专利名称：三倍体铁皮石斛的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种三倍体铁皮石斛的培育方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl)又称黑节草，它是一种附生、多年生草本兰科植物。主要分布在我国云南、贵州、广西、台湾等地。年平均气温12-18度，相对湿度60-75%，林间透光度60%左右，年降雨量1100-1500mm。生长在常绿阔叶林中，附生于树干上或石灰岩上。野生铁皮石斛种子成活率极低，生长缓慢，从种子萌发到进入商品阶段需5-7年才能采收，造成其产量很少。近年，由于市埸供不应求，人们过度采挖，再加上环境恶化，铁皮石斛自然资源已日趋枯竭。铁皮石斛，加工后俗称铁皮枫斗，为传统名贵中药材，具有增强免疫力、抗肿瘤、滋阴养胃，清热生津、润肺止咳之功效。预测铁皮石斛将成为21世纪高级护嗓保健饮品。近代药理药化研究表明，铁皮石斛药物化学成分主要是多糖类、生物碱和抗肿瘤活性物质。多糖含量达18. 2% -22. 27%，这些多糖类是免疫增强剂，具有增强T细胞及巨噬细胞免疫活性作用。铁皮石斛含有两种抗癌菲类化合物，具有对肝癌和艾氏腹水癌细胞的抑制作用。铁皮石斛滋阴清热生津作用主要与-ATP酶活性有关。国家“十一五”和“十二五”计划均提出“种质资源的挖掘、保存、创新和新品种的定向培育”的任务。为贯彻、落实这项任务，我们提出应用“基因组多倍化与杂交相结合”的方法，可以实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种三倍体铁皮石斛的培育方法，应用“基因组多倍化与杂交相结合”的方法，培育三倍体铁皮石斛，可以实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。它是首先将自然界存在的二倍体铁皮石斛人工诱变成同源四倍体，然后，四倍体铁皮石斛与二倍体杂交，产生三倍体铁皮石斛，即4x早Xh $ — 3x,由此可知，三倍体铁皮石斛是由杂交产生的，具有杂交优势，同时，三倍体是多倍体亦具有多倍体优势，所以，三倍体具有杂交种和多倍体双重优势。同时，形成三倍体后，在“空间上”与其他物种形成了生殖隔离，不能形成后代，没有后代分离，其杂交第一代是永久杂种(可记为永久F1)，固定了杂种优势。因此，三倍体铁皮石斛药材产量和主要药物成分含量方面具有超强的优势，具有重要应用价值。本发明三倍体铁皮石斛的培育方法包括以下步骤1)首先从种质资源中选出优良铁皮石斛品种；2)对选出的优良铁皮石斛进行人工诱变，获得同源四倍体铁皮石斛；3)以四倍体铁皮石斛为母本与二倍体铁皮石斛为父本进行有性杂交，获得三倍体铁皮石斛种子；4)对三倍体铁皮石斛种子进行非共生萌发培养；5)对三倍体铁皮石斛种子原球茎(PLBs)进行诱导与分化培养；
6)三倍体铁皮石斛成苗分化；7)三倍体铁皮石斛瓶苗移栽与按常规铁皮石斛进行成苗栽培管理。本发明提供的一种三倍体铁皮石斛的培育方法包括以下步骤1) 二倍体铁皮石斛按常规方法进行栽培管理，在开花后的5-10天内进行同株异花授粉，授粉后的铁皮石斛植株，放在通风、半透光条件下，保持30-50%湿度，15-20°C温度。2)在人工授粉后120-160天，剪下铁皮石斛蒴果，在超净工作台内用75%酒精消毒1分钟，再用0. 升汞水溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，60次/分振动或静止非共生萌发培养约40-50天，至种子类原球茎(PLBs)发育成球形。3)进行四倍体铁皮石斛人工诱导，将发育成球形的种子原球茎(原胚期)转入含有0. 02%秋水仙碱的1/2MS液体培养基中，诱变处理150-180小时，4)将诱变处理后的铁皮石斛原球茎转入1/2MS固体培养基上继续培养，直至铁皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先进行染色体前处理，然后进行染色体倍性鉴定，选取染色体数目2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍体铁皮石斛；所述的继续培养是在光照下，光周期14小时/天，光强度3000LUX，室温25°C ；所述的染色倍性体鉴定方法按株编号，取幼苗新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理3-4h，然后放入体积比3 1的甲醇与冰醋酸固定液中，4°C冰箱中保存备用；用卡宝品红染色液染色，压片法制备染色体标本；400倍以上显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍体铁皮石斛；5)四倍体铁皮石斛的栽培管理，将加倍成功的铁皮石斛幼苗进行移栽，按常规的铁皮石斛进行栽培管理，直至开花；6)当四倍体铁皮石斛开花后，以人工诱变的同源四倍体铁皮石斛为母本，二倍体铁皮石斛为父本，进行有性杂交，所结的铁皮石斛种子全部为三倍体铁皮石斛，即 4χ 早 Χ2χ 古一3χ ；三倍体铁皮石斛与二倍体铁皮石斛相比，其主要形态性状基本相同，但其茎、叶、 花表现出明显的增大，药材产量与石斛多糖含量显著提高。三倍体具有多倍体和杂交种双重优，其杂交一代是“永久F1”，即永久杂种，固定了杂种优势。7)对三倍体铁皮斛种子进行非共生萌发培养、原球茎诱导、成苗分化、成苗移栽， 按常规铁皮石斛进行栽培管理。本发明提供了一种铁皮石斛新品种的培育方法，特别是铁皮石斛三倍体的培育方法，可以实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。通过基因组三倍化，可以获得具有多倍体和杂交种双重优势的三倍体，其优势表现出具有巨大性和不可替代性，可以大幅度提高铁皮石斛药材产量，同时，三倍体铁皮石斛是永久杂种，可以固定杂种优势。三倍体铁皮石斛具有杂交种和多倍体双重优势。同时，形成三倍体后，在“空间上”与其他物种形成了生殖隔离，不能形成后代，没有后代分离，其杂交第一代是永久杂种(可记为永久F1)， 即固定了杂种优势。因此，三倍体铁皮石斛药材产量和主要药物成分含量方面具有超强的优势，具有重要应用价值。
图1
图2
图3
图4PLBs0
图5
图6
图7
图8
二倍体铁皮石斛亲本，染色体数目为2n = h = 38。 四倍体铁皮石斛亲本，染色体数目为2n =虹=76。 二倍体与四倍体铁皮石斛杂交Fl正、反交果实。
二倍体与四倍体杂交Fl铁皮石斛种子非共生萌发培养，剪头为放大的萌发
三倍体铁皮石斛的成苗分化培养。
三倍体铁皮石斛瓶苗培养，箭头为放大的瓶苗。
三倍体铁皮石斛的倍性鉴定，2η = 3χ = 57。
三倍体铁皮石斛瓶苗移栽前炼苗(a)与移栽后苗床培养(b)。
具体实施例方式本发明突出的特点和显著进步可从下述实例中得以体现，但不会对本发明作任何限制。本发明三倍体铁皮石斛的培育方法包括以下步骤1)首先从种质资源中选出优良二倍体铁皮石斛品种；2)对选出的优良二倍体铁皮石斛进行人工诱变，获得同源四倍体铁皮石斛，参照 ZL200710061225. 8诱导四倍体的方法；3)以四倍体铁皮石斛为母本、二倍体铁皮石斛为父本进行有性杂交，获得三倍体铁皮石斛种子；4)对三倍体铁皮石斛种子进行非共生萌发培养；5)对三倍体铁皮石斛种子原球茎(PLBs)进行诱导与分化培养；6)三倍体铁皮石斛成苗分化诱导培养；
7)三倍体铁皮石斛瓶苗移栽与按常规铁皮石斛进行成苗栽培管理。具体应用实施例2005年4月从云南省文山引入二倍体铁皮石斛Qn = 38)，如图1，于当年5月 20日进行同株异花人工授粉，授粉后的铁皮石斛在25°C，50%自然光照条件下，至2005年 11月22日，剪下蒴果，在超净工作台内，先用75%酒精消毒1分钟，再用0. 升汞消毒10 分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向切开，将铁皮石斛种子接种在1/2MS 液体培养基中，25°C条件下振荡培养，约30天后，转入含有0. 01%秋水仙碱的1/2MS液体培养基中，诱变处理130小时，后转入1/2MS固体培养基上，在光周期14小时/天，光强度 3000LUX，室温25°C条件下继续培养，直至铁皮石斛成苗分化。在瓶苗移栽时，按株分别取新生长的根尖，用压片法制备染色体标本，选取加倍成功的铁皮石斛幼苗On = 76)，进行移栽，按常规铁皮石斛的栽培条件进行栽培管理。2008年5月30日四倍体铁皮石斛第一次开花，如图2。在开花一周以内，以原文山二倍体铁皮石斛为父本，诱变成功的四倍体铁皮石斛为母本，进行人工授粉，至2008年 10月20日将杂交获得的接近成熟的三倍体铁皮石斛蒴果(143天)剪下，如图3，在超净工作台内，先用75 %酒精消毒1分钟，再用0. 1 %升汞消毒10分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向切开，将铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，25°C条件下振荡培养3-4周，转入静置培养，直至种子萌发形成种子原球茎，如图4 ；然后转入1/2MS固体培养基中，在光周期14小时/天，光强度3000LUX，室温25°C条件下进行三倍体铁皮石斛成苗分化培养，如图5 ；接着继续瓶苗培养，如图6 ；在瓶苗生长至瓶口 1/2-2/3高度、叶片3-4片、新根生长旺盛时，打开瓶口进行炼苗，如图8a ；移栽前进行染色体倍性鉴定，如 图7，2n = 57为杂交转育成的三倍体铁皮石斛，可进行瓶苗移栽，如图Sb。
三倍体铁皮石斛成苗栽培管理与一般二倍体铁皮石斛栽培管理条件基本一致，成苗移植按常规的铁皮石斛栽培管理条件，直至开花和药材采收。
权利要求
1.一种三倍体铁皮石斛的培育方法，其特征在于包括以下步骤1)首先从种质资源中选出优良铁皮石斛品种；2)对选出的优良铁皮石斛进行人工诱变，获得同源四倍体铁皮石斛；3)以四倍体铁皮石斛为母本与二倍体铁皮石斛为父本进行有性杂交，获得三倍体铁皮石斛种子；4)对三倍体铁皮石斛种子进行非共生萌发培养；5)对三倍体铁皮石斛种子原球茎(PLBs)进行诱导与分化培养；6)三倍体铁皮石斛成苗分化；7)三倍体铁皮石斛瓶苗移栽与按常规铁皮石斛进行成苗栽培管理。
2.一种三倍体铁皮石斛的培育方法，其特征在于包括以下步骤1)二倍体铁皮石斛按常规方法进行栽培管理，在开花后的5-10天内进行同株异花授粉，授粉后的铁皮石斛植株，放在通风、半透光条件下，保持30-50%湿度、15-20°C温度。2)在人工授粉后120-160天，剪下铁皮石斛蒴果，在超净工作台内用75%酒精消毒1 分钟，再用0. 升汞水溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，50-80转/分，振动或静止非共生萌发培养约40-50天，至种子类原球茎(PLBs)发育成球形；3)进行四倍体铁皮石斛人工诱导，将发育成球形的种子原球茎(原胚期)转入含有 0. 02%秋水仙碱的1/2MS液体培养基中，诱变处理150-180小时，4)将诱变处理后的铁皮石斛原球茎转入1/2MS固体培养基上继续培养，直至铁皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先进行染色体前处理，然后进行染色体倍性鉴定，选取染色体数目2n = 76的幼苗，是加倍成功的同源四倍体铁皮石斛；5)四倍体铁皮石斛的栽培管理，将加倍成功的铁皮石斛幼苗进行移栽，按常规的铁皮石斛进行栽培管理，直至开花；6)当四倍体铁皮石斛开花后，以人工诱变的同源四倍体铁皮石斛为母本，二倍体铁皮石斛为父本，进行有性杂交，所结的铁皮石斛种子全部为三倍体铁皮石斛，即 4χ 早 Χ2χ 古一3χ ；三倍体铁皮石斛与二倍体铁皮石斛相比，其主要形态性状基本相同，但其茎、叶、花表现出明显的增大，药材产量与石斛多糖含量显著提高。三倍体具有多倍体和杂交种双重优， 其杂交一代是“永久F1”，即永久杂种，固定了杂种优势。7)对三倍体铁皮斛种子进行非共生萌发培养、原球茎诱导、成苗分化，成苗移栽，按常规铁皮石斛进行栽培管理。
3.按照权利要求2所述的培育方法，其特征在于步骤4)所述的继续培养是在光照下， 光周期14小时/天，光强度3000LUX，室温25°C。
4.按照权利要求2所述的培育方法，其特征在于步骤4)所述的染色体倍性鉴定方法 按株编号，取幼苗新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理3-4h，然后放入体积比3 1的甲醇与冰醋酸固定液中，4°C冰箱中保存备用；用卡宝品红染色液染色，压片法制备染色体标本；400倍以上显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍体铁皮石斛。
全文摘要
本发明涉及一种三倍体铁皮石斛的培育方法，该方法包括①首先对铁皮石斛种质资源进行广泛收集，从中选出优良铁皮石斛；②对选出的优良铁皮石斛进行人工诱变，获得同源四倍体铁皮石斛；③以四倍体铁皮石斛为母本与二倍体铁皮石斛为父本进行有性杂交，获得三倍体铁皮石斛种子；④对三倍体铁皮石斛种子进行非共生萌发培养；⑤对三倍体铁皮石斛种子原球茎(PLBs)进行诱导与分化培养；⑥三倍体铁皮石斛成苗分化；⑦三倍体铁皮石斛瓶苗移栽；⑧三倍体铁皮石斛成苗栽培管理。本发明通过基因组三倍化，可以获得具有多倍体和杂交种双重优势的三倍体，其优势表现出具有巨大性和不可替代性，可以大幅度提高铁皮石斛药材产量，同时，三倍体铁皮石斛是永久杂种，可以固定杂种优势。
文档编号A01H4/00GK102257964SQ20111017788
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者李秀兰, 陈力, 陈瑞阳 申请人:南开大学