专利名称：超旱生植物准噶尔无叶豆DREB转录因子EsDREB及编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种超旱生植物准噶尔无叶豆DREB转录因子EsDREB及编码基因，利用该基因在提高酵母抗旱、耐低温及高温胁迫等抗逆性方面的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
干旱是限制植物生长发育和作物产量的主要因素，每年导致作物减产达50%以上。植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状，利用常规育种方法改良作物的抗旱性受到周期长、优异种质资源缺乏的限制。近年来的转录组学、蛋白组学和基因表达调控的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力，已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。DREB 转录因子(Dehydration Responsive Element Binding protein)，艮口干旱应答元件结合蛋白，属于AP2/EREBP类基因家族，特异存在于植物中。DREB与抗逆基因启动子区域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)顺式作用元件结合，其核心序 TACCGACAT，启动下游一系列的有DRE顺式作用元件的抗逆基因的表达，广泛参与干旱、高盐，热等胁迫应答反应，从而能从整体上提高植物的抗逆性。自1994年Yamaguchi-Siinozaki从拟南芥中首次检测到DRE作用的蛋白因子并命名为DREBl到1997年Mockinger等首次从拟南芥cDNA文库中克隆到AtCBFl以来， DREB/CBF转录因子基因的克隆一直是植物分子生物学的热点。目前已从拟南芥、水稻、玉米、小麦、黑麦、大豆、西红菜，棉花，芦荟等几十种植物中分离并鉴定出调控干早、高盐及低温耐性的DREB基因，并利用这些基因得到了抗逆性增强的拟南芥、烟草、油菜、西红柿、小麦等转基因植株。但目前关于DREB的研究主要集中于草本植物领域，对于木本植物研究较少。由于木本植物生命周期长，并且其抵御外界不良环境侵害的因素会多于草本植物，注定其分子机制更为复杂。对木本植物DREB的研究主要以杨树为主，包括:Wang等Q008)从河北杨中分离出2个CBF，其功能待进一步研究；Chen等Q009)利用35S启动子驱动的胡杨PeDREB2基因转入烟草内，发现转基因株的抗寒性明显增加；陈金焕等Q010)从胡杨中分离出2个编码DREB2类蛋白基因，酵母单杂交试验证明这两个基因具有转录活性；^lou 和Li (2010)利用RT-PCR手段克隆得到1个毛白杨CBF基因，研究证明该基因在植物适应寒冷和干旱的过程中可能有着重要作用。另外，有关DREB/CBF类抗逆境转录因子DREB的功能及转录调控的研究大部分来自模式植物拟南芥及经济作物水稻，小麦等，而对自然界天然存在的抗逆能力极强的植物资源却尝试较少，近几年来，一些学者开始在一些天然的抗逆植物资源中挖掘基因资源， 并取得了一些综合抗逆能力很强的DREB类转录因子，如盐生植物二色补血草(Qiaoying Ban，2011)，海篷子(Kapil Gupta，2010)，荒漠旱生植物资源如柠条锦鸡儿(Xuemin Wang， 2010)及苔藓类植物小立碗藓(Ning Liu，2007)，其中从二色补血草中克隆的LbDREB基因除了常见的抗盐等抗性外，还表现出了很强的抗重金属能力。综上，植物中还存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其从极端抗旱的超旱生木本资源植物中克隆DREB基因并进行抗逆育种尚鲜见报道。而从本土抗逆植物资源中克隆抗逆相关基因并改良农作物不失为一种新的尝试。因此，从本土超旱生荒漠植物中寻找新的DREB转录因子，在基因工程水平上培育抗旱，耐低温，耐高盐等新的作物品种具有重要意义。准噶尔无叶豆(Eremosparton songoricum(Litv. ) Vass.)系豆科无叶豆属超旱生无叶灌木，仅片断化分布于新疆古尔班通古特沙漠流动沙丘上，是典型的流沙先锋植物。该种是我国的单属种植物类群，西北荒漠植被中的标志性种，稀有种。由于长期生活在极端恶劣的流动沙丘环境中，沙漠干旱、少雨、大风、沙埋等环境塑造了准噶尔无叶豆抗旱的形态学及生理学特性，表现在该种为小半灌木，叶极端退化，以营养枝执行光合作用，故称“无叶豆”;具有超强的根吸水能力以及细胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，长期的环境压力使得该种具有抗旱，抗高温，抗风蚀沙埋等抵抗多种非生物胁迫的能力，其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。准噶尔无叶豆作为天然抗逆性极强的典型荒漠沙生植物，开展该种的抗旱相关DREB转录因子基因的克隆，对于深入理解该种的耐旱机理及开发利用抗逆基因资源，定向培育植物新品种均有重要价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于为了解决目前可利用的DREB转录因子比较少的问题， 提供一种超旱生沙漠植物准噶尔无叶豆DREB转录因子&DREB基因，其氨基酸序列由SEQ ID NO 3 所示。本发明的第二个目的在于提供一种编码准噶尔无叶豆DREB转录因子EsDREB的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的第三个目的在于，所述准噶尔无叶豆DREB转录因子基因在培育抗逆生物，尤其是抗非生物胁迫生物品种中的应用。本发明所述的一种超旱生植物准噶尔无叶豆DREB转录因子EsDREB，它具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其中转录因子&DREB为207个氨基酸。所述的准噶尔无叶豆DREB转录因子EsDREB的基因，该基因为核苷酸序列SEQ ID NO 2所示，其中基因编码区长为624bp。将所示的核苷酸序列按常规方法进行酵母表达载体构建，酵母表达载体导入宿主，其中宿主为酵母菌株INV&1，得到具备抗逆能力的转EsDREB基因的转化体的功能测
试ο该基因在制备植物抗逆性育种和改良的用途。本发明为植物准噶尔无叶豆DREB转录因子EsDREB的基因，具体方法为取光照培养箱中培养的两周大准噶尔无叶豆幼苗，以20%聚乙二醇6000处理4h 后取样，提取总RNA;用总RNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板PCR扩增得到DRra转录因子基因， 命名为&DREB ；构建&DREB酵母表达载体pbridge，转化酵母菌株AH109，利用该系统验证该转录因子基因的转录激活活性；构建EsDREB植物表达载体pBI221，瞬时转化洋葱表皮细胞，观察该转录因子基因的亚细胞定位情况；构建&DREB酵母表达载体PYES2，转化酵母菌株INVkl，用酵母体系验证该转录因子基因的功能。本发明以超旱生沙漠植物准噶尔无叶豆为材料，克隆了一种DREB转录因子基因 EsDREB，并对该基因的转录激活活性和亚细胞定位进行了研究。同时，利用酵母表达体系验证了该转录因子基因具有抗旱，低温和高温胁迫的能力。本发明所述的植物准噶尔无叶豆DREB转录因子&DREB的基因为SEQ ID NO 1 EsDREB基因的AP2保守域的核苷酸序列TGAAACACTGGCAAAATGGATAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATCGGGTAATGAAGCCGAGAAGCCGGT TAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACT ACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGG TTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCATATGACGAAGCTGCTATGGCTATGTATGGSEQ ID NO 2 EsDREB基因的核苷酸序列TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATMATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACA AGTTTCCAATTTCTCTCA GCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAA ACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCAT GAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCATSEQ ID NO 3 EsDREB基因编码的转录因子的氨基酸序列MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGEGDSGSGTSSSDPSLS
图1为本发明准噶尔无叶豆DREB基因RT-PCR扩增电泳图，其中泳道1 :cDNA为模板的扩增；泳道2 =DNA为模板的扩增；泳道M 分子量MakerDL2000图2为本发明EsDREB转录因子基因序列分析图，其中AP2保守结构域用下划线标注，保守的第14位的缬氨(V14)和第19位的谷氨酰胺(E19)位点用方框标出。图3为本发明EsDREB转录因子转录激活活性实验的染色结果图，其中a示意图中 1,2,3分别代表未连接基因的pYES2空载，带目的片段EsDREB基因的pYES2_EsDREB和带有拟南芥AtDREB基因的pYES2-AtDREB重组载体；b是以上三种质粒转化酵母感受态细胞 INVScl菌株并涂布在色氨酸、组氨酸缺陷型(SD/His-Trp)培养基上的筛选情况；c是以上三种质粒转化酵母感受态细胞INVScl菌株后，阳性菌落经β -半乳糖苷酶显色分析结果； d是以上三种质粒转化酵母感受态细胞INVScl菌株后，菌液经半乳糖苷酶显色分析结^ ο图4为本发明EsDREB转录因子在植物细胞内的亚细胞定位分析的激光共聚焦显微镜观察图，其中a，b，c分别为暗视野观察，亮视野观察和叠加效果，且图的上半部分为带 EsDREB基因的pBI221-EsDREB重组载体在洋葱表皮细胞的瞬时表达结果，图的下半部分表示pBI221空载在洋葱表皮细胞的瞬时表达结果。图5为本发明重组载体pYES2_EsDREB转化酵母菌株INVkl的菌液PCR图，其中 M泳道为分子量Maker DL2000,泳道1为PCR的NTC阴性对照，泳道2为pYES2空载，泳道 3-6是带检测的转化子，泳道7为带EsDREB目的片段的阳性质粒。图6为本发明INVk 1-pYES2_EsDREB重组酵母质粒成功构建的双酶切图，其中 1为阳性质粒，2-5为以上四个经菌液PCR鉴定为阳性的酵母转化子，M为分子量Maker DL2000。图7为本发明转EsDREB转录因子基因的酵母菌在无胁迫条件和干旱胁迫下的生长实验结果图，其中a为无胁迫条件下的空载质粒PYES2 (上)和带目的片段的重组载体 pYES2-EsDREB (下)的生长情况；b是2M山梨醇模拟干旱胁迫条件下两者的生长情况。图8为本发明转&DREB转录因子基因的酵母菌在低温，高温胁迫下的生长实验结果图，其中a为低温胁迫)，b为高温胁迫(42°C )
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步阐述。下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规实验操作进行，如《精编分子生物学实验指南》(F. M奥斯伯，R.E.金斯顿，J. G塞德曼主编，马学军，舒跃龙译，北京 科学出版社，2004)中所述的方法进行实施例1 准噶尔无叶豆中DREB类转录因子&DREB的克隆植物材料的获得本试验中的最初植物材料均为室内光照培养箱内萌发的两周大准噶尔无叶豆幼苗，准噶尔无叶豆种子在播种前用浓度98%硫酸处理10-15min，清水冲洗5次，播种于两层滤纸的玻璃培养皿中，温度25°C，iai/d照光培养，每隔一天添加蒸馏水，两周后收获幼苗并用20 %聚乙二醇6000模拟干旱胁迫，处理无叶豆幼苗，处理4小时后，用蒸馏水冲洗干净植物材料并立即置于液氮中冻存，之后转移至温度-80°C超低温冰箱中保存；准噶尔无叶豆总RNA的提取和反转录RNA提取用TAKARA的RNAiso reagent试剂，具体步骤按说明书进行。经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定后，完整性和纯度都较好的RNA样本可用于下游反转录实验，用1 μ g RNA进行反转录，反转录试剂是TAKARA的I^rimei^cript RT-PCR试剂盒，反转录反应如下5XPrimeScript Buffer 4μ 1PrimerScript 反转录酶混合液1 μ 1Oligo dT 引物(50μΜ) 1 μ 1
总RNA IUg去 RNA 酶的水up to 20 μ 1反转录反应条件为温度37 °C，时间30min ；温度85 °C，时间k ；cDNA全长序列的获得基因保守片段的简并引物扩增根据DREB转录因子家族的AP2保守结构域设计保守片段扩增的简并引物，引物序列见下表的P5，P3引物对
权利要求
1.一种超旱生植物准噶尔无叶豆DREB转录因子^^1 8，其特征在于它具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其中转录因子&DREB为207个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的准噶尔无叶豆DREB转录因子&DREB的基因，其特征在于该基因为核苷酸序列SEQ ID NO 2所示，其中基因编码区长为624bp。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于将所示的核苷酸序列按常规方法进行酵母表达载体构建，酵母表达载体导入宿主，其中宿主为酵母菌株INVkl，得到具备抗逆能力的转EsDREB基因的转化体的功能测试。
4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于该基因在制备植物抗逆性育种和改良的用途。
全文摘要
本发明提供了一种准噶尔无叶豆DREB类转录因子EsDREB基因及其应用，所述蛋白具有SEQ ID No3所示的氨基酸序列，该基因编码区长为624bp，编码207个氨基酸，亚细胞定位实验表明该基因定位在细胞核，酵母单杂交实验证明，该基因作为转录因子具有转录激活活性。同时，转化该基因的酵母菌在干旱，冷，热胁迫下的存活率都高于对照非转基因酵母菌，说明沙漠植物准噶尔无叶豆的DREB类转录因子基因EsDREB具有非生物胁迫的抗性。本发明可以用于作物非生物胁迫转基因育种研究。
文档编号A01H5/00GK102424702SQ20111037796
公开日2012年4月25日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者张远明, 张道远, 李小双, 杨红兰, 蔡明 , 裴金玲 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所