专利名称：一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09及其发酵液和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09, Fusella sp DG09发酵液及其制备方法和应用。
背景技术：
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv. ) Diels的干燥根，味甘、辛、温， 归肝、心、脾经，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。当归药材主产于我国甘肃岷县、 武都、成县等地，是一种常用中药材，资源相对比较紧张。而当归、人参等根及根茎类药材在栽培过程中特别容易受到有害病菌的感染，每年因植物病害造成的减产达10 30%，严重的年份高达50%以上，同时药材的外观与内在品质下降。目前中药材植物病害的防治主要采用有机农药，结果造成中药材农药残留超标，严重影响药材的质量及其安全性，已成为中药走向世界的“瓶颈”。此外，在农作物的栽培中，水稻纹枯病、稻瘟病、白叶枯病、小麦白粉病、锈病、赤霉病、植物线虫病和病毒病等危害作物栽培面积达到2700万公顷。因此，当前急需研制高效、低毒、低残留的“无公害”安全农药。而研究开发与利用生物农药防治中药材以及农作物的病虫害已成为当今重要的研究方向。生物农药是指利用生物活体或其代谢产物，主要是利用某些特殊微生物或微生物的代谢产物对害虫、病菌、杂草、线虫、鼠类等有害生物进行防治的一类农药制剂，或者是通过仿生合成具有特异作用的农药制剂。具有广谱、高效、安全、无残留、无抗药性产生、不杀害天敌、不污染生态环境等优点。例如用木霉属真菌防治白术、菊花的白鹃病及人参、西洋参的立枯病；利用微生物的代谢产物新多氧霉素防治人参的黑斑病等都取得了良好的效果。内生真菌是指在植物体内完成其生活史的部分或全部，生长于植物组织细胞间， 分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根中，但又不引起任何病症的微生物，突出强调了内生真菌与植物的互惠共生关系。在内生真菌与宿主植物构成的微生态系统中，内生真菌发挥着重要的生态学功能，80%的植物内生真菌在抗藻类或抗杂草等方面具有较强的生物活性。 现代研究表明，内生真菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，能够产生一些结构新颖、类型多样的次生代谢产物，如萜类、生物碱类、芳香类、肽类等化合物。目前关于药用植物内生真菌抗菌活性的研究较少，当归研究主要集中在活性成分及药理活性方面的研究，当归内生真菌的研究还未见相关报道，因此，很有必要在现有技术的基础上，充分利用当归资源， 寻找具有抗菌活性的当归内生真菌及其代谢物，并开发成防治植物病虫害的生物农药具有重要的应用前景。
发明内容
发明目的本发明的目的是为了解决现有技术的不足，对当归内生真菌进行深入研究，提供一种具有较强抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09，本发明另一个目的是提供当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液及其制备方法和其作为防治植物病害农用制剂中的应用。技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09,Fusella sp DG09 菌株属于暗梗梭孢霉属Fusella sp真菌，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 4543，保藏日期2011年1月17日，保藏名称为暗梗梭孢霉 Fusella sp.，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。Fusella sp DG09菌株特征为分生孢子与菌丝的区别不明显，分生孢子梗和分生孢子均为暗色，分生孢子生在梗的短枝上，单生，分生孢子梭形，无隔膜。本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的分离方法为采集新鲜当归外植体，用水冲洗后切割成小段，然后按下列程序对当归外植体表面进行消毒先用浓度为0. 氯化汞消毒5 8min，无菌水冲洗2 3次，再用浓度为75%酒精消毒30至40秒，无菌水冲洗2 3次，将消毒后的当归外植体再剪切成0. 3 0. 5cm长的小段，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在培养8 10天，待当归外植体样品边缘有菌丝长出后，切取样品块边缘菌丝接种于新鲜PDA平皿上继续培养，待长出新鲜菌丝后，挑取菌落边缘菌丝接种到新鲜的PDA斜面上培养5 7天，如此反复转接至新鲜PDA斜面3 5次，得到当归内生真菌Fusella sp DG09。其中所述PDA培养基由下列重量份数的原料制成20%马铃薯(制作方法为取马铃薯洗净，切成小块，加入适量蒸馏水， 煮沸20min后，过滤，取滤液)、2 %葡萄糖、1. 5 2. 0 %琼脂。本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基的摇瓶中， 于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基的500升发酵罐(即菌种和发酵培养基的体积比例为1 10)，其中无菌空气的通气量为1 0.6 1.2(即单位时间内通入的无菌空气和发酵培养基的体积比)，搅拌速度为180 240转/分，培养温度25 30°C，培养时间4 5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩至原体积的1/3 1/4，得当归内生真菌发酵液。作为优选方案，以上所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液，其中所述的种子培养基由下列重量份数的原料制成2%葡萄糖，0.3%花生饼粉(制作方法为取花生饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)，0.3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵；发酵培养基由下列重量份数的原料制成可溶性淀粉(需糊化)，葡萄糖，0.3%硫酸镁，0.3%磷酸二氢钾，0.3%硫酸铵，2%豆饼粉 (制作方法为取豆饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)。本发明所采用的当归外植体，可以是当归的根、茎或者叶等部位。本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液的活性部位，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基的摇瓶中， 于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0.6 1.2，搅拌速度为180 MO 转/分，培养温度25 30°C，培养时间4 5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓
5缩至原体积的1/3 1/4，得当归内生真菌发酵液，先用石油醚萃取1 3次，然后再用乙酸乙酯萃取1 3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压真空浓缩，干燥，得到当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的活性部位。本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液的制备方法，其包括以下步骤取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基的摇瓶中， 于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0.6 1.2，搅拌速度为180 MO 转/分，培养温度25 30°C，培养时间4 5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩，得当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液。作为优选方案，以上所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的制备方法，所述的种子培养基由下列重量份数的原料制成2%葡萄糖， 0. 3%花生饼粉(制作方法为花生饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)， 0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵；发酵培养基由下列重量份数的原料制成
可溶性淀粉(需糊化)，葡萄糖，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%硫酸铵，2% 豆饼粉(制作方法为取豆饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)。作为优选方案，以上所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的制备方法，离心速度为5000转/分钟，离心时间为10至15分钟。本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液或者本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液的活性部位可以用于制备防治植物病害农用制剂。作为优选方案，本发明提供的的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液或其有效部位在制备防治小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌等病害农用制剂中的应用。有益效果本发明提供的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09及其发酵液和现有技术相比具有以下优点1、本发明经过大量实验筛选，以新鲜当归植株为原料，筛选出具有抗小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌等植物病原菌活性的有益内生真菌Fusella sp DG09, 并对Fusella sp DG09真菌的发酵代谢产物进行了活性筛选，并筛选出抗植物病原菌活性最强的有效部位。本发明从当归植株分离得到具有抗植物病原菌活性的内生真菌Fusella sp DG09的发酵液或其有效部位有望成为新的生物农药资源，在植物病害的生物防治中将具有较好的应用前景，且对中药材的栽培生产以及中药资源可持续利用等方面都具有重要的实践指导意义和理论价值，并对植物病原真菌的生物防治以及发展绿色中药材提供科学依据。2、本发明提供的的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌发酵液或其有效部位的制备方法环保，其工艺设计合理，可操作性强，产品改良的技术潜力大，能实现工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例1一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基(种子培养基由下列重量份数的原料制成2%葡萄糖，0.3%花生饼粉(取花生饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵)的摇瓶中， 于，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基(发酵培养基由下列重量份数的原料制成可溶性淀粉，葡萄糖，0.3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%硫酸铵，2%豆饼粉(取豆饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0.6 1，搅拌速度为 180 200转/分，培养温度25 30°C，培养时间5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩至原体积的1/3，得当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液。实施例2一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基(种子培养基由下列重量份数的原料制成2%葡萄糖，0.3%花生饼粉(取花生饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵)的摇瓶中， 于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基(发酵培养基由下列重量份数的原料制成可溶性淀粉，葡萄糖，0.3% 硫酸镁，0.3%磷酸二氢钾，0.3%硫酸铵，2%豆饼粉(取豆饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30 分钟，过滤，取滤液)的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0.8 1.2，搅拌速度为200 240转/分，培养温度25 30°C，培养时间4天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩至原体积的1/4，得当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液。实施例3一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的活性部位，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基(种子培养基配方为2%葡萄糖，0.3%花生饼粉(取花生饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤， 取滤液)，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵)的摇瓶中，于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基(发酵培养基配方为1 %可溶性淀粉，1 %葡萄糖，0. 3 %硫酸镁，0. 3 %磷酸二氢钾，0. 3 %硫酸铵，2 % 豆饼粉(取豆饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0. 8 1.2，搅拌速度为180 200转/分，培养温度^ 30°C，培养时间5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩至原体积的1/3，得当归内生真菌发酵液，先用石油醚萃取3次，然后再用乙酸乙酯萃取3次，然后依次再用50%乙醇和水分别萃取3次，合并以上乙酸乙酯萃取液，减压真空浓缩，干燥，即得到当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液中极性较低的乙酸乙酯活性部位。实施例4一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的活性部位，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基(种子培养基配方为2%葡萄糖，0.3%花生饼粉(取花生饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤， 取滤液)，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵)的摇瓶中，于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基(发酵培养基配方为1 %可溶性淀粉，1 %葡萄糖，0. 3 %硫酸镁，0. 3 %磷酸二氢钾，0. 3 %硫酸铵，2 % 豆饼粉(取豆饼粉，加入适量蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，取滤液)的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0. 6 1.0，搅拌速度为200 240转/分，培养温度^ 30°C，培养时间4天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩至原体积的1/4，得当归内生真菌发酵液，先用石油醚萃取3次，然后再用乙酸乙酯萃取3次，然后依次再用50%乙醇和水分别萃取3次，合并以上乙酸乙酯萃取液，减压真空浓缩，干燥，即得到当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液中极性较低的乙酸乙酯活性部位。实施例5抗植物病原真菌菌丝生长的活性测定1、拮抗实验挑取直径为6mm的植物病原真菌菌块接种于PDA平板的中央，然后将从当归外植体中分离得到的内生真菌Fusella sp DG09菌块(直径6mm)，接种在PDA平板四周，于培养6天。2、抑制菌丝生长法将当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液Iml与9ml融化的 PDA培养基混勻，倒入无菌培养皿中制成含有内生真菌发酵液的培养基平板，待培养基凝固后，放入1个供试菌的菌饼(直径为6mm)，使菌饼含有菌丝的一面贴在培养基表面，每种处理重复5次，于培养72 后，测定菌落直径，即为处理组菌落直径；同时设立对照组，即在不含有内生真菌发酵液的PDA培养基平板上接种相应的植物病原真菌，其它条件与处理组相同。按下列公式计算抑制率。菌丝生长抑制率(％ )=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/ (对照组菌落直径-6) X 100%3、结果与分析3. 1当归内生真菌Fusella sp DG09对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用将分离于当归新鲜外植体的内生真菌Fusella sp DG09 (保藏号为CGMCC No. 4543)的发酵液(实施例1和幻二份，分别进行对小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌的拮抗实验和抑制菌丝生长实验，实验结果表明，本发明提供的当归内生真菌 Fusella spDG09拮抗作用较普遍，对小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌均具有较强的拮抗作用，并且实验结果表明当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液对小麦赤霉、 番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌均具有较强的抑制作用，尤其是对小麦赤霉和番茄灰霉生长的抑制作用显著，抑制率分别达到42. 5%和76. 6%，具体实验结果如表1所示。表1当归内生真菌Fusella spDG09对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用内生真菌发酵液小麦赤霉(％)番茄早疫霉(％)番茄灰霉O)水稻纹枯病菌(％)实施例142.532.576.634.68实施例243.633.6577.235.463. 2当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液抑菌活性部位的筛选将按本发明实施例3制备得到的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、水不同极性溶剂萃取物，进行抑菌活性检测。具体实验结果如表2 所示，由实验结果表明，当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液中乙酸乙酯萃取部位对植物病原真菌菌丝体的抑制作用较强，表明在内生真菌次生代谢产物中非极性、亲酯性的活性物质含量较多。表2当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液不同提取部位对病原真菌菌丝生长的
抑制作用
当归内生真菌发酵液的萃取部位对病原真菌
病原真菌当归内生真菌 _的抑制率(％)_
水 50%乙醇乙酸乙酯石油醚
小麦赤霉
Fusella sp DG09
10.2
32.6
23.7
番茄灰霉
Fusella sp DG09
19.4
37.8
28.9
番茄早疫霉 Fusella sp DG09
9.1
27.8
18.9
水稻纹枯病菌 Fusella sp DG09
0
13.4
30.8
12.9实施例6抗植物病原真菌孢子萌发的活性测定1、抑制病原真菌孢子萌发实验取小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌等供试植物病原真菌的孢子配成适当浓度的孢子悬浮液，在IOX10低倍镜观察，每个视野有30 40个孢子。将Iml当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液与Iml孢子悬浮液混合，然后取1滴滴加在凹玻片上，每种处理重复5次。在25°C，80 90%的湿度条件下培养，以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发，当对照组真菌的孢子萌发率达到80%后，计算所有当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液处理组的萌发率。孢子萌发抑制率(％ )= (对照组萌发的孢子数-处理组萌发的孢子数)/对照组萌发的孢子数X 100%2、结果与分析2. 1当归内生真菌Fusella sp DG09对植物病原真菌孢子萌发的抑制作用将分离于当归新鲜外植体的内生真菌Fusella sp DG09的发酵液(实施例1和实施例幻分别进行对小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌的孢子萌发抑制实验，实验结果表明，本发明提供的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液对小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌的孢子萌发均具有较强的抑制作用，抑制率达到90%左右，具体实验结果如表3所示。表3当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液对植物病原真菌孢子萌发的抑制作用
内生真菌小麦赤霉番茄早疫霉番茄灰霉水稻纹枯病菌发酵液实施例190.091.490.189.6实施例288.692.790.888.52. 2当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液抑制植物病原真菌孢子萌发的活性部位筛选将按本发明实施例3制备得到的当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液的石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、水不同极性溶剂萃取物，进行抑制真菌孢子萌发的活性检测。具体实验结果如表4所示，由表4的实验结果表明，当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液中乙酸乙酯萃取部位对植物病原真菌的孢子萌发抑制作用较强，表明在内生真菌Fusella sp DG09次生代谢产物中非极性、亲酯性的活性物质含量较多。表4当归内生真菌Fusella spDG09发酵液不同提取部位对植物病原真菌孢子萌
发的抑制作用
当归内生真菌发酵液的萃取部位对病原真菌
病原真菌当归内生真菌孢子萌发的抑制率(％)
水50%乙醇乙酸乙酯石油醚小麦赤霉Fusella sp DG091.910.756.319.2番茄灰霉Fusella sp OG092.37.665.818.9番茄早疫霉Fusella sp DG093.58.151.921.6水稻纹枯病菌Fusella sp DG092.87.246.117.3 通过以上实验结果表明，本发明从当归植株中筛选得到的当归内生真菌Fusella sp DG09，并对当归内生真菌Fusella spDG09进行发酵培养得到当归内生真菌Fusella sp DG09发酵液或者当归内生真菌Fusella sp发酵液的活性部位具有较强的抑制植物病原菌的活性，如对小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌等病菌均具有较强的抑制作用。本发明充分利用当归药用资源，分离得到具有抗植物病原菌活性的内生真菌Fusella sp DG09及其发酵液或其有效部位有望开发成为新的生物农药资源，在植物病虫害的生物防治中具有较好的应用前景。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09，其特征在于， Fusella spDG09菌株属于暗梗梭孢霉属Fusella sp真菌，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.妨43，保藏日期2011年1月17日。
2.一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的取当归内生真菌Fusella sp DG09的斜面菌种接种到装有种子培养基的摇瓶中，于^°C，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为 1 0.6 1.2，搅拌速度为180 240转/分，培养温度25 30°C，培养时间4 5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩至原体积的1/3 1/4，得当归内生真菌发酵液。
3.根据权利要求2所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09 的发酵液，其特征在于，所述的种子培养基由下列重量份数的原料制成2%葡萄糖，0. 3% 花生饼粉，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵；所述的发酵培养基由下列重量份数的原料制成丨^可溶性淀粉，丨^葡萄糖』.3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%硫酸铵， 2%豆饼粉。
4.一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09的发酵液的活性部位，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的取权利要求2所制备得到的当归内生真菌 Fusellasp DG09的发酵液，先用石油醚萃取，然后再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，减压真空浓缩，干燥，得到当归内生真菌发酵液的活性部位。
5.权利要求2所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09的发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤取当归内生真菌Fusella sp DG09的菌块接种到种子培养基中，于，200r/min振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10%的接种量接种入装有发酵培养基的500升发酵罐，其中无菌空气的通气量为1 0.6 1.2，搅拌速度为180 240转/分，培养温度 25 30°C，培养时间4 5天，发酵结束后，离心，得上清液，减压真空浓缩，得当归内生真菌发酵液。
6.根据权利要求5所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09的发酵液的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基由下列重量份数的原料制成2%葡萄糖，0. 3%花生饼粉，0. 3%硫酸镁，0. 3%磷酸二氢钾，0. 3%氯化铵；发酵培养基由下列重量份数的原料制成可溶性淀粉，葡萄糖，0.3%硫酸镁，0.3%磷酸二氢钾，0.3%硫酸铵，2%豆饼粉。
7.权利要求2或3所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09的发酵液在制备防治植物病害农用制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09的发酵液在制备防治植物病害农用制剂中的应用，其特征在于，所述的植物病害包括小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌病害。
9.权利要求4所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09的发酵液的活性部位在制备防治植物病害农用制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusellasp DG09 的发酵液的活性部位在制备防治植物病害农用制剂中的应用，其特征在于，所述的植物病害包括小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌病害。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗植物病原菌活性的当归内生真菌Fusella sp DG09及其发酵液和其应用，Fusella sp DG09在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.4543，保藏日期2011年1月17日。Fusella sp DG09的发酵液通过以下方法制备得到取Fusella sp DG09的斜面菌种接种到种子培养基中，振荡培养至对数生长期，将培养好的菌种按10％的接种量接种入发酵培养基中，培养4～5天，发酵结束后，离心，得上清液，浓缩，得发酵液。本发明经过大量实验筛选，从当归中筛选出具有强抗小麦赤霉、番茄早疫霉、番茄灰霉和水稻纹枯病菌等植物病原菌活性的内生真菌Fusella sp DG09，在植物病害的生物防治中具有较好的应用前景，对当归等药材的栽培、生产及可持续利用具有重要指导意义。
文档编号A01P3/00GK102174416SQ201110038798
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月16日 优先权日2011年2月16日
发明者段金廒, 江曙, 钱大玮, 陶金华 申请人:南京中医药大学