专利名称：一种奶牛再克隆的方法
技术领域：
本发明属于胚胎生物工程领域，特别是一种奶牛再克隆的方法。
背景技术：
克隆绵羊Dolly的诞生，动物克隆从此进入体细胞克隆时代。紧随Dolly羊之后，许多实验室开展体细胞克隆研究，各种克隆动物相继问世(Baguisi，1999；Wakayama，1998；Kao，1998；Onishi，2000；Shin，2002；Chense，2002；Galli，2003；Woods，2003)。通过体细胞克隆技术，人们可以获得无数同质个体，克服了胚胎细胞克隆只能达到有限个体的缺点。目前该技术除了在动物保种繁衍方面的应用之外，已在转基因方面、胚胎干细胞方面得到了应用，已显示出诱人的应用前景。
体细胞克隆技术是动物保种重要方法之一。通过体细胞克隆技术进行保种，可以把一个动物的体细胞变成一只动物。如果要保存一个物种，就可以先拟定出保持遗传稳定性的动物个体数，然后在每一头动物身上采集成千上万细胞，进行永久性保存，若需重现一个动物物种或品种时，只需进行同种或异种克隆，就可以获得这种动物。一个动物的体细胞可以保存在一个小管内，一个品种或一个物种就可以保存在一个小盒内，我国的动物物种也许可以装在一间大房里，这样就可以建立一个名副其实的基因库。Comizzoli等(2000)认为体细胞核移植也为拯救珍稀濒危动物开辟了一条新的途径。1998年新西兰的Wells等(1999)利用这一技术成功地克隆了当地一头濒临灭种土种牛2000年美国的Lanza等(2000)通过种间核移植的方法用家牛的卵母细胞获得了种间核移植胚胎，移植到家牛后获得了妊娠并生出了后代；1999我国陈大元等用兔卵母细胞获得了种间核移植的大熊猫胚胎，这些结果表明通过体细胞核移植方法增加濒危动物的数量是可行的，通过种间核移植方法保护珍稀动物可能在不久的将来会有突破性的进展。
体细胞克隆技术还处于研究阶段，体细胞克隆还存在一些问题1)结果不稳定，效率低 目前，克隆绵羊只有3％左右的重组胚能发育为正常后代。在克隆牛的研究过程中，根据kato等的结果，重组胚的囊胚发育率最高能达到49％，约有80％的移植胚能发育为正常胎儿，但胎儿出生后的死亡率达到50％。Cibelli等在克隆牛的生产过程中，重组胚的囊胚率仅为17％，移植后只有14％的囊胚发育正常后代。克隆小鼠仅在夏威夷大学医学院获得成功，只有2％-3％的重构胚能发育产仔，仔鼠死亡率也高达40％o以上结果表明体细胞克隆技术仅处于初步研究阶段，还需要在其他动物上进一步研究，提高生产效率。
2)后代死亡率高 胎儿出生后的高死亡率也是体细胞克隆面临的问题之一，出现这一现象的原因还不清楚。目前只能从优化培养条件及操作程序入手以减少胎儿死亡率。
3)用其它体细胞作供体的探索 目前，用于体细胞克隆的供体细胞种类很有限，其它细胞通过核移植能否成功有待进一步探讨。
4)细胞质遗传问题在小鼠和牛的克隆研究中，人们发现细胞质的遗传物质影响克隆后代的表型，如花斑、毛色等，这是由供体细胞线粒体DNA，还是由卵子细胞质中的遗传物质引起还不清楚。细胞质中的遗传物质对克隆后代的其它性状是否产生影响还需要进一步探讨.随着克隆技术的发展，细胞质中遗传物质的作用会越来越引起人们的重视。
5)供体细胞的保存和细胞周期的影响 体细胞克隆的最大优势之一是供体细胞可培养传代及冷冻保存。但在传代及冷冻过程中，细胞核中遗传物质的损伤及变异势必影响克隆胚胎的发育。同时，供体细胞周期直接影响克隆效率，但对这些问题目前知之甚少，急需加以研究。
用克隆动物的体细胞再次进行克隆，称为再克隆。在理论上，通过克隆和再克隆，可获得无限多的克隆动物。再克隆技术与克隆技术基本原理是一致的，但再克隆技术进一步放大克隆效果，延伸克隆的内涵，进行再克隆研究将有助于解决上述问题。
发明内容
本发明针对上述领域中的缺陷，提供一种奶牛的再克隆方法，使克隆效果再次放大，是提高克隆效率的有效方法之一。
一种奶牛的再克隆方法，包括供体细胞和受体卵母细胞培养，核移植、融合与激活，重构胚的培养和重构胚移植，其特征在于所述受体细胞的培养液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/ml EGF(Epidermal GrowthFactor)；供体细胞的培养液中添加有1LDMEM(干粉)+2.75g NaHCO3+10％FCS+1mmol/LNa-Pyruvate+1mmol/ml L-Glutamine+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.1mmol/Lβ-Mercaptoethanol+10ng/ml EGF。
所述重构胚的培养采用分三阶段培养，所述第一阶段的培养液为CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin，培育时间0-2天；所述第二阶段的培养液第一阶段培养液和单层颗粒细胞，培育时间2-5天；第三阶段的培养液第二阶段培养液加入葡萄糖，其浓度为1mg/ml，培养时间5-9天。
所述激活采用A23187、CHX和CD联合激活，激活时间在卵母细胞成熟后25小时进行激活处理。
所述激活处理分三步进行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA，在38.5℃处理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX+3μg/ml CD处理1小时；3.在含10μg/ml CHX的CR1-aa中继续培养4小时。
所述重构胚移植到比它晚一天发情受体牛的子宫内。
本发明一种奶牛的再克隆方法，供体核是第一代克隆牛的体细胞。再克隆技术的步骤与克隆技术的步骤相同，本发明为提高克隆效率，首先优化了供体细胞和受体细胞的培养条件，添加了一些有效成分，如Cysteine、L-Glutamine、EGF(Epidermal Growth Factor)和β-Mercaptoethanol等。这些成分都能促进细胞生长发育，可提高细胞质成熟度，增强细胞活力，进而增强重构胚的生命力，有助于提高克隆胚胎妊娠率，降低胎儿的出生死亡率。这些有效成分对细胞具体作用如下Cysteine是构成GSH(谷胱苷肽)的重要成分，GSH可通过氧化-还原作用使卵母细胞免受氧化损失，同时可以清除卵母细胞内的自由基，提高卵母细胞整体发育水平。GSH的代谢途径使胞质成熟过程的重要组成部分，不但能促进卵母细胞成熟，对早期胚胎发育也有促进作用。
添加L-Glutamine能促进各种氨基酸进入细胞膜，它所含的氨基是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，也是能量和碳的来源，可见卵母细胞需要L-Glutamine赖以合成核酸和蛋白质，促进胚胎生长和分裂。
EGF是一种多肽的生长因子。可以大大改善细胞发育环境，促进细胞的核、质成熟。
β-Mercaptoethanol也能促进细胞内GSH的合成，提高细胞发育潜力和耐受力，防止细胞氧化凋亡。
针对重构胚在不同发育阶段对营养需要以及自身特点，采用分阶段培养方法来调整其培养液营养成分，这样更有利于重构胚的生长发育，同时可提高囊胚的发育率。在第二阶段加入颗粒细胞共培养。与颗粒细胞共培养有助于克服胚胎体外发育阻断，因为颗粒细胞能分泌多肽和糖蛋白，起着促有丝分裂刺激因子作用，促进胚胎分裂活动，有效地克服牛胚胎8-16细胞的阻滞，所以在培养后第2天进行了共培养。随着胚胎发育，后期代谢越来越旺盛，需要更多能量，葡萄糖是最易被胚胎吸收的能量物质，添加葡萄糖能及时补充胚胎发育所需能量。所以在第三阶段的培养液是在第二阶段的基础上再添加葡萄糖。
本发明采用A23187、CHX和CD联合激活，激活时间为卵母细胞成熟后25小时(卵母细胞开始成熟为0小时)，多数文献记载的第一次克隆激活时间采用24小时，本发明激活延迟1小时，这样增加供体核暴露在受体卵母胞质的时间，可以使供核与胞质充分相互作用，有助于修正第一次克隆造成核编程的错误，所以激活比第一次克隆推迟1小时。
由于再克隆胚胎体外生长发育动力学与自然怀孕母牛胚胎的不一致，往往表现为发育迟缓，为了使受体子宫内膜的发育与供体克隆胚胎发育时期相适应，同时给移植到子宫内再克隆胚胎一段恢复时间，选用比供体胚胎晚一些发情受体牛，二者方能同步正常发育。经过实验证明，再克隆7天的囊胚移入发情6天的受体牛子宫内更为合适。
本发明得到282个重构胚，发育得到76个囊胚，移植28个囊胚，发育得到2头再克隆奶牛，出生的再克隆牛外表和各项生理指标都正常，经DNA微卫星分析结果表明，两头再克隆奶牛基因型与克隆奶牛的完全相同。
总之，按照本发明的奶牛再克隆方法，成功获得再克隆个体，出生死亡率为零，产犊率与第一次克隆基本一致，从整个操作程序来看，本方法应该同样适用奶牛的第一次克隆。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例11.主要仪器设备、药品显微操作仪、电融仪、拉针和磨针仪、CO2培养箱、恒温台、视体显微镜、水浴锅、恒温箱、超净台。
所涉及的到的药品及试剂均为市售产品。
2.牛群根据实验的要求，建立一个受体牛群，出生一头克隆牛约需20头受体牛。
3.供体细胞的准备从克隆的荷斯坦奶牛牛耳部剪下一小块组织后，用装有0.9％生理盐水的保温瓶带回实验室。在超净台内剪下的耳组织，洗涤3次，剪碎、去软骨，加适量0.25％的胰酶混匀后转移到培养瓶中4℃冷消化，18-20小时后在37℃热消化40分钟，消化好后，加入培养液1L DMEM(干粉)+2.75g NaHCO3+10％FCS(Fetal Calf Serum)+1mmol/L Na-Pyruvate+1mmol/mlL-Glutamine+0.0625gPenicillium+0.05gStreptomycin+0.1mmol/Lβ-Mercaptoethanol+10ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。当细胞贴壁长满后，进行传代。将两代以前的细胞冷冻保存。
根据实验的设计，在用前48小时解冻培养，用0.25％的胰酶37℃消化传代或收集，收集起来的细胞，用移液器反复吹打，使细胞以单个悬浮，用于核移植。
4.卵母细胞的成熟从屠宰场收集卵巢。用加有双抗25℃生理盐水，在3小时之内运至实验室。用注射器抽取卵巢上2-7mm大的卵泡，在体视解剖镜下挑选包有完整颗粒细胞的卵母细胞(COCs)用于成熟培养。成熟培养液是由M199+10％FCS(Fetal Calf Serum)+10μg/mlFSH(Follicle-stimulating Hormone)+1μg/ml LH(Luteinizining Hormone)+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor)构成，在38.5℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养18小时。用0.2％Hyaluronidase脱去颗粒细胞，在体视显微镜下选择有第一极体的、胞质均匀一致的卵母细胞，置于含有10％血清的Hepes-199液中待用。
5.核移植卵母细胞的去核采用盲吸法。将20枚脱去颗粒细胞的成熟卵母细胞放入操作液滴的一端，操作液滴由Hepes-199，10％血清和7.5ug/ml Cytochalasin B组成，在室温中预处理5分钟后，用持卵针吸住一枚卵母细胞，调整极体的位置，使其第一极体位于时钟2点的位置。用去核针将第一极体及其下部1/4-1/3物质吸出，然后用去核针吸一个直径为15-20μm的成纤维细胞，并从同一个切口注入到透明带下，并使供体细胞膜与卵膜紧密接触。
6.融合和激活用BTX ECM-2001(BTX，San Diego，USA)型细胞电融合仪进行融合，融合液为0.28MMannitol+0.05mM CaCL2.2H2O+0.1mM MgCL2.6H2O+0.5mM Hepes+5mg/ml BSA(BovineSerum Albumin)。将卵母细胞和体细胞的复合体在电融合液中平衡2min，然后移入充满电融合液两电极间，用细玻璃针拨动使体细胞与受体的接触面与电极丝平行，以两次1.3kv/cm、10μs直流电脉冲诱导融合，融合操作后0.5h观察融合的情况。
所有融合再克隆胚胎在成熟后25h左右进行激活处理(第一次克隆是在成熟后24小时进行激活处理，卵母细胞开始成熟培养为0h)。激活处理分三步进行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)，在38.5℃处理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX(Cycloheximide)+3μg/ml CD(Cytochalasin D)处理1小时；3.在含10μg/ml CHX(Cycloheximide)的CR1-aa中继续培养4小时。
7.共培养颗粒细胞单层的制备用细的玻璃管将成熟液滴中的成熟卵母细胞吸出，将部分颗粒细胞留下，然后换入胚胎发育液[CR1+1％NEAA(Non-essential Amino Acids)+1％EAA(Essential Amino Acids)+1mmol/mlGlutamine+4mg/ml FAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)]，不久就形成颗粒细胞层，每2天换液一次，这是重构胚的第二阶段的共培养液滴。
8.重构胚发育第一阶段(0-2天)重构胚在发育液CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin中培养发育。第二阶段(2-5天)将发育2天的重构胚移入共培养的液滴(CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin和颗粒细胞层)中。第三阶段(5-9天)在第5天胚胎的培养液内加入葡萄糖，其浓度为1mg/ml。每2天换液一次，第6天后记录桑椹胚和囊胚的数量，并进行统计分析。
9.胚胎移植将1枚形态良好的囊胚移入比它晚一天的发情受体牛子宫内(比如，第7天的囊胚移植到发情第6天受体牛子宫内)2个月后，通过B-超和确定怀孕情况。如果没有合适发情受体牛，将重构胚冷冻保存，以后在移植。
10.再克隆犊牛出生在妊娠期间，用B-超观察胎儿发育情况，在临产前发现胎儿过大或胎位不正，进行剖腹产，如果胎儿发育正常让它自然分娩。
本发明得到282个重构胚，发育得到76个囊胚，囊胚率为26.9％(76/282)；移植28个囊胚，得到2头再克隆奶牛，产犊率为7.1％(2/28)，出生的再克隆牛外型和各项生理指标都正常。本发明方法的囊胚率和出生率都得到了提高，以致克隆效率获得很大提高。
DNA微卫星分析结果表明，两头再克隆奶牛基因型与克隆奶牛的完全相同，表明本发明奶牛的再克隆方法是可行的。
权利要求
1.一种奶牛的再克隆方法，包括供体细胞培养、受体卵母细胞培养，核移植、融合与激活，重构胚的培养和重构胚移植，其特征在于所述受体卵母细胞的培养液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/ml EGF；供体细胞的培养液中添加有1LDMEM干粉+2.75g NaHCO3+10％FCS+1mmol/L Na-Pyruvate+1mmol/mlL-Glutamine+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.1mmol/L β-Mercaptoethanol+10ng/ml EGF。
2.根据权利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述重构胚的培养采用分三阶段培养，所述第一阶段的培养液为CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/mlFAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin，培育时间0-2天；所述第二阶段的培养液第一阶段培养液和单层颗粒细胞，培育时间2-5天；第三阶段的培养液第二阶段培养液加入葡萄糖，葡萄糖浓度为1mg/ml，培养时间5-9天。
3.根据权利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述激活采用A23187、CHX和CD联合激活，激活时间在卵母细胞成熟后25小时进行激活处理。
4.根据权利要求3所述的奶牛的再克隆方法，所述激活处理分三步进行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA，在38.5℃处理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX+3μg/ml CD处理1小时；3.在含10μg/ml CHX的CR1-aa中继续培养4小时。
5.根据权利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述重构胚移植到比它晚一天发情受体牛的子宫内。
全文摘要
本发明涉及“一种奶牛的再克隆方法”包括供体细胞和受体卵母细胞培养，核移植、融合与激活，重构胚的培养和重构胚移植，其特征在于所述受体细胞的培养液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L－Glutamine+10ng/ml EGF(Epidermal GrowthFactor)；供体细胞的培养液中添加有1L DMEM(干粉)+2.75g NaHCO
文档编号A61D19/00GK101050458SQ20071006476
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月26日 优先权日2007年3月26日
发明者张家新, 王海, 张向利, 赵孟彬, 张红霞, 郭丽丽, 安晶, 王月, 郭敏 申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司