒸 馏，收集182°C馏分。精密称取该馏分约10. Og置于200mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度， 摇勻后转置于棕色试剂瓶中，即得5% (W/V)苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。(3)样品的测定取上述提取液，按适当比例稀释，精密吸取2ml具塞刻度试管中， 加入5%苯酚溶液lmL，摇勻，迅速加入浓硫酸5mL，摇勻，置100°C水浴中加热15min，冷水迅 速冷却至室温。以2mL蒸馏水同法操作为空白，使用紫外分光光度计，测定波长为490nm处 的吸光度A，代入标准曲线A = 0. 0153C-0. 0122，求出样品多糖的葡萄糖浓度C(y g/ml)，按多糖含量(％ ) = C · D · f/W样X 100%计算多糖含量。式中W样为样品重量；D为样品的稀释倍数；f为换算因子。所得样品多糖含量应 > 30%。通过该方法对野生铁皮石斛与上述两个实施例生产的铁皮石斛类原球茎样品石 斛多糖含量的检测结果如下野生铁皮石斛与两个实施例石斛多糖含量的比较
5 试验结果证明，采用本发明的方法生产的铁皮石斛类原球茎比野生铁皮石斛的石 斛多糖含量高出5倍以上。实施例4 采用MS培养基、White培养基和本发明的诱导培养基分别对铁皮石斛小 块组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，实验结果如下不同培养基诱导比较 实验结果证明，采用本发明的诱导培养基对通过铁皮石斛小块组织进行诱导培 养，组织鲜重和诱导率显著提高。
权利要求
一种生产铁皮石斛的方法，其特征在于所述的方法是固体组织培养铁皮石斛拟原球茎的方法，包括外植体的选择诱导、增值培养和继代培养，具体包括如下步骤(1)无菌苗的选择和处理从无菌瓶中取出株高约3～10cm的种苗，无菌条件下用解剖剪刀将植株的茎剪成1cm长的带节的外植体，叶或根剪成1cm长的外植体；(2)拟原球茎的诱导和增殖将切好的外植体平放接种到拟原球茎诱导和增值培养基中，每个组合接10瓶，每培养瓶接种5～10个外植体，诱导和增值培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L，调整pH＝5.8，控制培养温度(25±1)℃，光强50μmol·m-2·s-1，每天光照12h；(3)拟原球茎继代培养方法将诱导出的拟原球茎在原诱导培养基中继代一次后，转入继代培养基上继代培养，培养条件MS+NAA 1.0mg/ml+6-BA 0.5mg/ml+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，光照时间12h/d，光强100μmol·m-2·s-1，培养温度25±1℃，pH＝5.8。
2.按照权利要求1所述的生产铁皮石斛的方法，其特征在于，所述的拟原球茎诱导和 增值培养中培养周期20 40天，培养温度20 30°C，光照时间8 24小时/天，光 照强度50 80 μ mol/πΓ2 · s—1 ；所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖20 30g/L+琼脂 4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-节氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L, pH值为5. 5 6. 5。
3.按照权利要求1所述的生产铁皮石斛的方法，其特征在于，所述的拟原球茎继代培 养中培养周期20 40天，培养温度20 25°C，光照时间8 24小时/天，光照强度 50 80 μ mol/πΓ2 μ—1 ；所述的大规模培养基为(如上权利要求中并未提到大规模培养基) MS培养基+蔗糖30 40g/L+琼脂4 6g/L+ α -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-苄氨基嘌呤 2. 0 3. Omg/L, pH 值为 5. 5 6. 5。
全文摘要
本发明公开了一种固体组织培养铁皮石斛拟原球茎的方法，它包括外植体的选择诱导、增值培养和继代培养三个环节，所述的诱导和增值培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L。调整pH＝5.8。控制培养温度(25±1)℃，光强50μmol·m-2·s-1，每天光照12h。继代培养基和培养条件MS+NAA 1.0mg/ml+6-BA 0.5mg/ml+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，光照时间12h/d，光强100μmol·m-2·s-1，培养温度25±1℃，pH＝5.8。该方法易操作，有效成分含量高，生产成本低，不污染环境，可达到产业化水平。通过本发明方法生产铁皮石斛拟原球茎，不变性，产量大，成本低，周期短。
文档编号A01H4/00GK101878736SQ20101020279
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者贾景明 申请人:沈阳药科大学