专利名称：一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法
技术领域：
本发明涉及一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法。
背景技术：
全国组织培养室超过1000个，组织培养技术广泛用于农作物、果树、蔬菜、林木、观赏植物及中药材等近400种经济植物，在快繁和脱毒等方面取得了巨大的社会经济效益。因成本过高，组织培养的商业利用受极大限制，无法符合市场对高质量组培苗、低价位成本的需求。因此，降低成本是组培技术更成功商品化的首要条件。在降低组织培养的培养基成本方面，多采用增加繁殖系数的方法，但繁殖系数的增加导致组培苗质量的降低，不但玻璃苗的比例显著提高，而且严重影响其后续的生长。琼脂是目前各种生物培养基中应用最广泛的一种凝固剂，不仅用量巨大且是所有药品中最贵的一种，占药品成本的70%以上。仅组培级琼脂的市场价就高达160元/kg以上，常用的成本每升就高达8元以上。淀粉是植物体中贮存的养分，是食物的重要组成部分，水稻中含淀粉629Γ86%，但普通水稻品种的淀粉凝固抗性很低，胶体结构不稳定，难以直接或改性利用。直链淀粉在水中加热糊化后，不稳定且会迅速老化而逐步形成凝胶体，但这种凝胶体较硬，需高温才反向转化；支链淀粉在水溶液中稳定，凝胶柔软，且凝胶其强度随温度变化是可逆的。淀粉分支酶基因sbenb是调控淀粉合成的关键酶，可以优化促进直链淀粉的合成，实现直链淀粉及其凝胶特性的显著改良。
发明内容
正是在上述背景下，本发明的目的是提供一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法，选用低直链淀粉含量籼稻为基础，通过淀粉分支酶基因优化促进直链淀粉的合成，获得淀粉凝胶性能兼顾直链与支链双重特性的水稻，创制高凝抗性且胶体结构稳定的新型淀粉基质，替代琼脂，发展新型生物培养生物基质，
广泛用于科研、医学和化工。本发明的淀粉基质专用水稻的转基因培育方法，包括以下步骤
1)取直链淀粉含量介于109Γ15%的水稻品种的成熟胚为外植体，接种至诱导培养基，在25士 1°C、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；
2)将诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；
3)将成倍增殖的愈伤组织，在25士1°C、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；
4)将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25士 1°C、避光的黑暗条件下共培养2天；
5)将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25士1°C、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继1次；
6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25士1°C、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指包括目的基因淀粉分支酶基因sbellb、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因淀粉分支酶基因sbenb片段长64;3bp ；
7)取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，鉴定淀粉凝胶性能，选留淀粉糊化冷却后可形成半固态凝胶的转基因植株；
8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，评价的淀粉凝抗性表达稳定性，对淀粉凝抗性稳定的优良株系进行种子繁殖，为培育的淀粉基质专用水稻。本发明中，所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5.8。本发明中，所说的继代培养基为N6基本培养基添加2，4-D Img蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH 灭菌前 5. 8。本发明中，所说的共培养基为N6基本培养基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 8。本发明中，所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2，4-D 0. 5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。本发明中，所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BAlmg、NAA0. 5mg、KT0. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。上述的N6 基本培养基为 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeSO4 · 7H2027. 8mg, Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg, H3BO3 1. 6mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0. 5mg、维生素 B6 0. 5mg、维生素Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。本发明中，所说的农杆菌的菌株为EHA105，内含质粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA区域携带目的基因的插入序列，包括淀粉分支酶基因sbenb、标记基因葡糖苷酸酶基因⑶S和筛选基因抗潮霉素基因HPT。淀粉分支酶基因sbenb片段长64;3bp，与玉米启动子W3i-l、35S和nos终止子共同构成表达框架。菌株为EHAlO方便购买或赠送获得，在一般植物遗传实验室均有保存，参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38 (12) :2395-对02。本发明中，所说的标记基因葡糖苷酸酶基因⑶S的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989，(6): 168-169，筛选基因抗潮霉素基因HPT的分子检测方法参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38 (1 :2395_对02。本发明中，所说的淀粉凝胶性能的测定方法，参见文献杜先锋等，农业工程学报，2001，17(2): 16-19。上述的稳定性是指入选水稻中抗性淀粉含量在不同年份间(2年以上)、季节间(2季以上)以及地点间(2个地点以上)的含量变化不显著。本发明的淀粉基质专用转基因水稻，具有以下优点
本发明首先利用淀粉分支酶基因sbenb针对性优化调控直链淀粉含量109Γ15%水稻的淀粉回生特性。这种转基因水稻的淀粉，具有良好的凝胶特性，与普通水稻、玉米、小麦等淀粉类作物的普通品种的淀粉凝抗性完全不同，可作为新颖生物培养基质，广泛用于科研、食品、医药和化工。
图1是本发明所用的目的基因插入序列的载体构建示意图。
具体实施例方式以下通过具体实例进一步说明本发明。实施例1
以直链淀粉含量13. 6%水稻品种“嘉育948”的成熟胚为外植体，接种至诱导培养基，在25 士 1°C、光强3000勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织；
将诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖
期；
将成倍增殖的愈伤组织，在25士 1°C、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2
天；
将经过预培养的愈伤组织(约500个培养皿，含2000块以上的愈伤组织)，在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25士 1 °C、避光的黑暗条件下共培养2天；
取上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25士 1°C、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织(约210块愈伤组织)，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继1次；
取3轮筛选后的抗性愈伤组织(约50块愈伤组织)，转移至分化培养基，诱导分化成苗78株，对抗性植株进行标记基因GUS组织化学染色和筛选基因HPT分子检测，选留含目的基因淀粉分支酶基因sbenb插入序列的转基因植株56株，目的基因插入序列的载体构建如图1所示；
取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，测定淀粉凝胶性能，选留淀粉糊化冷却后可形成半固态凝胶的转基因植株11株；
2008-2010连续3年，分别在浙江杭州(春季)、浙江富阳(夏季)、海南陵水(冬季)三地三季评价淀粉凝抗性的表达稳定性，最终培育淀粉基质专用水稻3个，T-NJ-U T-NJ-2、T-NJ-3，其淀粉糊化冷却后可形成稳定的半固态凝胶，而原直链淀粉含量水稻品种“嘉育948”则根本无法形成半固态的凝胶。
权利要求
1.一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法，包括以下步骤1)取直链淀粉含量介于109Γ15%的水稻品种的成熟胚为外植体，接种至诱导培养基，在25 士 1°C、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；2)将诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；3)将成倍增殖的愈伤组织，在25士1°C、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；4)将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25士 1°C、避光的黑暗条件下共培养2天；5)将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25士1°C、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继1次；6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25士1°C、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指包括目的基因淀粉分支酶基因sbenb、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因sbellb片段长643bp ；7)取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，鉴定淀粉凝胶性能，选留淀粉糊化冷却后可形成半固态凝胶的转基因植株；8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，评价的淀粉凝抗性表达稳定性，对淀粉凝抗性稳定的优良株系进行种子繁殖，为培育的淀粉基质专用水稻。
2.根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 8。
3.根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的继代培养基为N6基本培养基添加2，4-D Img蔗糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 8。
4.根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的共培养基为N6基本培养基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g、和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前 5. 8。
5.根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2，4-D 0.5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g, pH 灭菌前 5. 8。
6.根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BAlmg、NAAO. 5mg、KTO. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH 灭菌前 5. 8。
7.根据权利要求2-6所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的N6基本培养基为 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg, Na2-EDTA · 2H2037. 3mg,H3BO3 1. 6mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0. 5mg、维生素 B6 0. 5mg、维生素 Bl 0. 5mg 和甘氨酸2mg。
全文摘要
本发明涉及一种淀粉基质专用水稻的转基因培育方法，步骤包括取低直链淀粉含量的水稻品种的成熟胚为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至成倍增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养转化，转移到筛选培养基进行3轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，鉴定含目的基因的分化小苗，对入选的转基因植株测定淀粉凝胶性能，选留淀粉糊化冷却后可形成半固态凝胶的转基因植株，继续种植评价的淀粉凝抗性表达稳定性，对淀粉凝抗性稳定的优良株系进行种子繁殖，最终培育淀粉基质专用水稻。本发明的淀粉基质专用水稻，可作为新颖生物培养基质，广泛用于科研、食品、医药和化工。
文档编号A01H4/00GK102550414SQ20121000510
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者吴殿星, 张宁, 舒小丽 申请人:浙江大学