专利名称：基于微观动态离子流技术检测水稻真菌性立枯病的方法
技术领域：
本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种基于微观动态离子流技术检测水稻真菌性立枯病的方法。
背景技术：
水稻是我国第一大粮食作物，但是目前在全国各稻区生产中普遍存在苗期病秧、 弱秧多，尤其是近年来旱育秧技术的普遍使用，真菌性立枯病也常有发生，发病率很高。另外在水稻育种过程中如果发生真菌性立枯病会造成严重损失，重者导致前期育种工作白费，轻者浪费时间，错过农时。真菌性立枯病是由半知菌亚门的镰刀菌感染而发生的真菌性病害，郑雯等Q001) 分离得到了可以感染水稻的5个镰刀菌和1个立枯丝核菌(郑雯，台莲梅，王桂海，辛惠普黑龙江东部稻区水稻立枯病病原真菌的分离鉴定黑龙江八一农垦大学学报[J]2001， 4:21-23)。苏宝华等Q010)认为真菌性立枯病多发生在离乳期，叶片展不开，种子和茎部根基部位交界处发生霉变，同时茎的基部发生腐烂，根变成黄褐色，真菌性立枯病严重危害水稻生产(苏宝华寒地水稻立枯病的发病原因及防治措施中国农村小康科技[J]2010，7 60-61)。迄今为止，对水稻真菌性立枯病的研究都是在防治角度，在病害评价角度还未见有报道。微观动态离子流检测技术，是一项基于Nernst方程和Fick' s第一扩散定律计算离子和分子的浓度和流速的技术，所检测的离子或分子的灵敏度可达10-12mol/Cm2. s，这种技术的特点是对材料无损的条件下对细胞、组织、器官、整株材料的外周进行离子和分子检测，最终获得离子或分子的运动速率、方向及浓度信息等。该技术应用广泛，在生命科学、 环境科学、材料科学等领域被广泛采用。已有报道中对水稻真菌性立枯病的防治方法很多，如韩润亭(申请号 200810051023) 一种防治水稻恶苗病和立枯病的农药；王国强(申请号00103926)稀土生物农药水稻种衣剂。上述发明主要是针对真菌性立枯病的防治类农药，但是对真菌性立枯病的早期评价方法未见报道。利用微观动态离子流检测技术可测得真菌性立枯病发病时的离子流信息，通过与正常生长的水稻比较，获得真菌性立枯病发病时的离子流吸收或释放规律，利用此规律评价真菌性立枯病的发生。以往检测离子流的方法为原子吸收分光光度法，如高叶等O008) 研究NaCl对甘薯试管苗影响时通过原子吸收分光光度法检测离子含量判断收胁迫的程度(高叶，赵术珍，陈敏，宋晓征，王宝山=NaCl胁迫对甘薯试管苗生长及离子含量影响， 安徽农业科学[J]，2008，36 (35) :15333-15335)；郭小俊等(2008)研究ABA对NaCl胁迫下的黄瓜幼苗影响时，也利用原子吸收分光光度法检测离子含量研究黄瓜幼苗耐盐机理 (郭小俊，谢成俊外源ABA对NaCl胁迫下黄瓜幼苗不同离子含量的影响，中国蔬菜[J]， 2008(9)27-30)。然而，该方法不能实现活体生物材料的无损、动态检测，破坏了植物的生活状态。因此，开发新的检测水稻真菌性立枯病的方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明旨在为水稻育苗和水稻育种提供一种快速、无损的检测水稻真菌性立枯病的新方法。为了实现本发明目的，本发明的一种基于微观动态离子流检测水稻真菌性立枯病的方法，其是利用微观动态离子流检测技术分别检测水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力， 检测出感染真菌性立枯病的水稻，所述离子流流向处于外流或者是内流幅度较对照变小即为感染真菌性立枯病。其中，检测使用的水稻处于幼苗期。前述的方法，微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为 0. 05 0. 15mM。前述的方法，检测使用的水稻处于2叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖 300 500 μ m的根尖分生区的外表面20 50 μ m处。具体地，前述方法包括以下步骤(1)向微电极中灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1cm，再将电极前端吸入相应的测试离子交换剂；( 将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30min左右，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10 15min ； (4)对检测结果进行处理和分析。其中，上述步骤(1)所述离子灌充液为80 140mM KC1、80 140mM NH4Cl和 80 140mM CaCl2 ；步骤(1)所述电极的前端吸入的测试离子交换剂的长度为K+100 200 μ m ；NH4+20 50 μ m 禾口 Ca2+15 30 μ m ；上述步骤(2)所述的校正液为Κ+0· 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ 0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ :0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；上述步骤(3)所述的测试缓冲液为:K+或Ca2+ :0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0· 1 0· 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES ； NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2 和 0· 05 0. 15mM NH4C1。前述方法中校正后电极的能斯特方程计算理想值为K+ 56 60mV ；NH4+ 56 60mV ；Ca2+ 25 29mV。前述方法中所述K+离子流的流速为10 500pmol. cm_2. s—1，NH4+离子流的流速为 10 500pmol. cnT2. s-1，Ca2+ 离子流的流速为 10 500pmol. cnT2. s-1。本发明利用微观动态离子流检测技术可测得真菌性立枯病发病时的离子流信息， 通过与正常生长的水稻比较，获得真菌性立枯病发病时的离子流吸收或释放规律，利用此规律评价真菌性立枯病的发生，从而实现对水稻真菌性立枯病的快速、无损检测，检测后的植株材料还能够正常生长，避免了珍贵水稻苗的损失，检测结果对比明显，方法可靠，为水稻育苗和水稻育种提供了一种快速、无损的检测水稻真菌性立枯病的新方法。
图1是本发明基于微观动态离子流检测技术检测水稻真菌性立枯病的实验过程图。
图2是水稻真菌性立枯病与正常水稻苗的K+离子流分析图(实时流速)。图3是水稻真菌性立枯病与正常水稻苗的K+离子流分析图(平均流速)。图4是水稻真菌性立枯病与正常水稻苗的NH4+离子流分析图(实时流速)。图5是水稻真菌性立枯病与正常水稻苗的NH4+离子流分析图(平均流速)。图6是水稻真菌性立枯病与正常水稻苗的Ca2+离子流分析图(实时流速)。图7是水稻真菌性立枯病与正常水稻苗的Ca2+离子流分析图(平均流速)。图8所示为利用微电极检测时，电极距离根尖的位置。其中，图2、图4和图6中纵坐标为离子流速，单位为pmol. cm_2. 横坐标为时间， 单位为s ；图3、图5和图7中纵坐标为离子流速，单位为pmol. cm_2. S—1。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。其中，水稻品种龙粳26购自黑龙江省农科院佳木斯水稻研究所。实施例1.实验方法实验材料及培养条件材料为水稻品种龙粳沈，种子经过晒种，盐水6/25 (m/v) 筛选后，浸种，25°C催芽，播种在育苗秧盘中，土壤营养土 = 3 1，施底肥硫酸铵(1斤 /1000斤土壤)和磷酸二铵O斤/1000斤土壤)，自然光照，培养地点在北京农业信息技术研究中心温室，秧苗在2叶1心时水稻真菌性立枯病开始发生，此时开始离子流检测。2.实验仪器及耗材离子流检测用非损伤微测系统(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)， 软件imFlux，采用尖端直径为2-4 μ m的玻璃微电极。3.实验试剂及溶液(1)液态离子交换剂包括K+ 货号 Potassium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103，USA ；NH4+ 货号 Ammonium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103, USA ；Ca2+ 货号 Calcium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103，USA ；(2)测试缓冲液离子流测试时，测试不同的离子需要不同的测试液，如下K+离子0. ImM KCl,0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2S04、0. 3mM MESNH4+离子lmM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM NH4ClCa2+离子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM MgCl2、0. 5mMNaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mM MES(3)电极灌充液K+: IOOmM KClNH4+: IOOmM NH4ClCa2+: IOOmM CaCl2(4)校正液K+ 离子0. ImM 和 ImM KCl
NH4+ 离子0. ImM 和 ImM NH4ClCa2+ 离子0. ImM 和 ImM CaCl24.实验内容及方法实验过程如图1所示。从电极末端灌入Icm左右的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，前端吸入适当长度(K+ 100 200 μ m、NH4+ :20 50 μ m、Ca2+ :15 30 μ m)的离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正，其Nerst方程计算理想值分别是K+、NH4+ :56_60mV，Ca2+ :25_30mV。材料在测试前置于相应的测试液中平衡30min左右。然后在距离水稻根尖分生区 (距离根尖300 μ m左右)表面30 μ m的地方振动检测(图8)，每个样品检测10min-15min。5.数据处理离子流处理基于Fick扩散定律，并通过在线软件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/magef lux/)计算得出。由3次以上独立实验数据做统计分析，利用Exce 12003分析作图。6.实验结果实验结果如图2-图7所示由图2和图3可以看出正常水稻苗的K+离子处于内流状态，平均流速为-50. 32pmol. cm_2. s—1 ；发生真菌性立枯病的水稻苗K+处于明显的外流状态，平均流速为 12. 15pmol. cm 2· s 1O由图4和图5可以看出正常水稻苗的NH4+处于内流状态，平均流速为-118. 6pmol. cm—2, s—1 ；发生真菌性立枯病的水稻苗的NH4+处于外流状态，平均流速为 85. 07pmol. cm 2· s 1O由图6和图7可以看出正常的水稻苗的Ca2+处于内流状态，平均流速为-105. 68pmol. cm—2· s-1，发生真菌性立枯病的水稻苗Ca2+处于外流状态，平均流速为 56. 33pmol. cm 2· s 1O上述结果表明，水稻在发生真菌性立枯病的时候K+、NH4+和Ca2+三种无机离子由正常的内流转为外流，导致无机营养流失，造成生理机能的改变。通过三种无机离子的离子流向和流速可以判断水稻是否感染了真菌性立枯病以及感染程度。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种基于微观动态离子流检测技术检测水稻真菌性立枯病的方法，其特征在于，利用微观动态离子流检测技术分别检测水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力，检测出感染真菌性立枯病的水稻，所述离子流流向处于外流或者是内流幅度较对照变小即为感染真菌性立枯病。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测使用的水稻处于幼苗期。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0. 05 0. 15mM。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测使用的水稻处于2叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生区的外表面20 50 μ m处。
5.根据权利要求1 4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)向微电极中灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1cm，再将电极前端吸入相应的测试离子交换剂；(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10 15min ；(4)对检测结果进行处理和分析；其中，步骤(1)所述离子灌充液为80 140mM KC1、80 HOmMNH4Cl和80 140mM CaCl2 ；步骤(1)电极的前端吸入的测试离子交换剂的长度为K+100 200μπι ;ΝΗ4+20 50 μ m 禾口 Ca2+15 30 μ m ；步骤(2)所述的校正液为K+0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mMKCl ；NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ :0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；步骤(3)所述的测试缓冲液为=K+或Ca2+ 0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2, 0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0· 1 0· 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES ；NH4+ 0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 05 0. 15mM NH4C1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，校正后电极的能斯特方程计算理想值为 K+ 56 60mV ；NH4+ 56 60mV ；Ca2+ 25 29mV。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述K+离子流的流速为10 500pmol.cnT2. s"1, NH4+离子流的流速为10 500pmol. cnT2. s"1, Ca2+离子流的流速为10 500pmol.-2 -1 cm . s ο
全文摘要
本发明提供了一种基于微观动态离子流检测技术的水稻真菌性立枯病的检测方法，其是利用微观动态离子流检测技术分别检测水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力，检测出感染真菌性立枯病的水稻。本发明利用微观动态离子流检测技术可测得真菌性立枯病发病时的离子流信息，通过与正常生长的水稻比较，获得真菌性立枯病发病时的离子流吸收或释放规律，利用此规律评价真菌性立枯病的发生，从而实现对水稻真菌性立枯病的快速、无损检测，检测后的植株材料还能够正常生长，避免了珍贵水稻苗的损失，检测结果对比明显，方法可靠，为水稻育苗和水稻育种提供了一种快速、无损的检测水稻真菌性立枯病的新方法。
文档编号A01G7/06GK102520046SQ201110364009
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者侯佩臣, 潘大宇, 王成, 王晓冬, 王纪华, 罗斌 申请人:北京农业智能装备技术研究中心