专利名称：一种提高绵羊克隆效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高绵羊克隆效率的方法，尤其是一种通过提高胚胎移植产羔率和成活率以提高克隆效率的方法，属于胚胎移植领域。
背景技术：
目前克隆胚胎移植后的出生率平均不到10%，胎儿异常、流产和围产期死亡率高， 出生后一周的死亡率最高可达 100 % (ffesthusin, Μ. E.，C. R. Long, Τ. Shin. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology, 2001, 55 :35-49)。Wilmut 米用乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞体内培养、胎儿成纤维细胞体外培养，获得的克隆绵羊出生率分别为 3.4%，5. 9%禾口 16. 6% (ffilmut I.，Schnieke A. E. , Mcwhir J.，et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385 :810-813)。对于体细胞核移植克隆绵羊出生率和成活率很低的情况很多文献都有研究，研究大都偏重于体外培养对胚胎基因突变、基因组时空表达引起胎儿生长调节失控和发育异常的影响(Farin P. W. ,Croiser A. E. and Farin C. Ε. Influence of in vitro systems on embryo survival and fetal development in cattle.Theriogenology,2001，55 151-107 ；Thompson J. G. Comparison between in vivo—derived and in vitro—produced preelongation embryos from domestic ruminants. Reprod Fertil Dev 1997 ;9 :341-54)，但因移植，接产，保育工作不到位而导致克隆羊妊娠率和成活率降低的情况不容忽视。由于体细胞核移植克隆绵羊出生率和成活率很低，没有大量的事实作为依据来制定一套切实可行的体细胞核移植克隆绵羊的胚胎移植、接产、保育方案，目前的文献对于体细胞核移植克隆绵羊的胚胎移植、接产、保育工作并没有详尽的描述，特别是出生后羔羊的接产和保育工作更是一大空白，从2007年本实验室出生了中国首例体细胞克隆绵羊至今，一直在进行体细胞核移植克隆绵羊的研究工作，技术水平不断提高，摸索出了一套行之有效的克隆绵羊胚胎移植及接产保育方案。目前，本实验室的克隆绵羊产羔率已从最初的5. 88%，提高到了 31.67%， 成活率达63%，且克隆羊具有正常的繁殖能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高绵羊克隆效率的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为将绵羊早期优质克隆胚胎移植入同期发情母羊体内，术后连续4个情期不返情的母羊视为妊娠母羊，加强妊娠母羊的饲养管理，对过大胎儿进行破腹产手术，对接产后的羔羊严格控制环境温度在21-23°C，及时饲喂健康母羊初乳。具体实施步骤为1、受体母羊的同期处理选取2-4岁营养状况良好的健康经产母羊，放孕酮阴道栓日记为第0天，第8天上午每只羊注射200-250IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，第9天下午每只羊注射1. 0-1. 2ml氯前列烯醇(PG)，第11天上午撤栓，第12-13天试情，每批移植挑选三只同期发情的母羊自然交配作为“奶妈”，其他发情母羊准备作为受体母羊，手术当天空腹，母羊发情当天在实验室进行卵母细胞的成熟。2、克隆胚胎的移植实验室中制备优质体细胞核移植克隆胚胎，经过融合和激活后体外培养发育，胚胎移植时选取激活后24h-7a!卵裂均勻的胚胎，按每只羊10-15枚胚胎分装。将同期发情的母羊保定，术部消毒，在乳房前腹中线(两条乳静脉之间)切开皮肤和皮下组织，钝性分离肌肉，最后打开腹膜，将食指和中指由切口伸入腹腔，在与骨盆交界的前后位置触摸子宫角，找到后用二指夹持，牵出创口外。创口要用被生理盐水浸湿的纱布围住，牵出的子宫角不与外皮接触，循子宫角至该侧输卵管找到卵巢，不可触摸，观察排卵情况，用胚胎移植管按照保持液-空气-胚胎-空气-保持液的方法装管，每段液柱长度不超过0. 5cm,空气柱长度不超过0. 2cm，在排卵侧，沿输卵管伞部开口轻柔的将胚胎移植管插入到输卵管狭部， 将胚胎推入，用手轻柔捋输卵管防止胚胎及保持液倒流，缝合创面，注射80万IU青霉素。手术过程中注意不能破坏卵巢上的血体，切记手术动作要轻柔，术后母羊单独饲养。3、克隆羔羊的接产在术后第3个情期开始试情，加强妊娠母羊的饲养管理，及时将返情母羊从群体中剔出，连续4个情期不返情的母羊视为妊娠母羊，绵羊妊娠期为151-152天，妊娠母羊足月妊娠后，每日观察母羊状态，B超检查胎儿大小，对于体形过大的胎儿，如果母羊出现分娩预兆，立刻准备剖腹产，对于能够顺产的母羊进行辅助生产，对于超过预产期5天的的代孕母羊实施剖腹产手术。触摸怀孕母羊胎盘找到胎儿头部，从胎儿头顶部子宫切口，一只手托举胎儿后臀。另一只手托住胎儿头部取出胎儿。取出胎儿后立刻将胎儿气管中的羊水挤出，剪断并结扎脐带，用消毒纱布清理胎儿口喉中的羊水，用吸痰器清理残留在胎儿鼻腔内的羊水并刺激胎儿呼吸，迅速擦干胎儿体表羊水，同时用碘酒给胎儿脐带消毒，给体弱的羔羊吸氧1小时。剖腹产的母羊缝合后注射80万IU的青霉素，2ml缩宫素，术后连续两天注射青霉素，并人工辅助挤奶以保证乳汁正常分泌。4、克隆羔羊的保育对于克隆羔羊来说，出生后保温很重要，迅速擦干羔羊后将克隆羔羊放在21-23°C 的保育环境里，饲养环境严格消毒，顺产的母羊自然哺育克隆羔羊；对于剖腹产的羔羊，由于母羊术后用药，胎衣一般M小时内脱落，要给克隆羔羊人工辅助哺乳，每隔4小时喂一次同期生产的“奶妈”的初乳，直到代孕母羊可以自然哺乳。一般克隆绵羊的体形都比正常交配生产的羔羊体型大，多数代孕母羊都需要接受剖腹产手术，此时“奶妈”的作用很重要，可以保证克隆羔羊吃到健康的初乳。本发明为克隆绵羊的胚胎移植、接产、保育提供一套科学有效的方法，有效的提高克隆绵羊的妊娠率、出生率和成活率。
具体实施例方式实施例1受体母羊的同期处理选取2-4岁营养状况良好的健康经产母羊，放孕酮阴道栓记为第0天，第8天上午注射孕马血清促性腺激素(PMSG)每只羊注射200-250IU，第9天下午注射氯前列烯醇(PG)每只羊1.0-l.aiil，第11天上午撤栓，第12-13天试情，挑选三只发情的母羊自然交配作为 “奶妈”，其他发情母羊准备作为受体母羊，手术当天空腹，母羊发情当天在实验室进行卵母细胞的成熟。实施例2克隆胚胎的移植实验室中制备优质体细胞核移植克隆胚胎，经过融合和激活后体外培养发育，胚胎移植时选取激活后24h-7a!卵裂均勻的胚胎，按每只羊10-15枚胚胎分装。将同期发情的母羊保定，术部消毒，在乳房前腹中线(两条乳静脉之间)切开皮肤和皮下组织，钝性分离肌肉，最后打开腹膜，将食指和中指由切口伸入腹腔，在与骨盆交界的前后位置触摸子宫角，找到后用二指夹持，牵出创口外。创口要用被生理盐水浸湿的纱布围住，牵出的子宫角不与外皮接触，循子宫角至该侧输卵管找到卵巢，不可触摸，观察排卵情况，用胚胎移植管按照保持液-空气-胚胎-空气-保持液的方法装管，每段液柱长度不超过0. 5cm,空气柱长度不超过0. 2cm，在排卵侧，沿输卵管伞部开口轻柔的将胚胎移植管插入到输卵管狭部， 将胚胎推入，用手轻柔捋输卵管防止胚胎及保持液倒流，缝合创面，注射80万IU青霉素。手术过程中注意不能破坏卵巢上的血体，切记手术动作要轻柔，术后母羊单独饲养。实施例3克隆羔羊的接产在术后第3个情期开始试情，加强妊娠母羊的饲养管理，及时将返情母羊从群体中剔出，连续4个情期不返情的母羊视为妊娠母羊，绵羊妊娠期为151-152天，妊娠母羊足月妊娠后，每日观察母羊状态，B超检查胎儿大小，对于体形过大的胎儿，如果母羊出现分娩预兆，立刻准备剖腹产，对于能够顺产的母羊进行辅助生产，对于超过预产期5天的的代孕母羊实施剖腹产手术。触摸怀孕母羊胎盘找到胎儿头部，从胎儿头顶部子宫切口，一只手托举胎儿后臀。另一只手托住胎儿头部取出胎儿。取出胎儿后立刻将胎儿气管中的羊水挤出，剪断并结扎脐带，用消毒纱布清理胎儿口喉中的羊水，用吸痰器清理残留在胎儿鼻腔内的羊水并刺激胎儿呼吸，迅速擦干胎儿体表羊水，同时用碘酒给胎儿脐带消毒，给体弱的羔羊吸氧1小时。剖腹产的母羊缝合后注射80万IU的青霉素，2ml缩宫素，术后连续两天注射青霉素，并人工辅助挤奶以保证乳汁正常分泌。实施例4克隆羔羊的保育对于克隆羔羊来说，出生后保温很重要，迅速擦干羔羊后将克隆羔羊放在21-23°C 的保育环境里，饲养环境严格消毒，顺产的母羊自然哺育克隆羔羊；对于剖腹产的羔羊，由于母羊术后用药，胎衣一般M小时内脱落，要给克隆羔羊人工辅助哺乳，每隔4小时喂一次同期生产的“奶妈”的初乳，直到代孕母羊可以自然哺乳。一般克隆绵羊的体形都比正常交配生产的羔羊体型大，多数代孕母羊都需要接受剖腹产手术，此时“奶妈”的作用很重要，可以保证克隆羔羊吃到健康的初乳。通过改进实验方案，目前本实验室的克隆羊产羔率从最初的移植17只受体羊，1只妊娠，妊娠率为5. 88 %，产羔羊1只，产羔率为5. 88 %，到现在移植60只受体羊，妊娠18只，妊娠率为30 %，产羔19只，产羔率为31.67%。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案范围内。
权利要求
1.一种提高绵羊克隆效率的方法，其特征在于包括如下步骤1)激素处理使受体母羊发情；2)将优质绵羊克隆胚胎移植入激素处理过的同期发情母羊；3)术后连续4个情期不返情的母羊视为妊娠母羊，加强妊娠母羊的饲养管理；4)对超过预产期5天和胎儿体形过大的代孕母羊实施剖腹产手术，对接产后的羔羊严格控制保育温度，饲喂健康母羊的初乳。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述克隆胚胎为移植激活后M-72小时胚龄的卵裂均勻胚胎，胚胎移植数量保证在10-15枚。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)所述环境温度为21-23°C。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述的激素为孕酮、孕马血清促性腺激素及氯前列烯醇。
5.权利要求1或5所述的方法，其特征在于步骤1)所述的激素处理的方法为选取2-4 岁营养状况良好的健康经产母羊，放孕酮阴道栓记为第0天，第8天上午注射孕马血清促性腺激素(PMSG)每只羊注射200-250IU，第9天下午注射氯前列烯醇(PG)每只羊1. 0-1. 2ml, 第11天上午撤栓，第12-13天试情，挑选三只发情的母羊自然交配作为“奶妈”，其他发情母羊准备作为受体母羊，手术当天空腹，母羊发情当天在实验室进行卵母细胞的成熟。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)所述保育方法为羔羊出生后迅速擦干体表，将克隆羔羊放在21-23°C的保育环境里，顺产的母羊自然哺育克隆羔羊，对于剖腹产的羔羊，由于母羊术后用药，胎衣一般M小时内脱落，为避免药物对羔羊的影响要给克隆羔羊人工辅助哺乳，每隔4小时喂一次同期生产的“奶妈”的初乳，直到代孕母羊可以自然哺乳。
全文摘要
本发明公开了一种通过提高胚胎移植产羔率和成活率以提高克隆效率的方法，属于胚胎移植的方法领域。本发明将移植激活后24-72小时胚龄的卵裂均匀的胚胎移植入同期发情母羊体内，每只羊移植10-15枚胚胎，对术后连续4个情期不返情的母羊进行妊娠管理，对超过预产期5天和胎儿体形过大的代孕母羊实施剖腹产手术，接产后的羔羊严格控制保育环境温度在21-23℃，饲喂健康母羊初乳。采用本发明提供的方法，能显著提高克隆绵羊的妊娠率、产羔率及羔羊成活率，严格参照本发明操作后，克隆绵羊的妊娠率达30％，产羔率达31.67％，成活率达63％，本发明公开的一种提高绵羊克隆效率的方法，具有广阔的应用前景。
文档编号A61D19/02GK102318581SQ20111025592
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者刘羿羿, 周欢敏, 张东 申请人:内蒙古农业大学