专利名称：一株对蚊子幼虫高效的苏云金芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明属卫生害虫的生物防治技术领域。本发明涉及一种对蚊子幼虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，涉及对编码杀蚊毒素的cry30基因全长核苷酸序列和cyt2基因全长核苷酸序列，以及分别由这两种基因编码的蛋白质氨基酸序列。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt，是一种分布极广的革兰氏阳性细菌，在稳定生长期Bt可形成伴孢晶体(parasporal crystal protein)，又称杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystal protein, ICP)，ICP对敏感昆虫有强烈的毒性，而对它们的天敌、人畜以及植物无害，被开发为生物农药广泛用于防治鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目等多禾中害虫(Schnepf E，Crickmore N，Van Rie, et al· Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. MicrobiolMol Biol Rev.，1998，62 :775_806.)。双翅目的蚊虫传播多种人类传染性疾病，如疟疾、乙型脑炎、丝虫病、黄热病、 登革热等，对人类的健康造成了极大的危害(Masson L, Mazza A，Gringorten L，et al.Specificity domainlocalization of Bacillus thuringiensis insecticidal toxins is highly dependent on the bioassaysystem. Mol Mierobiol. 1994，14 851-860.)据统计，由按蚊(Anopheles)传播的疟疾每年发病人数达3亿，并导致1亿人死亡；而每年亦有1. 6亿人感染由库蚊传播的丝虫病、5千万人感染由白纹伊蚊传播的登革热 (Budiansky S. Creatures of our own making· Science· 2002，298 :80_86·)。在过去的半个世纪中，大量地使用化学杀虫剂防治蚊虫，但带来了严重的弊端蚊虫产生抗性，防治效果降低；破坏了生态平衡，也污染了环境，最终危害了人类的健康。人们逐渐认识到采取生物防治是包括蚊虫在内的害虫防治的必然趋势。Bt对白纹伊蚊属、库蚊属、按蚊属的多种蚊虫有很高的杀灭活性，其在蚊虫防治上的成功应用在一定程度上控制了虫媒病的传播。1976年首次发现对蚊虫有很强杀虫活性的苏云金芽孢杆菌以色列亚种 (Bacillusthuringiensis subsp. israelensis, Bti)，目前已发现多种亚种或血清型具有灭岐活性，如 Canadensisi 亚种、Morrisoni 亚种、Darmstadiensis 亚种、Thompsoni 亚种和Jegathesan亚种等。同时也发现了多种杀蚊晶体蛋白，如Cry2、Cry4A、Cry4B、CrylOA, Cryl 1A、CryllBb、Cryl9A、Cryl9B、Cry20Aa、Cry27A、Cry30、Cry40 和 Cyt 等，陆续还不断有新杀蚊蛋白的相关报道(赵新民，夏立秋，王发祥，等.杀蚊苏云金芽孢杆菌及其晶体蛋白研究进展[J].昆虫知识，2007，44(3) :336-342.)。Bti是研究时间较早、研究内容较深、应用范围较广的亚种，它作为生物杀蚊剂被广泛用于蚊虫的控制。野生Bt菌株WFS-97对白纹伊蚊 幼虫的杀虫活性明显高于Bti，且杀虫基因不同，因此对于研究开发新的高效Bt杀蚊制剂具有非常重要的意义。技术内容本发明的目的是提供一种对蚊虫有高毒力的Bt菌株，以及两种新的cry30和cyt2 基因序列，是一株生物杀蚊制剂候选菌株，也可以应用于构建工程菌。
本发明提供的Bt菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) WFS-97 菌株。上述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)WFS-97，已于 2010 年 6 月 29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC Na . 3946。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC No . 3946的筛选方法为醋酸钠抗生素选择性筛选， 用含有青霉素钠盐的醋酸钠选择性液体培养基培养土样(200r/min，30°C )4h，土壤悬液离心，取上清65°C热处理后涂LB固体平板，30°C培养3-4d，挑取单菌落涂片，用碱性复红染色，在油镜下观察晶体形状、大小以及芽胞和晶体的分离率。将胞晶混合物涂在盖玻片上， 用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金，扫描电子显微镜下观察晶体的形状(见图1)。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC No . 3946的基因型鉴定方法为用34对通用引物进行 PCR扩增，确定其含有cry30和cyt2基因(见图2)。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC No . 3946的cry30和cyt2基因全长序列克隆方法是， 设计全长引物sim30-l/Sim30-2和cyt2F/cyt2R分别扩增出PCR产物片段，切胶回收，克隆到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5a感受态细胞，以蓝白斑筛选阳性转化子，重组质粒pUCm-T30、pUCm-T2经双酶切检测(见图3)后测序，其测序结果用DNAMAN 和NCBI Blast软件进行序列分析。
所述苏云金芽孢杆菌CGMCC No . 3946晶体蛋白的SDS-PAGE分析方法为，刮取已经胞晶分离的菌苔，用NaCl (lmol/L)、灭菌水交替洗两次，重悬灭菌水中，加入相同体积的2X上样缓冲液，混勻后，100°C煮沸5min，离心(4°C、12000r/min、lmin)后取上清用于 SDS-PAGE检测(见图4)。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC N2. 3946的生长曲线及pH值变化测定方法为，将苏云金芽孢杆菌CGMCC Na . 3946接种于LB液体培养基(200r/min，30°C )培养，每2h取样，测定菌液的0D600值和pH值，绘制生长曲线和pH值曲线(见图5)。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC No . 3946菌的培养方法为，用接种针沾取斜面保存的 BtffFS-97菌，在LB固体培养基平板上划线接种，然后放入30士 1°C的生化培养箱中培养至胞晶分离，用灭菌水刮下菌苔，离心(4°C、12000r/min,5min)，弃上清，取沉淀用于杀虫活性的测定。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC No . 3946的杀虫活性测定方法为，对棉铃虫、粘虫、玉米螟2龄幼虫用人工饲料混合饲喂法，每IOg饲料加菌液ImL (湿重200mg/ml)，每个处理设置3个重复，每个重复24头试虫；对小菜蛾2龄幼虫采用浸叶法，选取等量鲜嫩一致的甘蓝叶片，在待测菌液(湿重200mg/ml)中浸泡均勻，自然晾干后放入生测盒，设置3个重复，每个重复15头试虫，28°C培养箱中培养72h后观察死虫数；对淡色库蚊2龄幼虫孑孓的生物测定方法是定量称取湿重Bt菌，配成一定浓度的菌悬液，每IOml菌悬液中15头试虫，设置 3 4个重复，28 士 1°C生化培养箱中培养24h后，观察死虫数；该菌株对白纹伊蚊2龄幼虫孑孓的LC5tl测定方法是，将菌液稀释成5个浓度梯度，24h后检查各处理死亡数，用杀虫剂毒力测定系统LC5tl软件计算孑孓的LC5tl值，并绘制LD-p直线图(见图6)。
图1 :WFS_97菌株芽孢和晶体的扫描电镜图片图2 :WFS-97菌株cry30与cyt2基因的鉴定，其中M:DNA 分子量标准(8kb, 5kb, 3kb, 2kb, lkb, 0. 75kb, 0. 5kb, 0. 25kb, 0. lkb)1 :cry30 基因 PCR 产物2 :cyt2 基因 PCR 产物图3 重组质粒pUCm-T30、pUCm_T2的酶切分析，其中M =DNA 分子量标准(8kb, 5kb, 3kb, 2kb, lkb，0. 75kb,0. 5kb,0. 25kb,0. lkb)1:pUCm-T30/NcoI & XhoI2 :cry30 全长 PCR 产物3 :pUCm-T4:pUCm-T2/NcoI & XhoI5 :cyt2 全长 PCR 产物图4 :WFS-97菌株晶体蛋白SDS-PAGE图谱图5 :WFS-97菌株的生长曲线及pH值变化图6 :WFS-97对白纹伊蚊2龄孑孓24h生测的LD_p直线图
具体实施例方式下列实例是进一步对本发明的说明，不应当成为对本发明的限制。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例1、苏云金芽孢杆菌WFS-97菌株的分离与鉴定本发明人自行从土壤中分离了 Bt WFS-97菌株，土壤来源于河北省。称取IOg 土样放入装有50mL醋酸钠液体培养基(蛋白胨0. 5g，酵母粉0. 25g， NaClO. 5g，醋酸钠1. 8g，水50ml，调pH值7. 2-7. 4，121 °C，高压灭菌30min)的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐使终浓度为400ug/mL，摇床培养(200r/min，3(TC )4h。培养结束后取土壤悬液10mL，加入无菌的离心管内300r/min离心15min，取上层浑浊液1. 5mL于65°C水浴锅水浴15min，取热处理后的浑浊液0. 2mL涂LB固体培养基(蛋白胨2g，酵母粉lg，NaC12g， 琼脂粉3. 2g，水200ml，调pH值7. 2-7. 4，121°C，高压灭菌30min)平板，将平板置30°C培养箱中培养。3-4d从平板上挑取类似Bt的菌株涂片，用碱性复红染色，在油镜下观察晶体形状、大小以及芽胞和晶体的分离率，发现一株含有球形晶体的菌株，命名为WFS-97。菌株WFS-97在LB固体培养基中30°C培养72h后，菌落呈乳白色，边缘产生折皱。将胞晶混合物涂在盖玻片上，用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金，扫描电子显微镜下观察晶体的形状(见图1)，可见营养体细胞呈杆状，大小为1. 1 1.7μπιΧ4.6 5. 7 μ m，单个或成短链状，胞子囊未见膨大；芽胞椭圆形，大小为1. O 1. 04 μ mX 1. 78 2. 07 μ m ；伴胞晶体呈球形，大小为0. 57 0. 84 μ m。上述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)WFS-97,已于 2010 年 6 月 29 日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC Na . 3946。
实施例2、WFS-97菌株的基因型鉴定WFS-97 菌株总 DNA 与质粒 DNA 的提取参考 Narva (Narva K，Payne J M，Schwab G E，Hickle L A，Galasan T and Sick A J. Novel Bacillus thuringiensis microbes active againstnematodes， and genes encoding novel nematodes-active toocin from Bacillus thuringiensisisolates(P). European Patent Office, EP0462721,1991.)方法。
以WFS-97菌株总DNA为模板，用31对通用引物进行PCR扩增，确定其含有cry30 和cyt2类基因。根据Cry30类基因保守区设计的一对通用引物为S5un30 :5_， aagattggctcaatatgtgtc-3，S3un30 :5_， gattatcaggatctacactag_3，根据Cyt2类基因保守区设计的一对通用引物为cyt2~5 :5_， attacaaattgcaaatggtattcc-3，cyt2~3 :5_， tttcaacatccacagtaatttcaaatgc-3，用下列PCR反应体系(20 μ L)鉴定WFS-9710XPCR buffer :2μ L25mM dNTP 0. 5 μ L10μΜ5，弓丨物0. 4μ L10μΜ3，弓丨物0. 4μ LDNA 模板IyLTaqgl 0. 2 μ LddH20:15. 5μ L扩增循环94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸lmin，33个循环，72°C延伸lOmin。结果(见附图2)显示菌株WFS-97含有cry30与cyt2类基因。实施例3、cry30与cyt2基因的全长序列测定与分析参照Gen-Bank发表的cry30和cyt2全长基因序列，利用DNAMAN软件设计了全长引物Sun30-1 5~' atgaagccgtatcaaagtgaaaatgaatatga-3'Sun30_2 :5_， ttagttcactggacaagcaaatgcat-3，cyt2F :5_，atgtatactaaaaattttagtaattc-3，cyt2R :5_，tcaattcgataaatttaaattttg-3，用全长引物sun30-l/sun30_2和cyt2F/cyt2R分别扩增出PCR产物片段，切胶回收，回收产物连接到PUCm-T载体上，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a感受态细胞， 以蓝白斑筛选阳性转化子，得到阳性克隆pUCm-T30和pUCm-T2，检测后测序(双酶切结果见图3)，其测序结果用DNAMAN和NCBI Blast软件进行序列分析。分别得到基因序列SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2。序列SEQ ID NO 1长2064bp，编码688个氨基酸组成的蛋白(其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示)，推导的理论分子量为77. 04kD，等电点8. 01，为碱性蛋白，GC含量45.2%。同源分析表明该蛋白与Cry30-like protein蛋白具有很高的同源性， 达到97 %，与其它蛋白同源性比较见表1。
表1 Cry30蛋白同源性比较
权利要求
1.一种苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No . 3946。
2.根据权利要求1所述的菌株在杀灭蚊子幼虫的应用。
3.根据权利要求1所述的菌株经鉴定含有的cry30基因，其特征是该基因具有SEQID NOl所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的cry30基因编码的Cry30蛋白，且具有SEQID NO 3所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的菌株经鉴定含有的cyt2基因，其特征是该基因具有SEQID N02所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的cyt2基因编码的Cyt2蛋白，且具有SEQID NO 4所示的氨基酸序列。
全文摘要
一株杀孑孓的苏云金芽孢杆菌菌株及其应用，属于卫生害虫生物防治技术领域。本发明菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WFS-97，菌株保藏号为CGMCC No.3946。进一步，本发明涉及一种对淡色库蚊和白纹伊蚊的幼虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株具有编码杀虫晶体蛋白基因cry30和cyt2，涉及对双翅目害虫高毒力的cry30基因全长核苷酸序列和cyt2基因全长核苷酸序列，以及分别由这两种基因编码的蛋白质氨基酸序列。利用这一菌株可生产杀蚊虫的生物农药，用于防治淡色库蚊和白纹伊蚊的幼虫，其杀虫基因也可用于构建杀蚊工程菌。
文档编号A01N63/02GK102154171SQ201110006409
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者宋萍, 张冬冬, 王勤英, 郭丽伟 申请人:河北农业大学