专利名称：膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法
技术领域：
本发明涉及一种建立大鼠慢性肾盂肾炎模型的方法，用于模拟、研究和防止人类的慢性肾盂肾炎等医学领域。
背景技术：
泌尿道感染时临床常见病和多发病，其发病率根据我国普查统计，占到人口 0.91%，在妇女、儿童和老年人、HIV感染者、糖尿病及肿瘤等患者中均有很高的发病率。尽管当今抗病药物研究迅速发展，品种不断更新换代，泌尿道感染的发病率仍居高不下，且不断面临新的挑战，抗病毒的滥用、免疫抑制剂的应用等导致一些原来非致病病毒引起的感染不断增加。泌尿道感染按照解剖部位的不同，分为尿道炎、膀胱炎和肾盂肾炎。反复不断感染，病情迁延，可发展为慢性肾盂肾炎，是一种较严重的形式，出尿道刺激症状外，还出现全身症状，而且常常由于用药不规则，细菌极易产生多重耐药性，晚期出现肾功能不全，可危及患者生命。据欧洲透析中心统计资料表明，慢性肾盂肾炎占整个慢性尿毒症的 19. 8% 21. 2%，制作与人类泌尿道感染相似的动物模型，对探讨慢性肾盂肾炎的发病机制和研究的治疗方法十分必要，国外研究证实，有很多方法能够造成慢性甚于肾炎动物模型，但是有些方法周期长，或者为猪、兔比较昂贵。目前，用大鼠为模型，制造慢性甚于肾炎的报道有，王俊生等(大鼠慢性甚于肾炎模型的建立及L-型菌的分离鉴定[J].中华肾脏病杂质，1990，6 17)在国内首先利用尿道直接接种细菌的方法，报道了 CPN大鼠模型，该方法并不能诱导肾脏外观出现癫痕和固缩， 严格讲并不成功。龚学忠等(慢性肾盂肾炎模型的建立[J]. 2004,26(4)391-393)按照Bitz 等的方法，延长观察时间创建一种慢性肾盂肾炎大鼠模型，用不同浓度的致病性大肠杆菌株膀胱内注射，并短暂结扎左侧输尿管，观察90天内肾脏形态学动态变化，结果发现随着感染性炎症的修复，左肾外观有皮质癫痕及相关肾乳头收缩和肾盏的扩张，镜下慢性肾间质性肾炎改变和纤维化；细胞培养阳性结果主要在左肾和尿。因此，这些模型都不够成熟。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种大鼠慢性肾盂肾炎模型，该模型的构建方法是通过给大鼠的膀胱灌注大肠埃希氏菌。为实现本发明的目的，本发明的技术方案为一种膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤将麻醉后的大鼠的尿道口用新洁尔灭酊消毒，取24G静脉留置针，内置入钢丝，形成15° -30°角，用石蜡油润滑后，插入大鼠尿道口，成功置入导尿管于膀胱内3cm， 取出钢丝，抽吸尿液，弃尿液后，换用Iml OT针筒注入大肠埃希氏菌悬液，然后退出导管，将大鼠放入鼠笼等待自然苏醒。所述大肠埃希氏菌悬液的浓度为108-109CFU/100ul，每次注入量为 0.093-0. lml/100g。
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所述大肠埃希氏菌溶液的由以下方法制备所得在无菌条件下，从-70°C冰箱取出Dffia大肠埃希氏菌菌种，挑起菌种接种在装有LB培养基的无菌离心试管中，置于37cc 恒温摇床，转速150转/分，IOh后，用分光光度仪测定大肠杆菌的浓度，保持浓度在IO8 IO9CFU/IOOul 浓度。
所述大鼠是正常清洁级SD雌性大鼠。
在本发明的一具体实施例中，给大鼠连续6周灌注大肠埃希氏菌溶液，一周2次。
在本发明的一具体实施例中，用腹腔内注射5%水合氯醛麻醉大鼠，其用量为 0.7ml/100g。
本发明通过给膀胱灌注大肠埃希氏菌构建的慢性肾盂肾炎大鼠模型，肾脏组织HE 染色后，其肾间质可见明显浆细胞及淋巴细胞浸润，并见少量中性粒白细胞浸润，伴毛细血管充血扩张水肿。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例1
1、实验动物
13月龄正常清洁级SD雌性大鼠20只，体重为200g_215g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院清洁级动物实验中心常温饲养，预养7天。
2、实验试剂
大肠埃希氏菌0111B4(ATCC四522，中国药品生物制品检定所，批号44155)。
3、实验分组
13月龄SD雌性SD大鼠，随机分为2组，①对照组，η = 10只；②模型组，η = 10 只，各组体重无统计学差异。
4、模型方法
4. 1膀胱内灌注大肠埃希氏菌方法
(1)大肠埃希氏菌溶液的制备在无菌条件下，从_70°C冰箱取出Dffia大肠埃希氏菌菌种，挑起菌种接种在装有5ml LB培养基的无菌离心试管中，置于37cc恒温摇床，转速 150转/分。IOh后，用分光光度仪测定大肠杆菌的浓度，保持浓度在IO8 109CFU/100ul 浓度。
(2)膀胱内灌注细菌悬液予SD大鼠每周灌注大肠埃希氏菌溶液，一周2次，连续 6周。予5%水合氯醛(0.7ml/100g)腹腔内注射麻醉10只大鼠，新洁尔灭酊消毒大鼠尿道口，取24G静脉留置针，内置入钢丝，形成15° -30°角，用石蜡油润滑后，插入大鼠尿道口， 成功置入导尿管于膀胱内3cm，取出钢丝，抽吸尿液，弃尿液后，换用Iml OT针筒注入0. 2ml 108-109CFU/100ul大肠埃希氏菌悬液，然后退出导管，将大鼠放入鼠笼等待自然苏醒。
4. 2标本获取
灌注大肠埃希氏菌共计6周后，每只雌性SD大鼠腹腔内注射0. 7ml/100g 5%水合氯醛，将之置于解剖台上，新洁尔灭酊消毒腹部，用手术剪逐层打开腹腔，游离肾脏，将肾脏置入10%福尔马林溶液中。最后大鼠被引颈椎处死。
4. 3肾脏组织HE染色肾脏用10%福尔马林固定Mh，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，超薄切片，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸乙醇分化，伊红复染，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。光镜下观察肾脏病理变化。5、实验结果光镜下观察大鼠肾脏病理切片HE染色情况(见表1)，对照组正常，无炎症细胞浸润。而模型组大鼠的肾间质可见明显浆细胞及淋巴细胞浸润，并见少量中性粒白细胞浸润， 伴毛细血管充血扩张水肿。表1:肾脏HE染色表现
分组_η_炎症情况_对照组10-
模型组_10_++ ~ +++_注-阴性。+肾间质少量淋巴细胞及单核细胞浸润，毛细血管轻度充血水肿。++肾间质中量淋巴细胞及单核细胞浸润，毛细血管充血水肿。+++肾间质大量淋巴细胞及单核细胞浸润，毛细血管重度充血水肿。
权利要求
1.一种膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤将麻醉后的大鼠的尿道口用新洁尔灭酊消毒，取24G静脉留置针，内置入钢丝， 形成15° -30°角，用石蜡油润滑后，插入大鼠尿道口，成功置入导尿管于膀胱内3cm，取出钢丝，抽吸尿液，弃尿液后，换用Iml OT针筒注入大肠埃希氏菌悬液，然后退出导管，将大鼠放入鼠笼等待自然苏醒。
2.根据权利要求1所述的膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌悬液的浓度为108-109CFU/100ul，每次注入量为 0.093-0. lml/100g。
3.根据权利要求1所述的膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法， 其特征在于，用腹腔内注射5%水合氯醛麻醉大鼠，其用量为0. 7ml/100g。
4.根据权利要求1所述的膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法， 其特征在于，给大鼠连续6周灌注大肠埃希氏菌溶液，一周2次。
5.根据权利要求1所述的膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法， 其特征在于，所述大肠埃希氏菌溶液的由以下方法制备所得在无菌条件下，从-70°C冰箱取出Dffia大肠埃希氏菌菌种，挑起菌种接种在装有LB培养基的无菌离心试管中，置于37cc 恒温摇床，转速150转/分，IOh后，用分光光度仪测定大肠杆菌的浓度，保持浓度在IO8 IO9CFU/IOOul 浓度。
6.根据权利要求1所述的膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法， 其特征在于，所述大鼠是正常清洁级SD雌性大鼠。
全文摘要
一种膀胱灌注大肠埃希氏菌构建慢性肾盂肾炎大鼠模型的方法，包括以下步骤连续6周，一周2次，将麻醉后的大鼠的尿道口用新洁尔灭酊消毒，取24G静脉留置针，内置入钢丝，形成15°-30°角，用石蜡油润滑后，插入大鼠尿道口，成功置入导尿管于膀胱内3cm，取出钢丝，抽吸尿液，弃尿液后，换用1ml OT针筒注入浓度为108～109CFU/100ul的大肠埃希氏菌悬液，然后退出导管，将大鼠放入鼠笼等待自然苏醒；本方法建构的慢性肾盂肾炎大鼠模型，其肾脏病理切片HE染色后，肾间质可见明显浆细胞及淋巴细胞浸润，并见少量中性粒白细胞浸润，伴毛细血管充血扩张水肿。
文档编号A61D7/00GK102499786SQ20111036168
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者王怡, 陈敏, 顾向晨 申请人:王怡