专利名称：蓖麻杂交种csr24.181种子纯度的检测方法
技术领域：
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法。
背景技术：
蓖麻(Ricinus communist L)为大戟科蓖麻属一年或多年生植物,是重要的工业油源作物，具有“绿色能源”油料作物之称。蓖麻油因具有凝固点低、耐高温等独一无二的化学特性，而广泛应用于航空和精密仪器作高级润滑油、刹车油和防护油，以及涂料、增塑齐U、尼龙系列、聚氨酯、香料、化妆品等生产及生物柴油的炼制，目前利用蓖麻油生成化学衍生物已达175种，系列产品达2000多项。国内外生产对蓖麻原料的需求呈上升趋势，市场原料紧张，供需缺口在一半以上。在蓖麻开发产品逐年增多、原料紧张、油籽价格不断上升的情况下，农民却因购买的品种种子纯度不高，单产产量低而种植积极性不高，种植面积十分不稳。优良品种是作物高产的基础，品种混杂和纯度降低则会明显降低产量。快速准确地鉴定品种和进行纯度分析对于品种审定、种子质量标准化、假种辨别均有重要作用，是种子质量和良好信誉的重要保证。目前蓖麻生产上杂交制种主要采用“一系两用”两系法制种,通过生长季节拔除母本行两性株去杂来生产杂交种子,但由于蓖麻单雌性状表现的复杂性，在识别单雌株和两性株上还有一定难度，稍有不慎，易导致杂交种纯度不够，影响蓖麻种植的产量和效益。因此，对蓖麻杂交种进行快速、准确而高效的纯度鉴定，对蓖麻杂交种的推广应用具有重要意义。采用田间表型性状的常规鉴定方法，耗时耗力，成本高，周期长，速度慢，受环境影响大。利用分子标记技术进行蓖麻杂交种种子纯度鉴定，能从DNA分子水平上提供最直接的证据，鉴定速度快，环境影响小，具有直观、准确、便捷、易行的特点，能有效解决长期以来蓖麻杂交种混杂难辨，纯度难以判断的问题，可提高育种利用的效率。CSR24. 181是法国阿图公司利用隐性单基因控制的单雌蓖麻采用“两用系法”杂交制种育成的蓖麻杂交种，在我国有一定的种植面积。为保证该优良品种的制种纯度，为农户提供质量可靠的种子，需要一种准确、稳定、可靠的检测方法对其商品种子的真伪及其纯度进行早期的快速鉴定。目前，通过分子标记技术进行蓖麻杂交种种子纯度检测的方法在蓖麻育种领域未见报道。
发明内容
鉴于田间表型性状的常规检测方法耗时耗力、成本高、周期长、速度慢，尤其是蓖麻杂交制种易混杂的问题，本发明的目的在于提供一种蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法，该检测方法具有快速直观、便捷易行、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，可弥补传统常规纯度检测工作的不足，为蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子真伪鉴别和纯度的快速鉴定提供有效的质量保障。本发明的目的是这样实现的蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法，包括以下步骤
(1)提取蓖麻杂交种种子幼苗叶片基因组DNA；
(2)以所述的基因组DNA为模板，选用SSR引物对进行PCR扩增，所述的SSR引物序列选自如下的ー种或多种
引物Rco23
FCATGGATGTAGAGGGTCGAT RCAGCCAAGCCAAAGATTTTC引物Rco26
F TTGCTTGTCAAAGGGGAGTT
RTCATTTTGAGGGAGAAACCA引物Rco29
FGGAGAAAAGAAAGGGAGAAGG
RGCCAAAAGCACACTTAATTTGA引物RC05
F CATCACCTCTATCCATCCGTTT
R CCTTCATCATTGAACTCCCTTC引物RC61
F GCACTGAGGGTTAATTCTGGAC
R GTCGTAGACCACCTTAGCATCC引物RC129
FTACTGCAACTCAATCCACTGCT
RGATAGTGCCTTTGCCTCTTTTC引物RC242
F ACCCCTGCAAAACCCTAATAAT
R TTCGGTGTAAAGAATCCGACTT
(3)对扩增产物进行凝胶电泳；
(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24.181”杂交种，检测得到的纯度结果的平均值即为其品种种子的纯度；其中
引物Rco23产生条带大小分别为440bp和600bp的母本特异标记Rco2344(l和Rco23_，产生条带大小分别为400bp和580bp的父本特异标记Rco234qq和Rco2358(l ；
引物Rco26产生条带大小为700bp的母本特异标记Rco267(i(i，产生条带大小为705bp的父本特异标记Rco267(i5 ；
引物Rco29产生条带大小为560bp的母本特异标记Rco2956(l，产生条带大小为580bp的父本特异标记Rco2958(i ；
引物RC05产生条带大小分别为330bp和570bp的母本特异标记RC0533(I和RC0557(I，产生条带大小分别为360bp和600bp的父本特异标记RC05·和RC05_ ；
引物RC61产生条带大小为220bp的母本特异标记RC6122(I，产生条带大小为210bp的父本特异标记RC6121tl ；
引物RC129产生条带大小为695bp的母本特异标记RC12 9695，产生条带大小为690bp的父本特异标记RC12969Q ； 引物RC242产生条带大小为680bp的母本特异标记RC242_，产生条带大小分别为685bp 和 690bp 的父本特异标记 RC242685 和 RC24269(I。所述的蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法，其中步骤(I)可以按如下方法操作取“CSR24. 181”杂交制种所得Fl种子，在室内采用沙床25°C条件下培育7_10天，长出2-3片嫩叶时，取其新鮮幼叶，按以下方法进行基因组DNA提取取1-2片拇指盖大小的新鲜蓖麻嫩叶装入2. Oml离心管中，加液氮磨成粉末状后，加入700ul CTAB提取液，充分摇匀，65°C水浴45-60 min，中途轻轻摇匀两次；加入700ul氯仿异戊醇(24:1 )，充分摇匀后10000r/min离心5_10min取上清液，可重复1_2次；加入1/10体积的3M pH 5. 2的NaAC和等体积冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于_20°C冰箱冷冻静置30min，10000r/min离心3min ;弃上清，将所得沉淀用70%的こ醇浸泡洗涤，中途换洗2_3次，风干后充分溶于200ulTE缓冲液，每管加入2. 5 ul浓度为10mg/ml的RNase A，37°C水浴6小时或过夜；取少量DNA原液在紫外分光光度计或DNA浓度测量仪上进行浓度及质量检测，其余的保存于_20°C冰箱备用；所述的 CTAB 提取液为100mM Tris-HCl, pH 8. 0,50mM EDTA-Na2,1. 4M NaCl,2%(ΤΑΒ，2%β -巯基こ醇，2% PVP ;所述的 TE 缓冲液为10mM Tris-HCl pH 8. O, ImM EDTA-Na2pH 8. O0所述的蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法，其中步骤(2)可以按如下方法操作Rco23、Rco26和Rco29引物的PCR扩增反应体系为25ul，包括DNA 50ng，I倍Buffer 缓冲液，dNTPsl50uM, Mg2+ I. 5Mm,正、反向引物各 O. 8uM, Taq DNA 聚合酶 IUnit ;扩增反应在PCR基因扩增仪上进行，扩增程序为94°C Imin ；94°C lmin，62°C或60°C lmin,72°C lmin，35 个循环；72°C 10 min。引物 RC05、RC61、RC129 和 RC242 的 PCR 扩增反应体系为 20ul，包括 DNA 20ng，I 倍 Buffer 缓冲液，dNTPs 100uM,Mg2+ 2mM，正、反向引物各 O. 2uM，Taq DNA聚合酶 IUnit ;扩增程序为％°C 3min ；94°C 30 sec, 65°C 30 sec (_1°C/cycle)，72°C 45 86(，10个循环；94で 30 sec, 55°C 30 sec (-1°C /cycle) ,72°C 45 sec，3O 个循环；72°C 10 min。所述的蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法，其中步骤(3)可以按如下方法操作所述扩增产物在双垂直板6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，50W恒定功率电泳60-90min，电泳结束后凝胶用蒸馏水稍冲洗后，银染15min，漂洗3_5 sec，显色液(2. 0%Na0H,O. 4%甲醛，O. 04%Na2C03)显色，漂洗后在可见灯箱下观察拍照。与现有技术相比，本发明涉及的蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法具有如下优点和显著进步
(I)本发明从所用的大量引物中筛选出能够在一代杂种中同时产生父、母本特异标记条带，带型清晰、重复性好、可靠性强的引物RC023、RC026、RC029、RC05、RC61、RC129和RC242，作为蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子真伪和纯度鉴定的特征引物。本鉴定方法所筛选的引物均能鉴定出具有父母本特异性条带(见附图1-7)。7对SSR引物在多次重复中表现稳定，可有效用于鉴别蓖麻杂交种种子的真伪和纯度，有利于蓖麻商品种子快速高效的质量控制，加快了蓖麻商品种子的质量检测进程。(2)利用本发明的方法检测蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子的纯度，具有速度快、省时省エ、简便、易行，鉴定准确性高，结果稳定，不受环境条件及发育时期影响的优点，可快速、准确地检测蓖麻品种种子的真伪。
图I为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物Rco23的PCR电泳图谱。L 为 50bp DNA Ladder ;M 为“0 24. 181” 母本 “CSR24” ;F 为“0 24. 181” 父本 “CSR181 ” ；其中数字1-58分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、8、13、32、37、43、54、56和58单株 为真杂种。图2为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物Rco26的PCR电泳图谱。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中数字1-58分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、8、13、32、37、43、54、56和58单株为真杂种。图3为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物Rco29的PCR电泳图谱。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中数字1-58分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、7、8、13、32、37、43、54、55、56和58单株为真杂种。图4为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物RC05的PCR电泳图谱。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中数字1-57分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、7、8、11、13、32、37、43、54、55和56单株为真杂种。图5为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物RC61的PCR电泳图谱。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中数字1-57分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、8、11、13、27、32、37、43、54和56单株为真杂种。图6为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物RC129的PCR电泳图谱。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中数字1-57分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、43和56单株为真杂种。图7为蓖麻“CSR24. 181”杂交制种F1种子检测特征引物RC242的PCR电泳图谱。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中数字1-58分别表示“CSR24. 181”杂交制种F1种子的单株，箭头分别代表亲本间的特异标记，同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24. 181”杂交种，如图中4、5、6、7、8、11、13、32、37、43、54、55、56 和 58 单株为真杂种。
具体实施例方式下面通过实施例进ー步说明本发明。本发明实施例的检测方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。本实施例的实验材料为蓖麻“CSR24. 181”的杂交制种F1种子及其亲本材料种子。在室内采用沙床25°C条件下培育7-10 天，取其新鲜嫩叶。本实施例的方法提取蓖麻嫩叶基因组DNA，采用SSR分子标记进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，统计结果并筛选特征引物。1、蓖麻基因组DNA提取
取1-2片拇指盖大小的新鲜蓖麻嫩叶装入2. Oml离心管中，加液氮磨成粉末状后，加入700ul CTAB提取液(IOOmM Tris-HCl,pH 8. 0,50mM EDTA-Na2,1. 4M NaCl，2% (ΤΑΒ，2%β-巯基こ醇，2% PVP)充分摇匀，65°C水浴45-60 min,中途轻轻摇匀两次；加入700ul氯仿异戊醇(24:1)，充分摇匀后10000r/min离心5-10min取上清液，可重复ト2次;加入1/10体积的3M NaAC (pH 5. 2)和等体积冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于_20°C冰箱冷冻静置30min，10000r/min离心3min ;弃上清,将所得沉淀用70%的こ醇浸泡洗漆，中途换洗2_3次,风干后充分溶于 200ul TE缓冲液(IOmM Tris-HCl pH 8. O, ImM EDTA-Na2 pH 8.0)，每管加入 2. 5ul RNase A (10mg/ml), 37°C水浴6小时或过夜；取少量DNA原液在紫外分光光度计或DNA浓度测量仪上进行浓度及质量检测，其余的保存于_20°C冰箱备用。2、PCR扩增及分子标记分析
Rco23、Rco26和Rco29引物的反应体系为25ul，包括DNA 50ng, I倍Buffer缓冲液，dNTPs 150uM, Mg2+ I. 5Mm，正、反向引物各O. 8uM，Taq DNA聚合酶lUnit。扩增反应在PCR基因扩增仪上进行，扩增程序为94°C lmin ；94°C lmin，62°C或 60°C lmin,72°C lmin，35 个循环；72°C 10 min。另外4对引物(RC05、RC61、RC129和RC242)的反应体系为20ul，其中 DNA 20ng，I 倍 Buffer 缓冲液，dNTPs IOOuM, Mg2+ 2mM，正、反向引物各 O. 2uM，Taq DNA聚合酶 lUnit。扩增程序为％°C 3min ；94°C 30 sec,65°C 30 sec (-1°C /cycle), 72°C45 sec，10 个循环；94°C 30 sec, 55°C 30 sec (-1°C /cycle) ,72°C 45 sec，3O 个循环；72°C 10 min。扩增产物在双垂直板6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，50W恒定功率电泳60-90min。电泳结束后，将两块玻璃板分离开来，将粘胶板用双蒸水漂洗3_5秒；稍浙干，放入银染液(AgNO3 lg/L,0. 056%甲醒,共2L,可重复利用)中染色15min ;染色过程中配显色液(2. 0%Na0H，0. 4%甲醛，O. 04%Na2C03，可重复使用，重复使用时加l_2ml甲醛，天气太冷时可适当加热显色液，以便快速显色)，染色将结束时，把显色液倒入显色盒中备用；染色結束后，双蒸水漂洗3-5秒；显色盒中显色，待条带清晰可见吋，终止显色，再用蒸馏水漂洗；最后在可见灯箱下观察拍照。3、筛选纯度鉴定的特征引物
从所用的引物中筛选出具有父、母本特征带、能够在一代杂种中同时产生父、母本特异标记条带，且带型清晰、重复性好、可靠性强的引物7对，分别为RCO23、RCO26、RCO29、RC05、RC61、RC129和RC242，可作为蓖麻杂交种“CRS24. 181”种子真实性和/或品种纯度鉴定的特征引物(见附图1-7)。7对引物序列为
引物Rco23
FCATGGATGTAGAGGGTCGATRCAGCCAAGCCAAAGATTTTC引物Rco26
F TTGCTTGTCAAAGGGGAGTT
RTCATTTTGAGGGAGAAACCA引物Rco29
FGGAGAAAAGAAAGGGAGAAGG
RGCCAAAAGCACACTTAATTTGA引物RC05
FCATCACCTCTATCCATCCGTTT
RCCTTCATCATTGAACTCCCTTC引物RC61
F GCACTGAGGGTTAATTCTGGAC
R GTCGTAGACCACCTTAGCATCC引物RC129
FTACTGCAACTCAATCCACTGCT
RGATAGTGCCTTTGCCTCTTTTC引物RC242
F ACCCCTGCAAAACCCTAATAAT
R TTCGGTGTAAAGAATCCGACTT
其中
引物Rco23产生条带大小分别为440bp和600bp的母本特异标记Rco2344(l和Rco23_，产生条带大小分别为400bp和580bp的父本特异标记Rco234qq和Rco2358(l ；
引物Rco26产生条带大小为700bp的母本特异标记Rco26■，产生条带大小为705bp的父本特异标记Rco267(i5 ；
引物Rco29产生条带大小为560bp的母本特异标记Rco2956(l，产生条带大小为580bp的父本特异标记Rco2958(i ；
引物RC05产生条带大小分别为330bp和570bp的母本特异标记RC0533(I和RC0557(I，产生条带大小分别为360bp和600bp的父本特异标记RC0536(i和RC05_ ；
引物RC61产生条带大小为220bp的母本特异标记RC6122(I，产生条带大小为210bp的父本特异标记RC6121tl ；
引物RC129产生条带大小为695bp的母本特异标记RC12 9695，产生条带大小为690bp的父本特异标记RC12969Q ；
引物RC242产生条带大小为680bp的母本特异标记RC242_，产生条带大小分别为685bp 和 690bp 的父本特异标记 RC242685 和 RC24269(I。
4、利用特征引物对种子进行遗传纯度鉴定
应用筛选到的特征引物，对杂交种“ CSR24. 181 ”进行纯度鉴定，步骤为DNA提取，PCR扩增分析，扩增产物的凝胶电泳，结果分析及统计。具体操作步骤同上。同时具有亲本特异标记条带的单株则为真正的杂交种。 通过应用多对特征引物对杂种单株幼苗的标记基因型进行分析，检测得到的纯度结果的平均值即可记为杂交种的遗传纯度。这7对引物在多次重复中表现稳定，分析结果可相互验证和补充，可以准确地鉴定蓖麻杂交种纯度。
权利要求
1.蓖麻杂交种“CSR24. 181”种子纯度的检测方法，包括以下步骤 (1)提取蓖麻杂交种种子幼苗叶片基因组DNA； (2)以所述的基因组DNA为模板，选用SSR引物对进行PCR扩增，所述的SSR引物序列选自如下的一种或多种 引物Rco23 FCATGGATGTAGAGGGTCGATRCAGCCAAGCCAAAGATTTTC引物Rco26F TTGCTTGTCAAAGGGGAGTT RTCATTTTGAGGGAGAAACCA引物Rco29 FGGAGAAAAGAAAGGGAGAAGG RGCCAAAAGCACACTTAATTTGA引物RC05F CATCACCTCTATCCATCCGTTT R CCTTCATCATTGAACTCCCTTC引物RC61F GCACTGAGGGTTAATTCTGGAC R GTCGTAGACCACCTTAGCATCC引物RC129FTACTGCAACTCAATCCACTGCT RGATAGTGCCTTTGCCTCTTTTC引物RC242F ACCCCTGCAAAACCCTAATAAT R TTCGGTGTAAAGAATCCGACTT (3)对扩增产物进行凝胶电泳； (4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24.181”杂交种，检测得到的纯度结果的平均值即为其品种种子的纯度；其中 引物Rco23产生条带大小分别为440bp和600bp的母本特异标记Rco2344(l和Rco23_，产生条带大小分别为400bp和580bp的父本特异标记Rco234qq和Rco2358(l ； 引物Rco26产生条带大小为700bp的母本特异标记Rco26■，产生条带大小为705bp的父本特异标记Rco267(i5 ； 引物Rco29产生条带大小为560bp的母本特异标记Rco2956(l，产生条带大小为580bp的父本特异标记Rco2958(i ； 引物RC05产生条带大小分别为330bp和570bp的母本特异标记RC0533(I和RC0557(I，产生条带大小分别为360bp和600bp的父本特异标记RC0536(i和RC05_ ； 引物RC61产生条带大小为220bp的母本特异标记RC6122(I，产生条带大小为210bp的父本特异标记RC6121tl ； 引物RC129产生条带大小为695bp的母本特异标记RC12 9695，产生条带大小为690bp的父本特异标记RC12969Q ； 引物RC242产生条带大小为680bp的母本特异标记RC242_，产生条带大小分别为685bp 和 690bp 的父本特异标记 RC242685 和 RC24269(I。
2.如权利要求I所述的蓖麻杂交种“CSR24.181”种子纯度的检测方法，其特征在于步骤(I)中取“CSR24. 181”杂交制种所得Fl种子，在室内采用沙床25 °C条件下培育7_10天，长出2-3片嫩叶时，取其新鲜幼叶，按以下方法进行基因组DNA提取取1-2片拇指盖大小的新鲜蓖麻嫩叶装入2. Oml离心管中，加液氮磨成粉末状后，加入700ul CTAB提取液，充分摇匀，65°C水浴45-60 min，中途轻轻摇匀两次；加入700ul氯仿异戊醇(24:1 )，充分摇匀后10000r/min离心5-10min取上清液，可重复1_2次；加入1/10体积的3M pH 5. 2的NaAC和等体积冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于_20°C冰箱冷冻静置30min，10000r/min离心3min ;弃上清，将所得沉淀用70%的乙醇浸泡洗涤，中途换洗2_3次，风干后充分溶于200ulTE缓冲液，每管加入2. 5 ul浓度为10mg/ml的RNase A，37°C水浴6小时或过夜；取少量DNA原液在紫外分光光度计或DNA浓度测量仪上进行浓度及质量检测，其余的保存于_20°C 冰箱备用；所述的 CTAB 提取液为100mM Tris-HCl, pH 8. 0,50mM EDTA-Na2,1. 4M NaCl,2% CTAB，2%3 -巯基乙醇，2% PVP ;所述的 TE 缓冲液为10mM Tris-HCl pH 8. 0, ImM EDTA-Na2pH 8. O0
3.如权利要求I所述的蓖麻杂交种“CSR24.181”种子纯度的检测方法，其特征在于步骤(2)中Rco23、Rco26和Rco29引物的PCR扩增反应体系为25ul，包括DNA 50ng, I倍Buffer 缓冲液，dNTPsl50uM, Mg2+ I. 5Mm,正、反向引物各 0. 8uM, Taq DNA 聚合酶 IUnit ;扩增反应在PCR基因扩增仪上进行，扩增程序为94°C Imin ；94°C lmin，62°C或60°C lmin,72°C lmin，35 个循环；72°C 10 min ;引物 RC05、RC61、RC129 和 RC242 的 PCR 扩增反应体系为 20ul，包括 DNA 20ng，I 倍 Buffer 缓冲液，dNTPs 100uM,Mg2+ 2mM，正、反向引物各 0. 2uM，Taq DNA聚合酶 IUnit ;扩增程序为95°C 3min ；94°C 30 sec, 65°C 30 sec (-1°C/cycle),72°C 45 86(3，10个循环；941 30 sec, 55°C 30 sec (-1°C /cycle) ,72°C 45 sec，30 个循环；72°C 10 min。
4.如权利要求I所述的蓖麻杂交种“CSR24.181”种子纯度的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述扩增产物在双垂直板6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，50W恒定功率电泳60-90min，电泳结束后凝胶用蒸馏水稍冲洗后，银染15min，漂洗3_5 sec,显色液(2. 0%Na0H,0. 4%甲醛，0. 04%Na2C03)显色，漂洗后在可见灯箱下观察拍照。
全文摘要
蓖麻杂交种“CSR24.181”种子纯度的检测方法，包括以下步骤(1)提取蓖麻杂交种种子幼苗叶片基因组DNA；(2)以所述的基因组DNA为模板，选用特定SSR引物对进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行凝胶电泳；(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的“CSR24.181”杂交种，检测得到的纯度结果的平均值即为其品种种子的纯度。本发明的检测方法具有快速直观、便捷易行、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，可弥补传统常规纯度检测工作的不足。
文档编号C12Q1/68GK102618629SQ20111029334
公开日2012年8月1日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者严兴初, 严明芳, 汪磊, 王力军, 谭美莲 申请人:中国农业科学院油料作物研究所