专利名称：垃圾堆肥微生物菌剂在提高草坪草抗盐性方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种为原料，配制高效堆肥复合菌剂。更具体的说是堆肥复合微生物菌剂在提高草坪植物抗盐性方面的应用。
背景技术：
堆肥化(composting)是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等) 或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质〔humicsubstance，HS) 转化的生物化学过程。这一过程也是地球表面生态过程的一部分，它参与地球表面的物质和能量循环。在人为控制条件下，通过堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成为有机肥料一堆肥(compost)，这种有机肥料作为堆肥化的最终产物，不仅性能稳定，并且对环境的危害甚小。因此，堆肥化是固体废物，尤其是城市生活垃圾无害化、稳定化和资源化的有效途径之一。堆肥化发展至今，已经历了漫长的历史，对其产生和发展的历史过程进行回顾和分析，可为今后开发新的堆肥工艺技术提供理论和实践上的借鉴和帮助。陈世和等(1989)采用垃圾培养基，在城市生活垃圾堆肥处理过程中，温度达 45°C和55°C时，对堆肥菌株进行分离，发现在45°C时曲霉菌[Aspergillus]、芽孢杆菌属[Bacillus]、假单孢菌属[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳杆菌属[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的优势菌群。而到55°C时则有所不同，除了芽孢杆菌属[Bacillus]和假单孢菌属[Pseudomonas]仍然为优势菌群外，乳酸杆菌属[Lactobacillus]、链球菌属 [Streptococcus]和小单孢菌[Micromonospora]属则成为新的优势菌群，替代了其它种微生物，表明在堆肥化过程中，微生物种群处在一个不断变化的动态平衡之中。从城市生活垃圾中分离出大量参与高温好氧堆肥的微生物，经鉴定分别为芽孢杆菌属、假单孢菌属，乳酸杆菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属等5属细菌；曲霉属，毛霉属、红曲霉属，青霉属、地霉属、霉属、脉孢苗属、头孢霉属等8属霉菌；链霉菌属1属放线菌；酵母菌属，裂殖酵母菌等2属酵母菌。该研究结果有力地促进了对垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)对城市垃圾堆肥过程诶生物变化的调查发现，分解有机物产生的高温引起微生物群落的重要变化，使致病菌、酵母菌及中温菌大量减少，而产芽孢的杆菌大量存在，在堆肥过程中，高温阶段初期和中文阶段细菌均占主要地位。马文漪等也报道了嗜热真菌，嗜热褐色放线菌等参与垃圾堆肥的微生物种群。从城市生活垃圾中有机物的组成来看，而被微生物所分解利用。但各种微生物对各种物质的分解能力和分解速度是不尽相同的，不同温度下(中温、高温)堆肥过程中出现的微生物种群和数量上亦截然不同。近期的相关文献及实际生产表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥处理的技术水平、提高处理效率、改善产品质量，一直是相关科研人员所重点关注的研究内容；在堆肥物料中针对特定物质有目的的添加一些人工微生物制剂，已经被很多研究所证实是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考虑到在很多研究和生产实践中，合理配比的复合菌剂往往较单一菌株更具好的效果，于是如何将堆肥中提取和筛选出来的各种功能菌株结合起来开发高效堆肥复合菌剂，从根本上优化和合理配制使用城市垃圾堆肥基质便成了相关科研人员研究的热点问题。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定腐殖质转化的生物化学过程，是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆肥化进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用。Ros和PSrez-Piqueres等人研究了接种外源微生物复合菌剂对堆肥化过程中微生物的影响，有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响。近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物现象进行了一系列理论和实践研究，Vaz-Moreira等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及将堆肥微生物菌剂应用于正常条件下对植物生长的影响方面，相关研究也鲜为报道。而有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及从城市生活垃圾堆肥中提取筛选和配制堆肥复合有益微生物菌剂，对盐胁迫下草坪植物生长、生理特性的影响方面的研究还未见报道
发明内容
本发明将配制成不同浓度的城市生活垃圾堆肥复合微生物菌剂接种到草坪建植体系中。试验轻度、中度和重度盐胁迫处理下进行，通过研究不同浓度的复合微生物菌剂对黑麦草和高羊茅生理生态特性的影响，目的是为筛选优良抗盐堆肥复合微生物菌剂，提高草坪植物抗盐性，促进盐胁迫环境草坪植物的建植提供依据。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案
城市生活垃圾堆肥复合微生物菌剂在提高草坪植物抗盐性方面的应用，其中的复合微生物菌剂为稀释100-200倍的体积比为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 1 1的3菌种组成；所述的盐指的是0. 3%-0. 9%NaCl盐碱土。本发明所述的应用，其中的草坪植物为黑麦草或高羊茅。本发明所述的应用，其中所述的抗盐性指的是堆肥微生物菌剂在促进黑麦草光合速率、缓解盐胁迫造成的叶绿素含量下降方面的应用；所述的复合微生物菌剂为稀释 100倍的体积比为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 :1 :1的3菌种组成。本发明所述的应用，其中所述的抗盐性指的是堆肥微生物菌剂在增强植物根系抵抗盐胁迫方面的应用；所述的盐指的是0. 3%-0. 9%NaCl盐碱土。本发明所述的应用，其中所述的抗盐性指的是堆肥微生物菌剂在增加高羊茅叶绿素含量方面的应用；其中的复合微生物菌剂为稀释200倍的体积比为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 :1 :1的3菌种组成。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌均由市售，也可以根据实施例1的方法加以配制。实施例1 1、菌株的筛选
①富集将采集的堆肥样品称取10 g置于无菌三角瓶中，加入100 ml无菌水和玻璃珠振荡均勻后，取10 ml悬浮液于盛有100 ml富集培养基的三角瓶中，在28°C，220 r / min 下振荡培养3-5天。②初筛将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛。③生长曲线的绘制将初筛得到的枯草芽孢杆菌和酵母菌接种到相应摇瓶培养基中， 分别在37°C和28°C，220 r / min的条件下培养，并分别以波长600 nm和560 nm下的OD 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线。2、复合微生物菌剂制备
菌种培养将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上扩大培养，具体步骤①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇勻即成菌悬液；②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在3(TC，180r / min培养12 h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 °C, 220 r / min培养48 h得到种子液；③浓度10%的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液，复合微生物菌液按以下处理进行配制(叶峰等，2009)。实施例2 复合微生物菌剂应用
采用单因素随机区组实验设计，受限因素分别为①盐胁迫，三个盐胁迫处理水平；轻度(0. 3%NaCl) =T1,中度(0. 6%NaCl) =T2和重度(0. 9%NaCl)盐碱土 T3。②不同浓度的复合微生物菌剂应用，在此盐胁迫条件下设定处理方式处理1为对照，不接种菌剂(CK)；处理 2加入100倍稀释液的菌剂(CM1)；处理3加入200倍稀释液的菌剂(CM2)；处理4加入300 倍稀释液菌剂(CM3)。实施例3草坪建植
选用我国北方比较常见的多年生黑麦草Holium perenne L.)和高羊茅ifestuca arundinacea L.)为试验材料。供试草坪植物种子籽粒饱满、大小均勻。所用土壤为天津师范大学院内园土，其理化性质为pH 7.44，饱和含水量0.58 ml/g,有机质4. 68%，全氮 0. 21%,有效磷22. 03 mg/kg,全钾45. 61g/kg。采集后，剔除植物残根和石砾等杂物，过2 mm筛，在121°C下灭菌30 min，备用。实验采用盆栽的方法，每培养容器内放置灭菌土壤 200 g，将0.4 g草坪种子播种其上。每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致。当植株生长高度达到2-3 cm时，加入不同浓度的堆肥复合微生物菌剂(CM)。各处理3次重复，实验在温室植物培养台上进行，温度为 2(T22°C，相对湿度为34%飞5%，光照为透入室内的自然光。处理35天后进行植物各指标的测定。实施例4测定指标
(1)天津盐碱土中可溶性盐浓度的测定可溶性盐分析采用重量法分别称取5 g样品，放入50 mL烧杯中。在烧杯中放入25 mL无CO2蒸馏水，用玻璃棒搅拌3 min，取一已称重的100 mL烧杯(W1),用已经准备好的过滤装置过滤。放置的时间越长，对可溶性盐分的分析结果误差越大，因此，过滤要尽量迅速并尽快进行实验。将已称重的烧杯和滤液移置恒温水浴锅上，水浴蒸干。在蒸干中，若残渣呈黄色(残渣中存在有机质)要用15%过氧化氢溶液除去有机质(遵循少量多次原则，反复处理，直至残渣变白为止)。然后用滤纸擦干烧杯外壁，放入烘箱，在100-105°C条件下烘干约 3-4 h至恒重，称量(W2)。蒸干时温度不宜过高，以免溅失盐分，在接近蒸干时，更要注意溅失，以免影响测定结果。结果计算
可溶性盐=5.000 χφθ%
株高，采用厘米刻度尺每个培养皿随机测5个株高。
地上和地下生物量的测定。叶绿素含量的测定采用分光光度法。即取0. 2g的草坪植物地上部分置于研钵中，加入少量石英砂、碳酸钙和80%丙酮， 进行充分研磨提取，将勻浆转入15ml离心管中，并用适量80%丙酮洗涤钵体，一并转入离心管中，离心后弃沉淀，取上清液转移至25ml容量瓶中，用80%丙酮定容至刻度线；以80%丙酮作为对照，用SHIMADZU产UV-1700型紫外分光光度计分别测定在663nm、645nm波长处的吸光度值。计算公式如下
Ca=12.7 OD663-2.69 OD645; Cb=22.9 OD645-4.68 OD663i
Ct= Ca + Cb =8.02 OD663 + 20.21 OD645； 式中，Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b的浓度，Ct为总叶绿素浓度，单位为mg/g 干重。
叶绿色含畺计算公式(mg/g) = mmmmmxmmmmRxmmim
样品鮮重(或干重〉(2)数据分析采用Microsoft Excel 2003和SPSS 11. 5软件进行处理。菌种筛选
初筛通过平板分离筛选，得到透明圈/菌落直径比值较大且生长较快的菌落。将所得的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌分别进行划线分离、编号并保藏于固体斜面培养基上。复筛通过测定枯草芽孢杆菌和酵母菌的生长曲线，分析菌种生长活性最高和繁殖能力最好时期为对数期，将此期的菌种提取出来，稀释成不同浓度，用于草坪植物接种。 由表1和可以看出，所得微生物菌剂中富含枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母菌，三菌种的菌落数在2. 44X 109-2· 47X IO9之间，枯草芽孢杆菌的OD600值为0. 545，酵母菌的OD560值为 0.567。
权利要求
1.城市生活垃圾堆肥堆肥复合微生物菌剂在提高草坪植物抗盐性方面的应用，其中的复合微生物菌剂为稀释100-200倍的体积比为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 :1 :1的3 个菌种组成；所述的盐指的是0. 3%-0. 9%NaCl盐碱土。
2.权利要求1所述的应用，其中的草坪植物为黑麦草或高羊茅。
3.权利要求1所述的应用，其中所述的抗盐性指的是城市生活垃圾堆肥堆肥微生物菌剂在促进黑麦草光合速率、缓解盐胁迫造成的叶绿素含量下降方面的应用；所述的复合微生物菌剂为稀释100倍的体积比为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1 1 1的3个菌种组成。
4.权利要求1所述的应用，其中所述的抗盐性指的是堆肥微生物菌剂在增强植物根系抵抗盐胁迫方面的应用；所述的盐指的是0. 3%-0. 9%NaCl盐碱土。
5.权利要求1所述的应用，其中所述的抗盐性指的是堆肥微生物菌剂在增加高羊茅叶绿素含量方面的应用；其中的复合微生物菌剂为稀释200倍的体积比为枯草芽孢杆菌 放线菌酵母菌=1 1 1的3个菌种组成。
全文摘要
本发明公开了一种城市生活垃圾堆肥复合微生物菌剂在提高草坪植物抗盐性方面的应用，其中的复合微生物菌剂为稀释100-200倍的体积比为枯草芽孢杆菌放线菌酵母菌=1∶1∶1的3菌种组成；所述的抗盐性指的是0.3%-0.9%NaCl盐碱土。实验结果表明两种草坪植物接种了城市生活垃圾堆肥复合微生物菌剂后，抗盐胁迫的最大胁迫能力可以达到0.9%的盐胁迫，说明采用本发明配制的稀释100-200倍的复合微生物菌剂对缓解草坪植物盐胁迫有明显的促进作用。
文档编号C05G3/04GK102172145SQ20111003705
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者多立安, 王晶晶, 赵树兰 申请人:天津师范大学