专利名称：甘蓝型油菜BnPABP2启动子的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程和生物技术领域。具体涉及一种甘蓝型油菜&1PABP2启动子(命名为PBnPABP2，以下相同)，同时还涉及一种甘蓝型油菜&1PABP2启动子的制备方法。 本发明还涉及含有该启动子或其同源核苷酸序列的载体和涉及利用该启动子在油菜及其它植物基因工程中的应用。
背景技术：
植物启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因表达调控是多种因素综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平调控、翻译水平调控以及蛋白质加工水平调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型和特异型两类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报。2002,23( :52-56)。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(Jia S-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced of Bioengineer. 1997,17(6) :37-42 ；Morris S H,Adley C. C. Irish public perceptions and attitudes to modern biotechnology :an overview with a focus on GM foods. Trends in Biotechnology, 2001,19(2) :43-48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子等(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报。2002,23( :52-56)。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。而且化学调控系统中用作诱导物的甲基脱S皮质醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)禾口四环素(tetracycline)者β对生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题。显然，外源基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年来在这方面已经取得很大成就。在不同组织中特异性表达的各类启动子已不断得到研究(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报。2007，(4) :21-24).油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。 随着转基因技术的成熟，转基因油菜必然会面临转基因安全风险的舆论。用在油菜种子中完全不表达的启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法。达到既提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险的目的。因此，本发明开发了一个甘蓝型油菜内源启动子。通过荧光定量PCR检测表明该启动子驱动的内源基因在植株的根、茎、叶片、花蕾、角果中高量表达。通过检测报告基因 ⑶S的表达特征证明启动子驱动的基因在根部、茎部、叶片、花蕾以及角果皮中高量表达而种子中不表达。我们的结果预示着该基因的启动子在转基因植物中具有相当的应用前景。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜Pbhpabp2启动子。该启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位。可应用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全转基因研究。本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜Pbhpabp2启动子的制备方法。该方法通过对甘蓝型油菜基因组进行基因组步移，获得甘蓝型油菜PBnPABP2序列。其优点在于操作简单，结果稳定可靠。本发明的再一个目的是在于提供了一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因 GUS表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。本发明还有一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜？^^吧启动子在根部、茎部、 叶片、花蕾、花药以及角果皮的应用。Pbhpabp2的功能能够反映油菜&1PABP2基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根部、茎部、叶片、 花蕾、花药以及角果皮中精细表达，而种子中完全不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物抗病、抗倒伏、提高光和作用、含油量、改变花期、改变花瓣颜色、抗逆、人工创建种质资源等基因工程和转基因安全(食用、花粉漂流)中具有应用价值。为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案为了获得本发明，发明人对油菜发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现一种新的启动子。该启动子驱动的内源基因在植物的根、茎、叶片、花蕾、角果皮中高效表达。根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供一种启动子来实现，所述启动子能够特异性驱动基因在植物中高效表达，所述启动子含有SEQ ID No. 1核苷酸序列或与SEQ ID No. 1实质上同源的核苷酸序列。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子的核苷酸序列的重组载体来实现。
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根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因植物来实现。1 一种甘蓝型油菜启动子Pbhpabp2的制备方法，其步骤是1. 1ΡΒηΡΑΒΡ2驱动的内源基因的表达模式本发明所用油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)。供试材料播种于大田，正常
田间管理。从大田生长条件下生长的植株上取根、茎、叶、花蕾，角果每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。利用Trirol 提取试剂盒的要求进行RNA的提取。荧光定量PCR仪为RTTM-Cycler (博奥生物有限公司)，采用油菜Actin作为内标基因(登录号 AFl 11812)，Actin 基因引物为 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 和 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘。PBnPABP2 驱动的内源基因引物为 5 ‘ -GGCTTCAAATCTGGCTAATG-3'和 5 ‘ -TGGAGAACTTCGGTCTGGTC-3‘。荧光定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测？__2驱动的内源基因在油菜组织(根、茎、叶、花、角果)中的表达。用比较Ct法(Δ Δ Ct)计算基因的相对表达量。通过2_Δ 估算目的基因的相对表达量禾口系统误差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2_Δ ΔcTMethod. METHODS 25,402-408)。在计算相对表达量时，以花蕾的样本为参照，即将其值转换成1 (标准值)，其它样品再与其比较，获得相对表达值。1. 2基因组步移克隆PBnPABP2序列利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)提取基因组DNA，按照基因组步移试剂盒(购自Clontech公司，产品代号Cat. No. 638904)操作程序，进行基因组步移。具体步骤为提取基因组DNA 25口1^0.1“8/^0，分别用核酸内切酶0仪I、EcoR V、PvuII和Mu I酶切，纯化后加入接头形成四个不同的基因组DNA库，用作首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守序列设计特异性引物GSPl(表幻与基因组步移试剂盒(购自Clontech公司，产品代号Cat. No. 638904)内上游接头引物API (表幻进行扩增。第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液(水稀释液)为模板，同样方法设计的特异性引物63 2(表幻和接头引物 AP2 (表2、进行扩增，随后进行第二轮基因组步移。所有PCR反应均为50 μ L扩增体系模板1 μ L, dNTPs 0. 2mM，引物0. 5mM,LA Taq酶 1. 25 单位，10 X LA-PCRbuffer (含MgCl2) 5 μ L， 补水至50 μ L。反应条件均为94°C预变性lmin;98°C 10s，72°C 6min7个循环；98°C 10s, 67°C 6min33个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物经1. 0% (质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到 PMD18-T载体(购自TaKaRa公司，以下相同)，转化gold菌株(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)的感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列，此序列包括PBnPABP2驱动的内源基因的起始密码子至GSP2之间的区段和该基因的启动子序列。根据获得的序列，设计扩增启动子区域片段的引物PBnPABP2S :5' -CAGAAGCTTGTCAA TTTTCCCCTTTATAAAGCC-3 ‘和 PBnPABP2A 5 ‘ -GACATCTAGACTGGCTAAACGCCTCGAAA-3 ‘，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。所有引物的5'端含有Hind III酶切位点，3'端含有)(ba I 酶切位点。反应体系为 25 μ L 内含IXPCR buffer,MgCI 1. 5mmol/L,dNTP 0. 2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0. 5mol/L, Pfu酶1. 5单位，模板约lOOng，根据具体情况设置循环参数。PCR产物经1.0% (质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶检测，凝胶回收试剂盒回收各目的缺失片段。按各回收的缺失片段载体(0. 3pmol缺失片段0. Ipmol载体片段)= 3 1的比例混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，IX反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml， 16°C过夜连接反应。冻融法转化大肠杆菌gold菌(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，96-99)感受态细胞中。涂布于含有氨苄青霉素50μ g/mL的LB固体培养基(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和 10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中， 121°C，6. 859X 104 下高压消毒15分钟。4°C冷藏备用)平板上，37°C培养过夜，各挑选白斑三个,做菌落PCR检测(反应体系为25 μ L内含1 XPCRbuffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0. 5mol/L, Pfu酶1. 5单位，用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模版，根据具体情况设置循环参数)，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50 μ g/mL 的液体LB培养基(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，12rC，6.859X104I^a下高压消毒15分钟。4°C冷藏备用)，37°C下200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)提取质粒，Hind ΙΙΙ/Xba I酶切质粒lygj.S^ (质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测。检测正确的阳性重组克隆，命名为pMD18-PBnPABP2 (将目的片段连入pMDIS-T载体构建而成，以下相同)，为了确保载体中启动子的序列信息，以 M13F/M13R为引物(M13 F5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，； M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，)，将 pMD18-PBnFABP2 进行序列测定，分析结果，获得了 PBnFABP2 其序列为SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。1. 3启动子序列生物信息学分析将所克隆序列用BLASTN(http://www. . ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)进行同源比对。启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. html 禾口 PLACE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database (J). Nucleic Acids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/进行预测。得到可能的核心启动子序列和上游启动子元件。2 一种甘蓝型油菜启动子PBnPABP2在转基因植株的根部、茎部、叶片、花蕾以及角果皮中的应用，其步骤是2. 1ΡΒηΡΑΒΡ2植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105 (购于上海沪尚生物科技有限公司以下相同)的转化构建的重组载体是将质粒pBI121 (购自TaKaRa公司)上的35S启动子用技术方案1中克隆得到？__2片段替换而来。为完成此目的，首先用》^ I/Hind III双酶切克隆载体 pMD18-PBnPABP2 的启动子片段，同时用 Xba I/Hind III 酶切 pBI121 (Chen, P. Y.，Wang， C. K. , Soong, S.C. To, K. Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its
6application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11, 287-293)质粒。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用(质量体积比。 以下相同)琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体PMDIS-Pbiipabp2酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnPABP2酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(150ng小失片段50ng大片段)=3 1 的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4 DNA连接酶5单位，IOX反应缓冲液，无菌水补充体积至20 μ L，16°C连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的固体LB培养基平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，经酶切验证正确的重组质粒命名为pBI-PBnPAEP2。利用冻融法(步骤如下1 取0. 2ml感受态农杆菌，于冰水中缓慢融化。2 加入约2 μ g重组质粒 DNA,轻轻混勻，冰浴30min后，投入液氮速冻lmin，然后37°C水浴5min，融化细胞。3 加入 800μ 1不含抗生素YEP液体培养基，28°C轻摇培养4-5h。4 :12000rpm，30s，去上清，细胞重悬于0. 2mlYEP培养基。5将培养物均勻涂布在含Rif (50mg/L)，Str (50mg/L)和Kan (50mg/ L)的琼脂板上培养2天，待平板上出现转化子后挑菌检测)将pBI-PBnPAEP2转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)，用卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)双抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证。2. 2PBnPABP2 的功能分析2. 2. 1ΡΒηΡΑΒΡ2植物表达载体PBI-Pbhpabp2在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选参照文献中的方法进行拟南芥转化Oiang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1:1-6)。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50yg/ml、利福平50yg/ml的LB液体培养基中，28°C过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEK0L 1300)于276nm纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温00-25°C，以下相同)以4000g离心lOmin，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖(质量体积比)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02% (体积比)的Silwet 1-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混勻后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5 天。将转化收获的TO代种子用70% (体积比)酒精和0.01% (质量比)的升汞分别表面消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固体筛选培养基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液IOml ；MS有机母液IOml ；MS铁盐IOml ； 肌醇IOml ；蔗糖30g ；用IM NaOH调PH至5. 8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入8g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1)表面。4°C春化4-6天，放入恒温培养箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小时，温度白天22°C，暗周期20°C )培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测(反应体系为25 μ L内含IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L (毫摩尔每升)、引物浓度为0. 5mol/L，Pfu酶1. 5单位，模板约 lOOng，根据具体情况设置循环参数)，结果表明获得了转基因阳性苗。表IMS培养基母液配方
权利要求
1.一种分离的启动子/7LM其序列为SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种分离的启动子，其特征在于所述的启动子含有重组载体 pBI-Aum。
3.权利要求1所述的一种甘蓝型油启动子的制备方法，其步骤是A、制备油菜/^zmm启动子引物设计利用SDS裂解法提取油菜DNA，按照基因组步移试剂盒操作程序，进行基因组步移，步移进行两轮PCR扩增，克隆获得油菜P—步移所用引物是APl 5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ；GSPl 5' - CTTTCTCATCTCAGAAGGCTTACCATCT TGGGG - 3' ；AP2 5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3' ；GSP2 5' - GCAAACCCTAACCGAGACCACTTGA CCC - 3'；B、甘蓝型油菜启动子Λ^μμ制备是根据基因组步移试剂盒说明，取5μ 1 DNA用々ra I酶切，检测其纯度，体系如下DNA 5 μ 1, Dra I 1. 6 μ 1, IOXbuffer 2 μ 1，无菌水补齐至 20 μ 1，37°C，过夜，用 1 %质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，分别用产生平末端的限制性内切酶々raljcoTtYIraII 和StoI在100 μ 1体系内酶切2. 5μ g的基因组DNA，四种限制性内切酶的反应体系如下 DNA 2.5 μ g，限制性内切酶8 μ 1, IOXbuffer 10 μ 1，无菌水补齐至100 yl，37°C过夜；酶切完成后纯化，纯化步骤如下向酶切液中加入10 μ 1的3Μ NaOAc和50 μ 1的95% 体积比乙醇，-20°C下沉淀3小时，然后12000rpm离心15分钟，70%体积比乙醇洗涤两遍， 12000 rpm离心5分钟，室温下晾干，用20 μ 1无菌水溶解；纯化完成后加入特异性接头，反应体系如下=IOXjM ligase buffer 2.0 μ ，上述酶切处理的DNA 8.0 μ 1, Τ4 ligase 1 μ 1，特异性接头14.0 μ 1，无菌水补至20 μ 1， 16°C过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20°C，建立了四个经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库，以其为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSPl和APl 为引物，体系如下10Xbuffer 5 μ 1，dNTPs mixture 1.0 μ 1，GSPl 2.5 μ 1，API 2.5 yl，Taq酶0.2 μ 1，稀释的DNA库0. 1 μ 1，无菌水补至50 μ 1，反应程序如下94°C Imin ； 980C IOs , 720C 2min，共 7 个循环；98°C 10s，68°C 2min，共 33 个循环；72°C lOmin，第二轮PCR以第一轮PCR反应产物50倍稀释液做为模板，以GSP2和AP2为引物进行扩增，反应体系如下10 X buffer 5 μ 1，dNTPs mixture 1. O μ 1，GSP2 2. 5 μ 1，ΑΡ2 2· 5 μ 1，Taq 酶0.2 μ ，稀释模板溶液1.0 μ ，无菌水补至50 μ 1，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并与T载体连接，经测序获得全长序列，为P—”
4.权利要求书1所述的一种分离的启动在根部中的应用。
5.权利要求书1所述的一种分离的启动子在茎部中的应用。
6.权利要求书1所述的一种分离的启动在叶片中的应用。
7.权利要求书1所述的一种分离的启动在花蕾中的应用。
8.权利要求书1所述的一种分离的启动在花药中的应用。
9.权利要求书1所述的一种分离的启动在角果皮中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝型油菜BnPABP2启动子(PBnPABP2)的制备方法及其应用。利用基因组步移方法克隆PBnPABP2序列应用SDS裂解法提取基因组DNA，在不同体系中，分别用核酸内切酶DraI、EcoRⅤ、PvuII和StuI酶切DNA，和接头片断连接后，以其为模板进行第一轮PCR扩增，第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液为模板进行扩增，获得PBnPABP2。PBnPABP2在植物根部、茎部、叶片、花蕾、花药以及角果皮中的应用。该启动子具有驱动外源基因表达的功能，其表达部位在植物的根部、茎部、叶片、花蕾、花药、角果皮中，在油菜食用油安全性和利用转基因提高作物抗病，抗逆性，抗倒伏，提高作物品质方面，人工创建不育系、恢复系，丰富种质资源等方面，该启动子具有应用潜力。
文档编号A01H5/08GK102226181SQ201110122108
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者刘胜毅, 刘越英, 石磊, 董彩华, 黄军艳 申请人:中国农业科学院油料作物研究所