专利名称：土茯苓组培苗的培养方法
土茯苓组培苗的培养方法明涉及通过组织培养技术培养植物种苗的方法，具体是一种土茯苓组培苗的培养 方苓为百合科植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb.)的干燥根茎，为常绿攀援状灌木，于 我国西南部、南部至东南部各省区，亚洲东南部各国也有分布。其性平味甘淡，其野生根状 茎为原料，具有清热除湿，解毒，利关节、健脾胃等多种功能，可以治旋体、关节酸痛、尿路感 染、白带、疮疡等多种疾病。土茯苓的开发前景十分广阔，于需求量加大，人们对野生土茯苓 资源的掠夺式采挖，其生态环境被严重破坏，导茯苓资源急剧下降，大力发展人工栽培，具 有重要的生态和经济意义。，国内外学者开展了对土茯苓的初步研究，包括化学成分，药理活性，人工种植等 有关土茯苓的生物技术方法的研究较少，组织培养的研究主要集中在组织诱导、基件筛选 和理化因子的考查等方面。还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决土茯苓诱导、增殖生根培养中存在 的点，从而影响了土茯苓的深入研究和应用。因此，研究土茯苓的人工培养技术，实显得十 分重要。明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种繁殖速度快的土茯苓组培苗的培
养现上述目的本发明提供一种土茯苓组培苗的培养方法，该方法包括如下步骤植物外植体的选择及无菌处理选择土茯苓野生植物根状茎为外植体，用自来水 冲再用蒸馏水冲洗，切取侧芽，将侧芽组织置于超净工作台中，用75%酒精消毒30 用浓 度为0. 0. 2%升汞溶液消毒6 10分钟，无菌水冲洗3 5次，最后用滤纸水，无菌 条件下剥取侧芽生长锥；丛生芽诱导培养将剥取的侧芽生长锥接种到丛生芽诱导培养基MS+BA 1. 0 +IBA 0. 1 0. 5mg/L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 20 30mg/L+ 琼脂 6 7mg/L 中，培养期 为30天；增殖培养将诱导出的丛生芽接种到增殖培养基MS+BA 2. 0 4. Omg/L+NAA 0. 2 +蔗糖20 30mg/L+琼脂6 7mg/L中进行继代培养，30天继代一次，连续转接3 期为90天；壮苗培养将增殖培养出的丛生芽切成单芽或者小丛芽，接种到壮苗培养基 MS+BAmg/L+KT 0. 5 0. 7mg/L+IBA 0. 1 0. 3mg/L+ 蔗糖 20 30mg/L+ 琼脂 6 7mg/L 期 为30天；(5)生根培养将壮苗培养后的开叶的小苗接种到生根培养基1/2MS+NAA 0. 5 0. 9mg/L+IBA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 20 30mg/L+ 琼脂 6 7mg/L 中，培养期为 40 天；步骤(2) (5)中所述培养基pH值为5. 5 5. 8，培养温度为23°C 27°C，光照 时间为10 14小时/天，光照强度为100 μ mol/m2 · S。步骤⑵所述的丛生芽诱导培养基的优选为MS+BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/ L+NAAO. lmg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。步骤(3)所述的增殖培养基的优选为MS+BA 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖25mg/L+ 琼脂 7mg/L。步骤(4)所述的壮苗培养基的优选为MS+BA 0. 8mg/L+KT 0. 5mg/L+IBA 0. lmg/ L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。步骤(5)所述的生根培养基的优选为1/2MS+NAA 0. 5mg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。本发明的优点在于选用配方合理的培养基，培养出的组培苗生根率高，稳定性 好。该方法易操作，而且不受外界条件的限制，四季皆可进行，节约育苗占地面积，降低生产 成本，不污染环境，可以实现批量生产。通过本发明方法生产土茯苓，产量大，成本低，周期 短，极具市场竞争力。
具体实施例方式通过下面给出的具体实施例可以进一步清楚地了解发明的内容，但不是对本发明 的限定。实施例1 土茯苓组培苗的培养方法，该方法包括如下步骤(1)外植体的选择及无菌处理植物外植体的选择及无菌处理选择土茯苓野生 植物根状茎为外植体，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，切取侧芽，将侧芽组织置于超 净工作台中，用75%酒精消毒60秒，再用0. 升汞溶液消毒6分钟，无菌水冲洗3次，最 后用滤纸吸干无菌水，无菌条件下剥取侧芽生长锥；(2)丛生芽诱导培养将剥取的侧芽生长锥接种到丛生芽诱导培养基MS+BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L 中诱导侧芽，培养期为 30 天，接种第15天切口处变红膨大，开始形成绿色愈伤组织，25天侧芽明显伸长，生长较快， 30天时丛生芽的诱导率为100% ；(3)增殖培养将诱导出的丛生芽接种到增殖培养基MS+BA 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/ L+蔗糖25mg/L+琼脂7mg/L中进行继代培养，培养期为90天，30天为一个继代周期，连续 继代3次，初始生长较慢，增殖倍率小，第3次继代后增殖较快，增殖倍数可达到3. 5倍；(4)壮苗培养将增殖培养出的丛生芽切成单芽或者小丛芽，接种到壮苗培养基 MS+BAO. 8mg/L+KT 0. 5mg/L+IBA 0. lmg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L 中，培养期为 30 天，30 天后不定芽长高长粗，可见2 3cm的开叶小苗；(5)生根培养将壮苗培养后的开叶的小苗接种到生根培养基1/2MS+NAA 0. 5mg/ L+IBAO. lmg/L+蔗糖25mg/L+琼脂7mg/L中，培养期为40天，15 20天有根生成，40天时 能形成完整根系，生根率为85%，移栽成活率100% ；步骤(2) (5)中所述培养基pH值为5. 8，培养温度为25°C，光照时间为12小时 /天，光照强度为lOOymol/m2 · S。实施例2 土茯苓组培苗的培养方法，该方法包括如下步骤(1)外植体的选择及无菌处理植物外植体的选择及无菌处理选择土茯苓野生 植物根状茎为外植体，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，切取侧芽，将侧芽组织置于超 净工作台中，用75%酒精消毒60秒，再用0. 1 %升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后用滤纸吸干无菌水，无菌条件下剥取侧芽生长锥；(2)丛生芽诱导培养将剥取的侧芽生长锥接种到丛生芽诱导培养基MS+BA 2. Omg/L+IBA 0. 5mg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L 中诱导侧芽，培养期为 30 天，接种第21天切口处开始变红膨大，开始形成绿色愈伤组织，生长较慢，30天时丛生芽的 诱导率为72% ；(3)增殖培养将诱导出的丛生芽接种到增殖培养基MS+BA 4. Omg/L+NAA 0. 4mg/ L+蔗糖25mg/L+琼脂7mg/L中进行继代培养，培养期为90天，30天为一个继代周期，连续 继代3次，初始生长较慢，增殖倍率小，第3次继代后增殖倍数为2倍；(4)壮苗培养将增殖培养出的丛生芽切成单芽或者小丛芽，接种到壮苗培养基 MS+BA1. Omg/L+KT 0. 7mg/L+IBA 0. 3mg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L 中，经壮苗培养 30 天， 不定芽生长仍较缓慢，仅见1 1. 5cm的开叶小苗；(5)生根培养将壮苗培养后的开叶的小苗接种到生根培养基1/2MS+NAA 0. 9mg/ L+IBA 0. 5mg/L+蔗糖25mg/L+琼脂7mg/L中，培养期为40天，20 25天有根生成，40天时 能形成完整根系，生根率为85%，移栽成活率95% ；步骤(2) (5)中所述培养基pH值为5. 5，培养温度为27°C，光照时间为14小时 /天，光照强度为lOOymol/m2 · S。实施例3 土茯苓组培苗的培养方法，该方法包括如下步骤(1)外植体的选择及无菌处理植物外植体的选择及无菌处理选择土茯苓野生 植物根状茎为外植体，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，切取侧芽，将侧芽组织置于超 净工作台中，用75%酒精消毒40秒，再用0. 2%升汞溶液消毒6分钟，无菌水冲洗5次，最 后用滤纸吸干无菌水，无菌条件下剥取侧芽生长锥；(2)丛生芽诱导培养将剥取的侧芽生长锥接种到丛生芽诱导培养基MS+BA 1. 5mg/L+IBA 0. 25mg/L+NAA 0. 25mg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L 中诱导侧芽，培养期为 30 天，接种第20天切口处开始变红膨大，开始形成绿色愈伤组织，生长较慢，30天时丛生芽的 诱导率为68% ；(3)增殖培养将诱导出的丛生芽接种到增殖培养基MS+BA3. 0mg/L+NAA 0. 3mg/ L+蔗糖25mg/L+琼脂7mg/L中进行继代培养，培养期为90天，30天为一个继代周期，连续 继代3次，初始生长较慢，增殖倍率小，第3次继代后增殖倍数为2. 5倍；(4)壮苗培养将增殖培养出的丛生芽切成单芽或者小丛芽，接种到壮苗培养基 MS+BA0. 9mg/L+KT 0. 6mg/L+IBA 0. 2mg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L 中，经壮苗培养 30 天， 不定芽生长仍较缓慢，仅见少数有开叶小苗，且小苗开叶生长缓慢；(5)生根培养将壮苗培养后的开叶的小苗接种到生根培养基1/2MS+NAA 0. 7mg/ L+IBA 0. 3mg/L+蔗糖25mg/L+琼脂7mg/L中，培养期为40天，20 25天有根生成，40天时 能形成完整根系，生根率为85%左右，移栽成活率98% ；步骤(2) (5)中所述培养基pH值为5. 6，培养温度为27°C，光照时间为10小时 /天，光照强度为lOOymol/m2 · S。
权利要求
1.一种土茯苓组培苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)植物外植体的选择及无菌处理选择土茯苓野生植物根状茎为外植体，用自来水 冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，切取侧芽，将侧芽组织置于超净工作台中，用75%酒精消毒 30 60秒，再用浓度为0. 1 % 0. 2%升汞溶液消毒6 10分钟，无菌水冲洗3 5次，最 后用滤纸吸干无菌水，无菌条件下剥取侧芽生长锥；(2)丛生芽诱导培养将剥取的侧芽生长锥接种到丛生芽诱导培养基MS+BA1.0 2. Omg/L+IBA 0. 1 0. 5mg/L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 20 30mg/L+ 琼脂 6 7mg/L 中 诱导侧芽，培养期为30天；(3)增殖培养将诱导出的丛生芽接种到增殖培养基MS+BA2. 0 4. Omg/L+NAA 0. 2 0. 4mg/L+蔗糖20 30mg/L+琼脂6 7mg/L中进行继代培养，30天继代一次，连续 转接3次，培养期为90天；(4)壮苗培养将增殖培养出的丛生芽切成单芽或者小丛芽，接种到壮苗培养基 MS+BA0. 8 1. Omg/L+KT 0. 5 0. 7mg/L+IBA 0. 1 0. 3mg/L+ 蔗糖 20 30mg/L+ 琼脂 6 7mg/L中，培养期为30天；(5)生根培养将壮苗培养后的开叶的小苗接种到生根培养基1/2MS+NAA0. 5 0. 9mg/L+IBA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 20 30mg/L+ 琼脂 6 7mg/L 中，培养期为 40 天；步骤(2) (5)中所述培养基pH值为5. 5 5. 8，培养温度为23°C 27°C，光照时间 为10 14小时/天，光照强度为lOOymol/m2 · S。
2.根据权利要求1所述的土茯苓组培苗的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述的丛生 芽诱导培养基为MS+BA 1. 0mg/L+IBA 0. lmg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。
3.根据权利要求1所述的土茯苓组培苗的培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的增殖 培养基为MS+BA 2. 0mg/L+NAA 0. 2mg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。
4.根据权利要求1所述的土茯苓组培苗的培养方法，其特征在于，步骤(4)所述的壮苗 培养基为MS+BA 0. 8mg/L+KT 0. 5mg/L+IBA 0. lmg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。
5.根据权利要求1所述的土茯苓组培苗的培养方法，其特征在于，步骤(5)所述的生根 培养基为1/2MS+NAA 0. 5mg/L+IBA 0. lmg/L+ 蔗糖 25mg/L+ 琼脂 7mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种土茯苓组培苗的培养方法，包括植物外植体的选择及无菌处理，丛生芽的诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养。本发明的优点在于选用配方合理的培养基，培养出的组培苗生根率高，稳定性好。该方法易操作，而且不受外界条件的限制，四季皆可进行，节约育苗占地面积，降低生产成本，不污染环境，可以实现批量生产。通过本发明方法生产土茯苓，产量大，成本低，周期短，极具市场竞争力。
文档编号A01H4/00GK102138527SQ201110075078
公开日2011年8月3日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者宋波, 张华英, 曾建红, 李云秋, 段小群, 蒋剑刚 申请人:广西相成生物科技有限公司