专利名称：垃圾堆肥复合菌剂在提高草坪草矿质营养上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种为原料，配制高效堆肥复合菌剂。更具体的说是采用微生物的菌剂，研究对黑麦草和高羊茅初期生长的影响及应用。
背景技术：
堆肥化(composting)是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等) 或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质〔humicsubstance，HS) 转化的生物化学过程。这一过程也是地球表面生态过程的一部分，它参与地球表面的物质和能量循环。在人为控制条件下，通过堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成为有机肥料一堆肥(compost)，这种有机肥料作为堆肥化的最终产物，不仅性能稳定，并且对环境的危害甚小。因此，堆肥化是固体废物，尤其是城市生活垃圾无害化、稳定化和资源化的有效途径之一。堆肥化发展至今，已经历了漫长的历史，对其产生和发展的历史过程进行回顾和分析，可为今后开发新的堆肥工艺技术提供理论和实践上的借鉴和帮助。陈世和等(1989)采用垃圾培养基，在城市生活垃圾堆肥处理过程中，温度达 45°C和55°C时，对堆肥菌株进行分离，发现在45°C时曲霉菌[Aspergillus]、芽孢杆菌属[Bacillus]、假单孢菌属[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳杆菌属[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的优势菌群。而到55°C时则有所不同，除了芽孢杆菌属[Bacillus]和假单孢菌属Pseudomonas]仍然为优势菌群外，乳酸杆菌属[LactcAacilIus]、链球菌属 [Streptococcus]和小单孢菌[Micromonospora]属则成为新的优势菌群，替代了其它种微生物，表明在堆肥化过程中，微生物种群处在一个不断变化的动态平衡之中。从城市生活垃圾中分离出大量参与高温好氧堆肥的微生物，经鉴定分别为芽孢杆菌属、假单孢菌属，乳酸杆菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属等5属细菌；曲霉属，毛霉属、红曲霉属，青霉属、地霉属、霉属、脉孢苗属、头孢霉属等8属霉菌；链霉菌属1属放线菌；酵母菌属，裂殖酵母菌等2属酵母菌。该研究结果有力地促进了对垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)对城市垃圾堆肥过程诶生物变化的调查发现，分解有机物产生的高温引起微生物群落的重要变化，使致病菌、酵母菌及中温菌大量减少，而产芽孢的杆菌大量存在，在堆肥过程中，高温阶段初期和中文阶段细菌均占主要地位。马文漪等也报道了嗜热真菌，嗜热褐色放线菌等参与垃圾堆肥的微生物种群。从城市生活垃圾中有机物的组成来看，而被微生物所分解利用。但各种微生物对各种物质的分解能力和分解速度是不尽相同的，不同温度下(中温、高温)堆肥过程中出现的微生物种群和数量上亦截然不同。近期的相关文献及实际生产表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥处理的技术水平、提高处理效率、改善产品质量，一直是相关科研人员所重点关注的研究内容；在堆肥物料中针对特定物质有目的的添加一些人工微生物制剂，已经被很多研究所证实是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考虑到在很多研究和生产实践中，合理配比的复合菌剂往往较单一菌株更具好的效果，于是如何将堆肥中提取和筛选出来的各种功能菌株结合起来开发高效堆肥复合菌剂，从根本上优化和合理配制使用城市垃圾堆肥基质便成了相关科研人员研究的热点问题。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定腐殖质转化的生物化学过程，是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆肥化进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接种外源微生物复合菌剂对堆肥化过程中微生物的影响，有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响。近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物现象进行了一系列理论和实践研究，Vaz-Moreira等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及将堆肥微生物菌剂应用于正常条件下对植物生长的影响方面，相关研究也鲜为报道。而有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及从城市生活垃圾堆肥中提取筛选和配制堆肥复合有益微生物菌剂，对草坪植物生长、生理特性的影响方面的研究还未见报道。城市垃圾堆肥中含有丰富的有机质和植物营养元素，对多种作物均有增产效果分别对堆肥中有机质和营养需求进行了研究，发现堆肥中的有机质和营养物质可以改善土壤理化性质，提高作物产量。顾文杰等(2009)研究接种外源菌剂对堆肥中微生物数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供依据。Ivone V M等(2008)对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。 但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，而有关将堆肥微生物菌剂应用于草坪植物对其体内矿质营养的需求和影响，相关研究也鲜为报道。
发明内容
本发明选择城市固体废弃物(生活垃圾)为研究对象，探讨其垃圾堆肥内部微生物组分和营养成分，筛选出有益的微生物菌种(枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母菌)，配制成不同浓度的复合微生物菌剂喷洒到建植的草坪植物体系中。研究堆肥复合微生物菌剂对草坪植物幼苗生长和营养成分的影响，以及Ca2+、K+、Mg2—和Na+离子的吸收和分布状况，为筛选有益配比的微生物菌剂在生产中应用提供依据。为实现上述目的本发明提供了如下的技术方案
复合菌剂在制备提高草坪植物体内矿质营养需求方面的应用；其中采用的复合菌剂由体积比例为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 :1 :1的3菌种稀释100-200倍的液体喷撒完成。
本发明所述的应用，其中3菌种的菌落数在2.44X 109-2.47X 109/ml之间；草芽孢杆菌的0D_值为0. 567，酵母菌的OD56tl值为0. 5450本发明所述的应用，其中的矿质营养指的是Ca2+、K+、Mg2—和Na+离子的吸收和分布状况。本发明所述的应用，其中的草坪植物为黑麦草和高羊茅。本发明所述的应用，其中复合菌剂在种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施；白天植物能接受到光照的时间为7—8 h,室温平均温度为18 °C，平均最高温度为21. 8 °C，最低温度为15. 60C，平均湿度为35. 1%，平均最大湿度为52. 7%，平均最小湿度3496，平均光量子密度为600— 800 μ mol · m_2 · s—1，持续处理35天测定各项指标。接种复合微生物菌剂后，茎叶部分矿质元素的累积量都有显著性差异。高羊茅在稀释倍液为200的浓度时，茎叶部分积累的4种大量元素(Ca、K、Mg和Na)含量最高，与对照相比分别超过86. 49%,63. 41%,79. 49%和28. 16%。而对于黑麦草，复合菌剂1倍液下，茎叶部分积累的矿质营养最高，与没菌剂相比分别高出76. 27%,68. 75%,76. 92%和84. 54%.本发明进一步公开了高效堆肥复合菌剂，其中3菌种的筛选方法如下
(1)富集将采集的堆肥样品称取IOg置于无菌三角瓶中，加入IOOml无菌水和玻璃珠振荡均勻后，取IOml悬浮液于盛有IOOml富集培养基的三角瓶中，分别在适合的温度，摇床振荡培养3天；
(2)初筛将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛；
(3)复筛将初筛得到的菌株接种到相应摇瓶培养基中，在适合的温度和摇床速度的条件下培养，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线；
(4)合微生物菌剂的制备将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上，具体步骤为
①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇勻即成菌悬液；
②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在3(TC、180r/ min培养1 得到种子液， 放线菌和酵母菌在观220 r / min培养48 h得到种子液；
③浓度10%的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48h得到发酵液。按体积比例为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1:1:1配制复合微生物菌液。本发明更加详细的制备方法如下
杆菌(保藏号CCTCCM207094)、放线菌(保藏号CPC(^60118)、酵母菌(保藏号 CGMCCN0. 1147)均由市售，但根据需要也可以采用下述的方法制备得到3个菌株。其得到的3个菌株的生化特性与市售的相同。研制材料与方法 1. 1材料
选用我国北方比较常见多年生黑麦草(ZWi perenne L.)和高羊茅(/^stoca arundinacea L.)为试验材料。方法
1. 2. 1菌株的筛选方法
富集将采集的堆肥样品称取IOg置于无菌三角瓶中，加入IOOml无菌水和玻璃珠振荡均勻后，取IOml悬浮液于盛有IOOml富集培养基的三角瓶中，分别在适合的温度下摇床振荡培养3—5天。初筛将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛。复筛生长曲线的绘制将初筛得到的菌株接种到相应摇瓶培养基中，在适合的温度和摇床速度的条件下培养，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线。复合微生物菌剂的制备
菌种培养将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上扩大培养，具体步骤①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇勻即成菌悬液；②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在3(TC，180r / rain培养12 h得到种子液，放线菌和酵母菌在观°C, 220 r / rain培养48 h得到种子液；③浓度10%的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液。按以下处理配制复合微生物菌液。植物的无土培养和复合微生物菌剂的应用
植物的无土培养草坪植物种子经1% 溶液消毒3-5min，然后用蒸馏水冲洗干净，把种子放进离心管中，在饱和的CaSO4溶液中浸泡4h后，培养皿中加少许CaSO4溶液，其中垫上一层滤纸，把浸泡4h后的种子放在滤纸上，选取浸种后籽粒饱满、大小一致的草坪植物种子100粒，用蒸馏水冲洗干净后播种于其中，试验中每一处理设置3次重复，早晚各加一次蒸馏水来补充由蒸发而散失的水分。复合微生物菌剂的应用处理1加入原菌剂，简称CM1 ；处理2加入100倍液的，简称CM2 ；处理3加入200倍液的，简称CM3 ；处理4加入300倍液的，简称CM4 ；处理5加入400 倍液的，简称CM5;处理6不接菌剂，简称CK。每天统一定量给水，试验盆随机排列。种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施。每天植物能接受到光照的时间为7—8 h。室温平均温度为18 °C，平均最高温度为21. 8 °C，最低温度为15. 6°C。平均湿度为35. 1%，平均最大湿度为52. 7%，平均最小湿度34%。平均光量子密度为600—800 μ mol · m_2 · s-1。持续处理35天测定各项指标。指标测定
株高，采用厘米刻度尺每个培养皿随机测5个株高，以及萌发率的测定。叶绿素的测定参考李合生(2000)。生物量的测定，将植物分地上与地下两部分放至烘箱，80°C烘至恒重。 采用SpectrAA-2000原子吸收光谱仪，测定草坪植物地上部分的大量元素。数据分析采用 EXCEL和SPSSl 1. 5分析软件进行处理。研制结果分析 2. 1菌种筛选
2. 1. 1初筛
通过平板分离筛选，得到透明圈/菌落直径比值较大且生长较快的菌落。将所得的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌分别进行划线分离、编号并保藏于固体斜面培养基上。复筛
通过测定初筛菌种的生长曲线、OD值和菌落数，来研究堆肥中各类微生物的数量变化和活性大小，筛选出生长活性最高和繁殖能力最好时期的菌种，配制成各种不同浓度的堆肥复合微生物菌剂，接种到草坪植物建植体系中。表1微生物菌剂所富含的菌落数
权利要求
1.复合菌剂在制备提高草坪植物体内矿质营养需求方面的应用；其中所述的采用生活垃圾堆肥制备的复合菌剂由体积比例为草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 :1 1的3菌种稀释100-200倍的液体喷撒完成。
2.权利要求1所述的应用，其中3菌种的菌落数在2.44X 109-2· 47Χ 109/ml之间；草芽孢杆菌的OD6tltl值为0. 567，酵母菌的OD56tl值为0. 545 0
3.权利要求1所述的应用，其中的草坪植物为黑麦草和高羊茅。
4.权利要求1所述的应用，其中复合菌剂在种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施；白天植物能接受到光照的时间为7—8 h, 室温平均温度为18 °C，平均最高温度为21. 8 °C，最低温度为15. 60C，平均湿度为35. 1%， 平均最大湿度为52. 7%，平均最小湿度3496，平均光量子密度为600— 800 μ mol · m_2 · s—1， 持续处理35天测定各项指标。
5.权利要求1所述的应用，其中的矿质营养指的是Ca2+、K+、Mg2—和Na+离子的吸收和分布状况。
全文摘要
本发明公开了生活垃圾复合菌剂在制备提高草坪植物体内矿质营养需求方面的应用；其中采用的复合菌剂由体积比例为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=111的3菌种稀释100-200倍的液体喷撒完成。喷洒堆肥复合微生物菌剂后，植株体内几种大量元素(Na、K、Ca、Mg)随菌剂稀释倍数的增加的变化趋势基本相同，但堆肥复合微生物菌剂对草坪植物生长影响因宿主植物种类、和环境因子而有明显差异，这有利于草坪植物对矿质元素的吸收和利用。
文档编号C05F11/08GK102180712SQ201110037029
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者多立安, 王晶晶, 赵树兰 申请人:天津师范大学