专利名称：一种铁皮石斛组培苗的细胞组织培养繁育方法
技术领域：
本发明涉及一种铁皮石斛组培苗的细胞组织培养繁育方法。
背景技术：
石斛又名石斛兰，为兰科石斛属植物，是我国古文献中最早记载的兰科植物之一。 铁皮石斛为石斛中最名贵的品类之一，药用价值极高，我国历代药学著作均对其有详细的记载，《本草纲目》认为其除痹下气、补内脏虚劳赢瘦，强阴益精。久服，厚肠胃，补内绝不足。 来胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年。道教医学经典《道藏》中将铁皮石斛列为中华“九大仙草”之首。《中华人民共和国药典》记载其益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴， 食少干呕，病后虚热，目暗不明。近年来，由于铁皮石斛自然繁殖率极低，再加上人们长期无节制地采挖，造成该物种野生资源严重贫乏，目前已被列为国家二级濒危保护植物。铁皮石斛组培技术目前已逐渐趋于成熟，但绝大多数的组培苗都是采用铁皮石斛种子作为最初的繁育种源。种子由于是有性生殖的产物，在遗传学上存在父本母本的差异， 所繁育出来的子代会出现性状分离现象，不利于保存优良品种。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用现代生物技术培养铁皮石斛种苗的方法，其技术效果是通过无性繁殖的方法使上一代的优良性状稳定遗传给下一代，有效避免了有性生殖所带来的子代性状分离现象，能最好的保留母株的性状，使得组培苗生产有目的性和针对性。本发明的具体实施方式
为
1、母株处理选择目标铁皮石斛植株，用纯净水清洗干净，去除叶片，用镊子将植株外层鞘皮剥离干净。2、浸泡消毒在洁净室超净工作台上将植株放入浓度0. 1%的升汞溶液中浸泡消毒 15min03、清洗切段消毒结束取出植株，用无菌水冲洗干净，用无菌手术刀将植株切段， 每段长 2. 0-3. 0cm。4、诱导愈伤组织将上述植株段接种在愈伤组织培养基上，在温度20_28°C，湿度 30%-45%，光照度1800-2000LX，每天光照8_12h的环境下进行培养。培养时间45-90天，直至愈伤组织长出为止。愈伤组织培养基配方(以IL计)
l/2MS+20g 白砂糖 +5g 琼脂 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。5、愈伤组织碾碎用无菌手术刀在超净工作台上将愈伤组织切下，用无菌镊子碾碎分散。6、摇床培养将碾碎的愈伤组织放入细胞培养液中置于摇床上常温培养15-25天。
细胞培养液配方(以IL计) 1/2MS+20 g 白砂糖 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。7、圆球茎培养将细胞培养液中增殖出的细胞接种于圆球茎培养基上，在温度 20-280C，湿度30%-45%，光照度1800_2000Lx，每天光照8_12h的环境下进行培养45-60天， 直至圆球茎长出。圆球茎培养基配方(以IL计)
1/2MS+4. Omg 6-BA + 0. 4mg NAA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。8、分化苗培养将培养出的圆球茎，均勻接种在分化苗培养基上，在温度 20-280C，湿度30%-45%，光照度2000_2200Lx，每天光照8_12h的环境下进行培养40-60天， 直至分化苗长出。分化苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+3. Omg 6-BA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。9、小苗培养将培养出的分化苗均勻接种在小苗培养基上，在温度20-28°C，湿度 30%-45%，光照度2000-2200LX，每天光照8_1池的环境下进行培养40-60天，直至小苗长出。小苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+ 3. Omg 6-BA +0. 3mg NAA +50g 香蕉 +50g 土豆 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。10、大苗培养将培养出的小苗均勻接种在大苗培养基上，在温度20_28°C，湿度 30%-45%，光照度2000-2500LX，每天光照8_1浊的环境下培养50-90天，瓶苗生根，至2_4条根/株时，瓶苗可出瓶炼苗。大苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+0. 5mg NAA+50g 土豆 +50g 香蕉 +25g 白砂糖 +5g 琼脂 +1. Og 活性炭。本发明的技术方案具有如下效果本发明有效避免了有性生殖会产生性状分离的这一弊端，根据生物体细胞具有全能型的特征，利用培育出的植物愈伤组织作为繁育种源， 通过无性繁殖的方法使上一代的优良性状稳定遗传给下一代，在子代中最大程度的保留了母株的性状，使得组培苗生产有目的性和针对性，为铁皮石斛优良性状的稳定遗传提供了一种有效的方法。
具体实施例方式实施例1
将铁皮石斛植株用纯净水清洗干净，去除叶片，用镊子将植株外层鞘皮剥离干净。在洁净室超净工作台上将植株放入浓度0. 1%的升汞溶液中浸泡消毒15min。消毒结束取出植株，用无菌水冲洗干净，用无菌手术刀将植株切段，每段长2. 5cm。将植株段接种在愈伤组织培养基上，在温度23°C，湿度35%，光照度1800Lx，每天光照IOh的环境下进行培养。培养时间70天，愈伤组织长出。用无菌手术刀在超净工作台上将愈伤组织切下，用无菌镊子碾碎分散。将碾碎的愈伤组织放入细胞培养液中置于摇床上常温培养15天。摇床培养结束将细胞培养液中增殖出的细胞接种于圆球茎培养基上，在温度23°C，湿度35%，光照度1800Lx， 每天光照IOh的环境下进行培养50天，圆球茎长出。将培养出的圆球茎，均勻接种在分化苗培养基上，在温度23°C，湿度35%，光照度2200Lx，每天光照IOh的环境下进行培养55天， 分化苗长出。将培养出的分化苗均勻接种在小苗培养基上，在温度23°C，湿度35%，光照度2200Lx,每天光照12h的环境下进行培养55天，小苗长出。将培养出的小苗均勻接种在大苗培养基上，在温度23°C，湿度35%，光照度2300Lx，每天光照IOh的环境下培养60天，瓶苗生根，每株2-4条根，瓶苗出瓶炼苗。所使用的培养基为 愈伤组织培养基配方(以IL计)
l/2MS+20g 白砂糖 +5g 琼脂 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。细胞培养液配方(以IL计) 1/2MS+20 g 白砂糖 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。圆球茎培养基配方(以IL计)
1/2MS+4. Omg 6-BA + 0. 4mg NAA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。分化苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+3. Omg 6-BA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。小苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+ 3. Omg 6-BA +0. 3mg NAA +50g 香蕉 +50g 土豆 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。大苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+0. 5mg NAA+50g 土豆 +50g 香蕉 +25g 白砂糖 +5g 琼脂 +1. Og 活性炭。实施例2
将铁皮石斛植株用纯净水清洗干净，去除叶片，用镊子将植株外层鞘皮剥离干净。在洁净室超净工作台上将植株放入浓度0. 1%的升汞溶液中浸泡消毒15min。消毒结束取出植株，用无菌水冲洗干净，用无菌手术刀将植株切段，每段长3. Ocm0将植株段接种在愈伤组织培养基上，在温度25°C，湿度40%，光照度1800Lx，每天光照IOh的环境下进行培养。培养时间65天，愈伤组织长出。用无菌手术刀在超净工作台上将愈伤组织切下，用无菌镊子碾碎分散。将碾碎的愈伤组织放入细胞培养液中置于摇床上常温培养20天。摇床培养结束将细胞培养液中增殖出的细胞接种于圆球茎培养基上，在温度25°C，湿度40%，光照度1800Lx， 每天光照IOh的环境下进行培养55天，圆球茎长出。将培养出的圆球茎，均勻接种在分化苗培养基上，在温度25°C，湿度40%，光照度2000Lx，每天光照12h的环境下进行培养57天， 分化苗长出。将培养出的分化苗均勻接种在小苗培养基上，在温度25°C，湿度40%，光照度 2200Lx,每天光照IOh的环境下进行培养60天，小苗长出。将培养出的小苗均勻接种在大苗培养基上，在温度25°C，湿度40%，光照度2500Lx，每天光照IOh的环境下培养77天，瓶苗生根，每株2-4条根，瓶苗出瓶炼苗。所使用的培养基为 愈伤组织培养基配方(以IL计)
l/2MS+20g 白砂糖 +5g 琼脂 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。细胞培养液配方(以IL计) 1/2MS+20 g 白砂糖 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。圆球茎培养基配方(以IL计)
1/2MS+4. Omg 6-BA + 0. 4mg NAA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。分化苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+3. Omg 6—BA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。
小苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+ 3. Omg 6-BA +0. 3mg NAA +50g 香蕉 +50g 土豆 +25 g 白砂糖 +5g 琼脂。大苗培养基配方(以IL计)
1/2MS+0. 5mg NAA+50g 土豆 +50g 香蕉 +25g 白砂糖 +5g 琼脂 +1. Og 活性炭。
权利要求
1.一种铁皮石斛组培苗的细胞组织培养繁育方法，其特征是按如下步骤进行(1)母株处理选择目标铁皮石斛植株，用纯净水清洗干净，去除叶片，将植株外层鞘皮剥离干净；(2)浸泡消毒在洁净室超净工作台上将植株放入浓度0.1%的升汞溶液中浸泡消毒 15min ；(3)清洗切段消毒结束取出植株，用无菌水冲洗干净，用无菌手术刀将植株切为每段长2. 0-3. Ocm的植株段；(4)诱导愈伤组织将上述植株段接种在愈伤组织培养基上，在温度20-28°C、湿度 30%-45%、光照度1800-2000LX和每天光照8_12h的环境下进行培养45-90天，直至愈伤组织长出为止；(5)愈伤组织碾碎用无菌手术刀在超净工作台上将愈伤组织切下，用无菌镊子碾碎分散；(6)摇床培养将碾碎的愈伤组织放入细胞培养液中置于摇床上常温培养15-25天；(7)圆球茎培养将细胞培养液中增殖出的细胞接种于圆球茎培养基上，在温度 20-28°C、湿度30%-45%、光照度1800-2000Lx和每天光照8_12h的环境下进行培养45-60 天，直至圆球茎长出；(8)分化苗培养将培养出的圆球茎，均勻接种在分化苗培养基上，在温度20-28°C、湿度30%-45%、光照度2000-2200LX和每天光照8_12h的环境下进行培养40-60天，直至分化苗长出；(9)小苗培养将培养出的分化苗均勻接种在小苗培养基上，在温度20-28°C、湿度 30%-45%、光照度2000-2200LX和每天光照8_12h的环境下进行培养40-60天，直至小苗长出；(10)大苗培养将培养出的小苗均勻接种在大苗培养基上，在温度2048°C、湿度 30%-45%、光照度2000-2500LX和每天光照8_12h的环境下培养50-90天，瓶苗生根，至2_4 条根/株时，瓶苗出瓶炼苗。
2.如权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的细胞组织培养繁育方法，其特征是步骤(4)愈伤组织培养基配方，(以IL计)为l/2MS+20g白砂糖+5g琼脂+5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA。
3.如权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养繁育方法，其特征是步骤(6)细胞培养液配方(以 IL 计)为:l/2MS+20 g 白砂糖 +5. Omg 6-BA+O. 5mg NAA0
4.如权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养繁育方法，其特征是步骤(7)圆球茎培养基配方(以 IL 计)为l/2MS+4. Omg 6-BA + 0. 4mg NAA +50g 土豆 +50g 香蕉 +25 g 白砂糖+5g琼脂。
5.如权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养繁育方法，其特征是步骤(8)分化苗培养基配方(以IL计)为l/2MS+3. Omg 6-BA +50g 土豆+50g香蕉+25 g白砂糖+5g琼脂。
6.如权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养繁育方法，其特征是步骤(9)小苗培养基配方(以 IL 计)1/2MS+ 3. Omg 6-BA +0. 3mg NAA +50g 香蕉+50g 土豆+25 g 白砂糖+5g琼脂。
7.如权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养繁育方法，其特征是步骤(10)大苗培养基配方(以IL计)为l/2MS+0. 5mg NAA+50g 土豆+50g香蕉+25g白砂糖+5g琼脂 +1. Og活性炭。
全文摘要
一种铁皮石斛组培苗的细胞组织培养繁育方法，其步骤是母株处理、浸泡消毒、清洗切段、诱导愈伤组织、愈伤组织碾碎、摇床培养、圆球茎培养、分化苗培养、小苗培养和大苗培养。本发明通过无性繁殖的方法使上一代的优良性状稳定遗传给下一代，有效避免了有性生殖所带来的子代性状分离现象，能最好的保留母株的性状，使得组培苗生产有目的性和针对性。
文档编号A01H4/00GK102499092SQ201110365328
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者李丽, 杨永祥, 田芳, 陈云 申请人:云南金九地生物科技有限公司