专利名称：一种根癌农杆菌介导普通春性小麦成熟胚转化体系的方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种根癌农杆菌介导普通春性小麦成熟胚转化体系的方法。
背景技术：
利用植物基因工程技术，通过打破物种之间的界限，将优良的目的基因(抗逆、高产、优质等性状)对作物进行有目的改造，获得的转基因作物在产量、抗逆能力以及品质等方面得到显著改进，以满足人类的需要。小麦是世界第一大粮食作物，转基因小麦的研究一直是众多学者研究的重点。但是与其它作物相比，小麦的转基因研究明显落后。自从Vasil 等(1993) (Vasil et al，Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos. Bio-Technology 1993，11 :1553-1558)首次报道了外源基因导入小麦并整合和遗传之后，国内外又有多例小麦转基因成功的报道， 不过获得的转基因小麦基本上都是以幼胚作为外植体，而且多数转基因小麦是通过基因枪法转化获得的。然而，基因枪转化法存在成本高、转化效率低、外源基因拷贝数多等缺点。相比之下，农杆菌法具有(1)转化效率高；( 拷贝数少，单拷贝出现频率大；C3)能够转移较大的DNA片段；(4)结构变化较小，在转基因表达和遗传稳定性方面具有明显的优越性； (5)操作简单、成本低等优点成为近年来人们研究的热点。常用的小麦外植体有幼胚、幼穗、幼叶、子叶中层、种子、顶端分生组织、成熟胚等， 但最好的外植体是幼胚和幼穗，其组织培养的愈伤组织诱导和植株再生能力最高。但是由于小麦的生长周期长，用于遗传转化的小麦幼胚的取材受到时间和空间限制。而收获后的种子能长期保存，如果用成熟胚为材料进行遗传转化，将节省大量资源和时间，克服生长季节的局限，为试验的取材提供极大的方便。然而，小麦成熟胚培养一般耗时长，组培效率低， 限制了成熟胚在小麦组织培养和遗传转化中的应用。在小麦成熟胚培养过程中，小麦高频再生系统是提高转化率的首要保证。其中基因型和培养基中激素类型、配比是最重要的影响因素。国内外学者对于培养基中激素类型和配比研究结果各不相同。其中，2，4-D是小麦成熟胚培养中应用最广泛的生长调节剂，每升培养基中添加2mg 8mg的2，4-D即能够诱导愈伤组织；细胞分裂素KT在某种程度上能够拮抗高浓度2，4-D对愈伤组织分化的抑制作用，对愈伤组织有一定的毒害作用，而不建议在诱导愈伤培养基中添加。外源基因通过农杆菌介导法转化小麦的效率，不仅与小麦基因型、培养基关系密切，还与培养时间、农杆菌类型、浓度和侵染时间有关。甚至有的研究认为不同农杆菌对同一基因型小麦的侵染能力也不同。因此寻找高效的小麦成熟胚培养基因型，建立起完善的高效率成熟胚转化体系，是小麦研究工作者的一个重要课题，对小麦转基因研究将有巨大的推动作用
发明内容
本发明的目的在于，提供一种根癌农杆菌介导普通春性小麦成熟胚转化体系的方法，该方法适用于进行小麦转基因，可成功获得小麦转基因植株。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种根癌农杆菌介导普通春性小麦成熟胚转化体系的方法，其特征在于，在进行目的基因转化时，选用再生能力较强的春性小麦品种成熟胚愈伤组织为材料，接种于小麦成熟胚培养基，然后用带有目的基因的农杆菌菌株EHA105侵染成熟胚愈伤组织，愈伤组织经潮霉素筛选后得到抗性愈伤组织，经过愈伤组织诱导、根癌农杆菌侵染、除菌培养、预分化筛选培养、分化培养和生根培养，获得转基因植株。所述的小麦成熟胚培养基是以MS基本培养基为基础，其中含有MS基本培养基的大量元素、MS基本培养基的微量元素、MS基本培养基的铁盐、MS基本培养基的有机成份， 在其中添加2，4-D、细胞分裂素KT、天门冬酰胺、水解酪蛋白、玉米素ZT、6-BA、乙酰丁香酮 AS、羧苄青霉素cb、潮霉素hpt、蔗糖或琼脂，制成诱导培养基、侵染培养基、共培养基、除菌培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基。所述的诱导培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0.5mg/L，天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂的浓度为7g/ L ； 所述侵染培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，乙酰丁香酮AS的浓度为200ymol/L，蔗糖浓度为30g/L。所述共培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，乙酰丁香酮AS的浓度为200 μ mol/L ；蔗糖浓度为30g/L ；琼脂的浓度为7g/L。所述的除菌培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，蔗糖浓度为30g/L ；琼脂的浓度为7g/L。所述的预分化培养基中，6-BA浓度为0. 5mg/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L，羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，潮霉素hpt浓度为5mg/L，蔗糖浓度为30g/L ；琼脂的浓度为 7g/L ；所述分化培养基中，玉米素ZT浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，潮霉素hpt浓度为10mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂的浓度为7g/ L；所述生根培养基中，采用1/2MS基本培养基，羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，蔗糖浓度为15g/L，琼脂的浓度为7g/L。所述愈伤组织诱导方法为将当年收获的成熟小麦种子用0. 1 % HgCl2消毒处理20min，用蒸馏水清洗3_4次， 小麦种子在消毒后于25°C条件下用蒸馏水浸泡12-15小时，将浸泡后的小麦种子于超净工作台用75%的乙醇浸泡3min，用无菌水冲洗2-3次，再用0. 1 % HgCl2消毒15min，无菌水冲洗4-5次，在超净工作台中剥离完整的胚，用解剖刀切去胚根，盾片向上，接种于接种诱导培养基中，在M-25°C黑暗条件下诱导培养愈伤组织7天培养。
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所述根癌农杆菌侵染方法为将接种于诱导培养基中的小麦成熟胚愈伤组织转入到灭过菌的培养皿里，将准备好的农杆菌倒入愈伤组织中侵染20min，将浸染后的愈伤组织放到灭过菌的滤纸上15min， 吸干菌液后的愈伤组织接种于放有一层滤纸的共培养基上，25°C黑暗条件共培养3天。所述除菌培养方法为将共培养后的愈伤组织，按照培养后愈伤组织的情况进行分类，转接到除菌培养基上，25°C光照条件下培养1星期；所述预分化筛选培养方法为将除菌培养后的愈伤组织转接到预分化筛选培养基上，25°C光照条件下培养2星期。所述分化培养方法为将预分化培养后的愈伤组织转接到分化培养基上，25°C光照条件下培养6星期， 每两周继代一次。所述生根培养方法为将分化后的愈伤组织转接到生根培养基上，25°C光照条件下培养3星期。采用本发明的方法，经测定，可以稳定得到目标基因的转基因小麦植株。
图1是春小麦(张春19号)的实施部分图片，其中图I-A表示诱导的春小麦愈伤组织生长情况；图I-B表示愈伤组织与农杆菌共培养情况；图I-C和图I-D表示潮霉素筛选后的愈伤组织分化效果；图I-E和图I-F表示筛选后的小麦植株生长情况；图2为春小麦(张春19号)Ttl代转基因植株的潮霉素基因PCR检测电泳图。以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明，需要说明的是，本发明不限于这些实施例。
具体实施例方式在以下的实施例中，所述的小麦成熟胚培养基以目前使用最普遍的MS基本培养基为基础，MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。本发明在MS基本培养基中添加2，4-D、细胞分裂素KT、天门冬酰胺、水解酪蛋白、玉米素ZT、 6-BA、乙酰丁香酮AS、羧苄青霉素cb、潮霉素hpt、蔗糖或琼脂，分别制成诱导培养基、侵染培养基、共培养基、除菌培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基。下述实施例中所涉及的农杆菌EHA105是本领域公知的，实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例1 农杆菌EHA105转化春小麦(张春19号)成熟胚愈伤组织一、培养基的配制和灭菌1、诱导培养基MS+2mg/L 的 2，4_D+0. 5mg/L 的细胞分裂素 KT+500mg/L 的水解酪蛋白 +150mg/L 的天门冬酰胺+3%的蔗糖+0. 7%的琼脂；配制过程10XMS 大量 100ml、1000XMS 微量 lml、200 XMS 铁盐 5ml、100 XMS 有机5ml，加入天门冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、蔗糖30g、2，4_D ang、细胞分裂素KTO. 5mg、 琼脂7g，加入500ml蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至6. 0，以上成分采用121 °C， 高压湿热灭菌20分钟，放置2-3天后可以接胚。2、侵染培养基MS+2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L细胞分裂素KT+500mg/L水解酪蛋白 +150mg/L天门冬酰胺+3%葡萄糖+200 μ mol/L乙酰丁香酮AS配制过程10XMS 大量 IOOml、1000 XMS 微量 Iml、200 XMS 铁盐 5ml、100 XMS 有机 5ml，加入天门冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、葡萄糖30g、2，4_D ang、细胞分裂素KTO. 5mg, 加入500ml蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至5. 5，以上成分采用121 °C，高压湿热灭菌20分钟，乙酰丁香酮AS过滤灭菌后加入到上述高压灭菌后的培养基中。3、共培养基MS+2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L细胞分裂素KT+500mg/L水解酪蛋白 +150mg/L天门冬酰胺+3%蔗糖+0. 7%琼脂+200 μ mol/L乙酰丁香酮AS配制过程10XMS 大量 IOOml、1000 XMS 微量 Iml、200 XMS 铁盐 5ml、100 XMS 有机 5ml，加入天门冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、葡萄糖30g、琼脂7g、2，4_D ang、细胞分裂素 ΚΤ0. 5mg，加入500ml蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至5. 5，以上成分采用121 °C， 高压湿热灭菌20分钟，乙酰丁香酮AS过滤灭菌后加入到上述高压灭菌后的培养基中。4、除菌培养基MS+2mg/L2,4-D+0. 5mg/L 细胞分裂素 KT+500mg/L 水解酪蛋白 +150mg/L 天门冬酰胺+3%蔗糖+0. 7%琼脂+500mg/L羧苄青霉素cb配制过程10XMS 大量 IOOml、1000 XMS 微量 Iml、200 XMS 铁盐 5ml、100 XMS 有机 5ml，加入天门冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、葡萄糖30g、琼脂7g、2，4_D ang、细胞分裂素 ΚΤ0. 5mg，加入500ml蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至6. 0，以上成分采用121 °C，
高压湿热灭菌20分钟，羧苄青霉素cb加入到上述高压灭菌后的培养基中。5、预分化培养
基MS+0. 5mg/L 6_BA+500mg/L 水解酪蛋白 +3%蔗糖 +0. 7%琼脂 +500mg/L 羧苄青霉素cb+5mg/L潮霉素hpt配制过程10XMS 大量 100ml、1000XMS 微量 lml、200 XMS 铁盐 5ml、100 XMS 有机5ml，加入天门冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、蔗糖30g、琼脂7g、6_BA0. 5mg，加入500ml 蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至6. 0，以上成分采用121，高压湿热灭菌20°C分钟，潮霉素hpt、羧苄青霉素cb加入到上述高压灭菌后的培养基中。6、分化培养基MS+2mg/L玉米素ZT+0. 5mg/L细胞分裂素KT+3%蔗糖+0. 7%琼脂+500mg/L羧苄青霉素cb+10mg/L潮霉素hpt配制过程10XMS大量 100ml、1000XMS 微量 lml、200XMS 铁盐 5ml、100XMS 有机5ml，加入天门冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、蔗糖30g、琼脂7g、2，4_D ang、细胞分裂素 ΚΤ0. 5mg，加入500ml蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至6. 0，以上成分采用121 °C， 高压湿热灭菌20分钟，潮霉素hpt、羧苄青霉素cb加入到上述高压灭菌后的培养基中。7、生根培养基
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1/2MS+1. 5% /L 蔗糖 +0. 7% 琼脂 +500mg/L 羧苄青霉素 cb配制过程10XMS 大量 50ml、1000 XMS 微量 0. 5ml、200 XMS 铁盐 2. 5ml、100 XMS 有机2. 5ml、蔗糖15g、琼脂7g、加入500ml蒸馏水煮沸，定容至1000ml，然后调节pH至6. 0， 以上成分采用121°C，高压湿热灭菌20分钟，羧苄青霉素cb加入到上述高压灭菌后的培养基中。二、实验过程1、愈伤组织诱导将当年收获的春小麦(张春19号)成熟小麦种子用0. 1% HgCl2 消毒处理20min，用蒸馏水清洗3-4次，小麦种子在消毒后于25°C条件下用蒸馏水浸泡 12-15小时，将浸泡后的小麦种子于超净工作台用75%的乙醇浸泡;3min，用无菌水冲洗2-3 次，再用0. 1% HgCl2消毒15min，无菌水冲洗4_5次，在超净工作台中剥离完整的胚，用解剖刀切去胚根，盾片向上，接种于培养基诱导培养基中，在M_25°C黑暗条件下诱导培养愈伤组织7天。2、根癌农杆菌侵染①农杆菌EHA105的培养挑取含有Pcambia1305质粒农杆菌单菌落，接种于5mL 的LB液体培养基，加卡纳霉素50mg/L，利富平50mg/L，28°C、180r摇菌培养36 40h，0D600 值约为0.6 0.8，按1 50的比例于侵染液，28°C、180r摇菌扩大培养至0D600值0.6。②将小麦成熟胚愈伤组织转入到灭过菌的培养皿里，将准备好的农杆菌(0D = 0. 6)倒入愈伤组织中侵染20min、将浸染后的愈伤组织放到灭过菌的滤纸上15min吸干菌液，吸干菌液后的愈伤组织接种于放有一层滤纸的的共培养基上，用报纸包裹，25°C黑暗条件共培养3天。3、除菌培养将共培养后的愈伤组织，按照培养后愈伤组织的情况进行分类(长菌少的为一类，长菌多的为一类)，转接到除菌培养基上，25°C光照条件下培养1星期。4、预分化筛选培养将除菌培养后的愈伤组织转接到预分化筛选培养基上，25°C 光照条件下培养2星期。5.分化培养将预分化培养后的愈伤组织转接到预分化筛选培养基上，25°C光照条件下培养6星期，每两周继代一次。6.生根培养将分化后的愈伤组织转接到生根培养基上，25°C光照条件下培养3星期。三、转基因植株分子检测提取抗性再生植株叶片基因组DNA，以其为模板，以hpt引物扩增潮霉素基因，其中上游引物5‘ -GGACGCAACGCCTACGACTGGAC-3 ‘；下游引物5‘ -TCATCGCAAGACCGGCAACAGGA-3 ‘。PCR反应条件为先94°C预变性5min，然后94°C变性30sec，56°C复性30sec，72°C 延伸lmin，共计35个循环，最后再72°C延伸lOmin。PCR扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，检测情况如图2所示。表明成功获得了转基因植株。
权利要求
1.一种根癌农杆菌介导普通春性小麦成熟胚转化体系的方法，其特征在于，在进行目的基因转化时，选用再生能力较强的春性小麦品种成熟胚愈伤组织为材料，接种于小麦成熟胚培养基，然后用带有目的基因的农杆菌菌株EHA105侵染成熟胚愈伤组织，愈伤组织经潮霉素筛选后得到抗性愈伤组织，经过愈伤组织诱导、根癌农杆菌侵染、除菌培养、预分化筛选培养、分化培养和生根培养，获得转基因植株。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的小麦成熟胚培养基是是MS基本培养基为基础，在MS基本培养基中添加2，4-D、细胞分裂素KT、天门冬酰胺、水解酪蛋白、玉米素 ZT、6-BA、乙酰丁香酮AS、羧苄青霉素cb、潮霉素hpt、蔗糖或琼脂，分别制成诱导培养基、侵染培养基、共培养基、除菌培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述的诱导培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂的浓度为7g/L ；所述侵染培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，乙酰丁香酮AS的浓度为200 μ mol/L，蔗糖浓度为30g/L ；所述共培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，乙酰丁香酮AS的浓度为200 μ mol/L ；蔗糖浓度为30g/L ；琼脂的浓度为7g/L ；所述的除菌培养基中，2，4-D浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L，天门冬酰胺浓度为150mg/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，蔗糖浓度为 30g/L ；琼脂的浓度为7g/L ；所述的预分化培养基中，6-BA浓度为0. 5mg/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L，羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，潮霉素hpt浓度为5mg/L，蔗糖浓度为30g/L ；琼脂的浓度为7g/L ； 所述分化培养基中，玉米素ZT浓度为ang/L，细胞分裂素KT浓度为0. 5mg/L,羧苄青霉素cb浓度为500mg/L，潮霉素hpt浓度为10mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂的浓度为7g/L ； 所述生根培养基采用1/2MS基本培养基,加入羧苄青霉素cb、蔗糖和琼脂,其中，羧辛青霉素cb浓度为500mg/L，蔗糖浓度为15g/L，琼脂的浓度为7g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于 所述愈伤组织诱导方法为将当年收获的成熟小麦种子用0. 1% HgCl2消毒处理20min，用蒸馏水清洗3_4次，小麦种子在消毒后于25°C条件下用蒸馏水浸泡12-15小时，将浸泡后的小麦种子于超净工作台用75%的乙醇浸泡3min，用无菌水冲洗2_3次，再用0. 1 % HgCl2消毒15min，无菌水冲洗4-5次，在超净工作台中剥离完整的胚，用解剖刀切去胚根，盾片向上，接种于诱导培养基中，在M-25°C黑暗条件下诱导培养愈伤组织7天培养； 所述根癌农杆菌侵染方法为将接种于诱导培养基中的小麦成熟胚愈伤组织转入到灭过菌的培养皿里，将准备好的农杆菌倒入愈伤组织中侵染20min，将浸染后的愈伤组织放到灭过菌的滤纸上15min，吸干菌液后的愈伤组织接种于放有一层滤纸的共培养基上，25°C黑暗条件共培养3天； 所述除菌培养方法为将共培养后的愈伤组织，按照培养后愈伤组织的情况进行分类，转接到除菌培养基上， 25°C光照条件下培养1星期； 所述预分化筛选培养方法为将除菌培养后的愈伤组织转接到预分化筛选培养基上，25°C光照条件下培养2星期； 所述分化培养方法为将预分化培养后的愈伤组织转接到分化培养基上，25°C光照条件下培养6星期，每两周继代一次；所述生根培养方法为将分化后的愈伤组织转接到生根培养基上，25°C光照条件下培养3星期。
全文摘要
本发明公开了一种根癌农杆菌介导普通春性小麦成熟胚转化体系的方法。该方法在利用根癌农杆菌进行转基因小麦研究时，选用筛选出的具有再生能力较强的小麦品种为材料，取当年成熟种子籽粒，经种子灭菌，在超净工作台中剥取成熟胚，盾片向上，接种于成熟胚诱导愈伤培养基上。以农杆菌菌株EHA105，菌液浓度OD600值为0.6，感染预培养6-7天的小麦成熟胚愈伤组织，经共培养，除菌，恢复培养和分化成苗，将农杆菌中的目标基因导入普通春性小麦。用本发明的方法，经测定，可以稳定得到目标基因的转基因小麦植株。
文档编号A01H4/00GK102559744SQ20111045478
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者刘迎团, 宋成丽, 徐虹, 王军卫 申请人:西北农林科技大学