专利名称：自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法，属于农业生物技术领域，专用于海雀稗秋水仙素诱变育种。背景技术：
海雀稗(/^1Spay腫 Vaginatum 0. Swartz)是禾本科{Graminea)黍族(Paflicea)雀稗属 iPaspalumL.)的多年生草本植物，源产于非洲和美洲，可作为草坪、饲料和改良盐碱地的优良草种(解新明，卢小良.海雀稗种质资源的优良特性及其利用价值[J].华南农业大学学报，2004，25 (增刊11):64 67 ；陈小红.海滨雀稗草坪的特性和养护管理技术[J].上海农业科技，2007(4) 111)。海雀稗(Paspalum Vagina turn)为自交不亲和的有性二倍体(Esp inoza, F. and C. L. Quarin. Cytoembryology of Paspalum chaseanum and sexual diploid biotypes of two apomictic Paspalum species [J]. Austral. J. Botany 1997,45 :871_877),由于同一属内不同种之间杂交不能产生有活力的种子或种子萌发率只有10%左右(Carpenter，J. A. Production and use of seed in seashore paspalum. J. Austral. Instit. Agri. Sci.， 1958，24 :252-256)，常规育种工作进展缓慢。以胚性愈伤组织为材料，通过秋水仙素诱导筛选体细胞突变体被认为是一种有效的育种新途径，但海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体筛选方法国内外未见正式报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法，其以幼穗离体培养获得的颗粒状愈伤组织为材料，以秋水仙素为诱变剂，研究不同浓度和处理时间对愈伤组织生长、分化和植株再生的影响，通过再生植株盆栽或大田结实性调查，以收获种子、播种出苗长成植株为获得体细胞突变体的评价标准，建立海雀稗秋水仙素诱变体细胞突变体的筛选方法。技术方案
自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法，包括
1)材料
选用海雀稗幼穗为外植体，以幼穗诱导产生的白色或淡黄色颗粒状愈伤组织为供体材
料；
2)培养基
基本培养基由MS无机盐、B5有机成分组成，添加蔗糖30g/L ； 愈伤组织继代培养基基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0 mg/L，6-苄基氨基嘌呤 0. 05mg/L,琼脂条 16g/L ；
愈伤组织分化培养基基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2.0 mg/L，琼脂条8g/L; 上述培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调PH值至5. 8 ；
3)方法
将白色或淡黄色颗粒状愈伤组织在继代培养基上进行增殖培养20cT25d，转入添加500^1000 mg/L秋水仙素的愈伤组织继代培养基中，24h后转移到愈伤组织分化培养基，在光照条件下培养35cT45d，绿苗和绿芽再转到附加6-苄基氨基嘌呤2.0 mg/L的分化培养基上继续生长，具有完整3片叶的再生植株移栽至大田或盆钵，经过一个冬季春化作用后， 至第2年成熟期，检查结实性获得种子，在气温20°C以上时播种于装土的盆钵或大田，正常发芽长成具有完整根、茎、叶的植株；
离体培养条件培养室温度为26°C 28°C，光照强度为2000 Lux，光照时间为16h/d。 其中秋水仙素浓度优选为1000 mg/L。有益效果
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果
本发明以自交不结实海雀稗胚性愈伤组织为材料，经秋水仙素诱变获得的再生植株， 通过人工检查成熟期结实率，获得了一批能自交结实的体细胞突变体再生植株。发芽试验表明，收获的种子均能发芽成苗。本发明具有操作简便、周期短和重复选择效率高的优点。四
图1海雀稗颗粒状愈伤组织图2体细胞突变体结实的种子图3体细胞突变体种子盆栽植株五具体实施方式
1.材料与方法 1. 1试验材料
海雀稗品种"Adalayd，，QPaspalum Vaginatum 0. Swartz c. v. Adalayd) , 20 世纪末从美国夏威夷引进我国，2006年江苏省农业科学院从杭州白云草业研究所有限公司引进。 以幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织为材料(梁流芳，佘建明，吴瑛瑛，等.海雀稗幼穗离体培养植株再生[J]·草地学报，2008，16 (6) 590-593.)。1. 2培养基
基本培养基由MS无机盐、Β5有机成分组成，添加蔗糖30g/L ； 愈伤组织继代培养基基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0 mg/L，6-苄基氨基嘌呤 0. 05mg/L,琼脂条 16g/L ；
愈伤组织分化培养基基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2.0 mg/L，琼脂条8g/L; 生根培养基基本培养基附加吲哚乙酸0. 5mg/L,琼脂条8g/L ； 上述培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调PH值至5. 8飞.0 ； 1. 3方法
选择颗粒状胚性愈伤组织在愈伤组织继代培养基上进行20d 25d的增殖培养，接种到添加0、250、500、1000、2000、3000 mg/L秋水仙素的愈伤组织诱导培养基中，24h、48h、72h 后转入愈伤组织分化培养基，在光照条件下培养35cT45d，绿苗和绿芽再转到附加6-苄基氨基嘌呤2.0 mg/L的分化培养基上继续生长，具有完整3片叶的再生植株移栽至大田或盆钵，经过一个冬季春化作用后，至第2年成熟期，检查结实性、获得种子，在气温20°C以上时播种于装土的盆钵或大田，正常发芽长成具有完整根、茎、叶的植株。离体培养条件培养室温度为26°C 28°C，光强为2000 Lux，光照时间为16h/d。
结果
2. 1秋水仙素处理对愈伤组织生长的影响
挑取在愈伤组织继代培养基上增殖培养20d 25d的白色或淡黄色颗粒状愈伤组织， 接种到添加0、250、500、1000、200011^/1秋水仙素浓度的愈伤组织继代培养基中2411、4811和 72h后，转入不含秋水仙素的分化培养基中。生长30cT35d时统计结果表明(见表1)，愈伤组织的褐化率均随秋水仙素处理浓度的升高而升高，愈伤组织的褐化率平均值秋水仙素浓度彡500mg/L时比0、250mg/L提高38. 42% ；秋水仙素处理浓度为500mg/L和1000mg/L，处理时间为72h比24h和48h的愈伤组织的褐化率平均值提高15. 51%和8. 70%。
表1不同秋水汕素处理下海雀捭胚性愈伤组织掲化率(%)
权利要求
1.自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法，其特征在于，1)材料选用海雀稗幼穗为外植体，以幼穗诱导产生的白色或淡黄色颗粒状愈伤组织为供体材料；2)培养基基本培养基由MS无机盐、B5有机成分组成，添加蔗糖30g/L ； 愈伤组织继代培养基基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0 mg/L，6-苄基氨基嘌呤 0. 05mg/L,琼脂条 16g/L ；愈伤组织分化培养基基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2.0 mg/L，琼脂条8g/L; 上述培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调PH值至5. 8飞.0 ；3)方法将白色或淡黄色颗粒状愈伤组织在继代培养基上进行增殖培养20cT25d，转入添加 500 1000 mg/L秋水仙素的愈伤组织继代培养基中，24h后转移到愈伤组织分化培养基， 在光照条件下培养35cT45d，绿苗和绿芽再转到分化培养基上继续生长，具有完整3片叶的再生植株移栽至大田或盆钵，经过一个冬季春化作用后，至第2年成熟期，检查结实性获得种子；离体培养条件培养室温度为26°C 28°C，光强为2000 Lux，光照时间为16h/d。
2.根据权利要求1所述的自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法， 其特征在于秋水仙素诱变浓度为1000mg/L。
全文摘要
本发明涉及一种自交不结实海雀稗秋水仙素诱导体细胞突变体的筛选方法，属于农业生物技术领域。海雀稗颗粒状愈伤组织在愈伤组织继代培养基上增殖培养20d～25d，转到添加500~1000g/L秋水仙素的愈伤组织继代培养基中诱变培养24h，转到分化培养基上培养35d~40d，绿苗和绿芽再转到分化培养基上继续生长，具有3张完整叶的再生植株移栽至大田或盆钵，移栽第2年成熟期，检查结实性获得可自交结实的体细胞突变体植株，收获的种子播种后能100%发芽长成具有完整根、茎、叶的植株，并能正常分蘖和成坪。本发明适用于海雀稗新品种选育，具有操作简便、周期短和选择效率高的优点。
文档编号A01H4/00GK102177849SQ20111007414
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者刘智微, 吴娟子, 周和锋, 常盼盼, 许映君, 钟小仙 申请人:江苏省农业科学院