专利名称：一种筛选耐盐性转基因玉米的方法
技术领域：
本发明涉及一种特定种质的筛选方法，特别涉及一种筛选耐盐性转基因玉米的方法。属于作物遗传育种领域。
背景技术：
土壤盐碱化已经成为影响农业生产的重要因素。据统计全世界盐碱地的面积为 9. 5438亿hm2，其中我国为9913万hm2 (郭庆法，2004)。玉米既是重要的饲料和粮食作物，也是极其重要的工业原料，所以大力提高玉米综合生产能力已经成为目前一项紧迫的任务。 玉米是对盐碱中度敏感的作物，只能在氯化钠含量0. 3%以下的土壤上生长，这就极大的限制了玉米在盐碱滩地上的生长(江春梅等，2001)。由于玉米的耐盐性属于数量性状、现有可利用的耐盐种质资源匮乏，想要通过常规育种的方式大幅度的提高玉米的耐盐碱性耗时费力、难度较大。近年来，随着生物技术的迅速发展，其已经广泛应用于玉米的抗逆育种中。 目前利用生物技术培育转基因玉米，是解决当前土壤盐碱化的一条行之有效的途径之一。
利用基因工程技术培育玉米耐盐新种质已成为玉米耐盐新技术育种的重要途径。 刘岩等(1998)将大肠杆菌6-磷酸山梨醉脱氢酶基因gutD转入玉米，使玉米耐盐性明显高于对照。何铭洁等(1999)利用基因枪法成功将甜菜碱醛脱氢酶基因导入玉米。通过对外源基因的分子检测和耐盐性分析，表明目的基因已整合入玉米基因组并正常表达，转基因玉米耐盐胁迫性明显提高。Yin等Q004)将分离于拟南芥的液泡膜Na' /H"反向转运蛋白基因NXtll导入玉米，提高了转基因植株的耐盐胁迫能力。刘祥久等Q005)利用花粉管通道法将抗旱基因和耐盐种质DNA导入玉米自交系。赵磊Q006)用根癌农杆菌介导玉米， 将胆碱单加氧酶基因(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶基(BADH)成功转入玉米自交系。通过对测定玉米愈伤组织、幼苗有关耐盐碱性生理指标的试验表明其抗盐性有一定的提高。付光明等Q006)利用花粉管通通技术将BADH基因导入玉米，并且提高玉米的耐盐性。转基因玉米在盐胁迫条件下所受伤害明显低于非转基因植株。程艳松等O008)将来自于拟南芥的 3个耐盐基因S0S1、S0S2和S0S3导入玉米，抗性愈伤的耐盐碱能力明显高于非转基因愈伤的耐盐碱能力。
对转基因玉米进行耐盐性鉴定，是选育耐盐性转基因新种质的关键步骤。现在小麦、水稻、番茄等作物在这方面的研究比较深入，可以作为玉米耐盐性筛选和鉴定方法研究的参考。目前，国内外对玉米耐盐性筛选和鉴定方法的研究还少有报道，采用的具体方法主要有盐水发芽鉴定法、盆栽鉴定法、海水灌溉和大田自然鉴定法，没有较为理想的对于作物的耐盐碱性的鉴定方法及筛选方法，因此，亟需加强这方面的研究。发明内容
针对现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种用于筛选耐盐性转基因玉米的方法。
本发明方法以玉米幼苗为检测对象，采用特定浓度氯化钠处理一定时间后，通过检测与耐盐性显著相关的生理生化指标，进行数据处理后与受体对照相比较，根据数值来评价转基因玉米耐盐能力，以达到建立一个客观准确的转基因玉米耐盐性评价方法的目的，并可进一步作为玉米耐盐性筛选和鉴定方法研究的参考。
本发明的目的是这样实现的
一种用于筛选耐盐性转基因玉米的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)玉米种子萌发
挑选供试发育良好的转基因玉米种子和非转基因受体对照种子，按照常规方法发芽；
(2)温室内玉米种子播种
取芽长一致的种子播种在装有等量蛭石的花盆中，每天用适量的l/2H0agland营养液浇灌，温室中培养；
(3)玉米幼苗盐胁迫处理
幼苗长至三叶一心期时，每天用含有300mmol/L NaCl的l/2Hoagland营养液浇灌处理；
(4)玉米叶片生理生化指标的检测
处理7d后，取玉米幼苗的第3片真叶的叶中部位0. Ig左右，测定幼苗的各项生理生化指标；
(5)玉米耐盐能力评价
对生理生化指标检测结果按照新复极差法进行方差分析和多重比较，依据生理生化指标的差异显著性测验结果进行赋值，a = l，b = 2，c = 3......以此类推，有字母重叠时只计第一个字母，并计算各项生理生化指标的平均值，依据转基因后代株系的平均值与非转基因受体对照值的差χ进行分级，分级标准为平均值与对照值之差χ < 0. 5，则转基因玉米比对照耐盐性提高0级，耐盐性无提高；平均值与对照值之差0. 5 < χ < 1. 2，则转基因玉米比对照耐盐性提高1级，耐盐性小幅提高；平均值与对照值之差1. 2 < χ < 1. 9， 转基因玉米比对照耐盐性提高2级，耐盐性明显提高；平均值与对照值之差1. 9 < X，转基因玉米比对照耐盐性提高3级，耐盐性大幅提高；
(6)根据步骤( 所述的分级标准对供试玉米进行分级，根据需要选择具有耐盐性的转基因玉米。
优选的，为保持处理浓度的恒定，步骤(3)中所述的含有300mmol/L NaCl的 l/2H0agland营养液，其每浇灌一次的用量为蛭石持水量体积的二倍。
本发明所述的方法，其特征在于步骤中所述的生理生化指标包括超氧化物歧化酶SOD活性、过氧化物酶POD活性、过氧化氢酶CAT活性、相对电导率、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量其中几种或全部。
本发明相对于现有的技术而言所具有的主要优点和效果如下
1.适应范围广。
本发明的一种用于筛选耐盐性转基因玉米的方法除适用于筛选具有耐盐性的转基因玉米外，也适用于筛选具有耐盐性的普通玉米种质。
2.评价标准数值化，更客观准确。
在筛选耐盐性转基因玉米的过程中，由于玉米受体自身的耐盐性级别较高，比受4体材料耐盐性有明显提高的材料无法进行准确评价。本发明利用玉米苗期盐胁迫后与抗逆性相关的生理生化指标的变化，建立了新的耐盐性评定体系，能够更客观的反应转基因材料比受体耐盐性提高的程度。
3.本发明易于掌握，重复性高。
本发明使用转基因玉米幼苗作为评价筛选对象，试验材料容易获得，一次可同时评价大量转基因植株，操作方法易于掌握，重复性高。
本发明的主要创造点在于
(1)本发明对转基因玉米苗期进行盐胁迫处理，针对幼苗盐胁迫后与抗逆性相关的生理生化指标的变化进行了详细的研究，确立了耐盐碱性评价的分级标准，建立了一种筛选耐盐性转基因玉米的方法。
(2)本发明以转基因玉米幼苗作为评价对象，试验材料易于获取，试验周期短，效率高。
(3)本发明的一种筛选耐盐性转基因玉米的方法具有适用范围广的特点，将评价标准数值化，更客观准确，适用于筛选转基因玉米与受体相比耐盐性提高程度不同的玉米种质。
图1是发明的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1
1试验材料
7份玉米非转基因受体常规自交系及32份转BcWRKYI基因的玉米T2代株系均由东北农业大学玉米研究所提供，见表1。
表132份供试玉米转基因材料
权利要求
1.一种筛选耐盐性转基因玉米的方法，其特征在于包括以下步骤(1)玉米种子萌发挑选供试发育良好的转基因玉米种子和非转基因受体对照种子，按照常规方法发芽；(2)温室内玉米种子播种取芽长一致的种子播种在装有等量蛭石的花盆中，每天用适量的l/2H0agland营养液浇灌，温室中培养；(3)玉米幼苗盐胁迫处理幼苗长至三叶一心期时，每天用含有300mmol/L NaCl的l/2Hoagland营养液浇灌处理；(4)玉米叶片生理生化指标的检测处理7d后，取玉米幼苗的第3片真叶的叶中部位0. Ig左右，测定幼苗的各项生理生化指标；(5)玉米耐盐能力评价对生理生化指标检测结果按照新复极差法进行方差分析和多重比较，依据生理生化指标的差异显著性测验结果进行赋值，a = l，b = 2，c = 3......以此类推，有字母重叠时只计第一个字母，并计算各项生理生化指标的平均值，依据转基因后代株系的平均值与非转基因受体对照值的差χ进行分级，分级标准为平均值与对照值之差χ ^ 0. 5，则转基因玉米比对照耐盐性提高0级，耐盐性无提高；平均值与对照值之差0. 5 < χ < 1. 2，则转基因玉米比对照耐盐性提高1级，耐盐性小幅提高；平均值与对照值之差1. 2 < χ < 1. 9，转基因玉米比对照耐盐性提高2级，耐盐性明显提高；平均值与对照值之差1. 9 < X，转基因玉米比对照耐盐性提高3级，耐盐性大幅提高；(6)根据步骤( 所述的分级标准对供试玉米进行分级，根据需要选择具有耐盐性的转基因玉米。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的含有300mmOl/LNaCl的 l/2H0agland营养液，其每浇灌一次的用量为蛭石持水量体积的二倍。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的生理生化指标包括超氧化物歧化酶SOD活性、过氧化物酶POD活性、过氧化氢酶CAT活性、相对电导率、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量其中几种或全部。
全文摘要
本发明公开了一种筛选耐盐性转基因玉米的方法，它包括以下步骤(1)玉米种子萌发、(2)温室内玉米种子播种、(3)玉米植株盐胁迫处理、(4)玉米叶片生理生化指标的检测、(5)玉米耐盐能力评价和(6)选择具有耐盐性的转基因玉米。本发明的方法建立了一个适合玉米苗期耐盐性评价的方法，该体系以玉米幼苗为检测对象，用氯化钠溶液灌浇处理后，通过对植株生理生化指标的检测，达到建立一个客观准确的转基因玉米耐盐性评价方法的目的，从而为耐盐性转基因玉米的筛选提供可靠的依据。
文档编号A01H1/04GK102524054SQ20111043015
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者刘显君, 单长建, 张 林, 曾兴, 李新海, 王振华, 翁建峰, 芦翠华, 邸宏 申请人:东北农业大学