专利名称：一种耐盐薄荷的组培快繁方法
技术领域：
本发明涉及一种耐盐薄荷的组培快速繁殖的技术，本发明属于农业生物技术领域。
背景技术：
土壤盐溃化问题是困扰农业生产的一大难题。当前，世界上灌溉地面积约为230Mhm2，其中遭盐害影响的土壤约占45M hm2。旱地农业面积约为1500M hm2，其中遭盐害影响的土壤约占32M hm2。耕地土壤盐溃化的退化面积正在以3 hm2/min的速度增长。据FAO估计，世界范围内，每年由于盐害造成土地生产力丧失的面积达0. 25、. 50M hm2。参见王小彬，关注水资源利用与气候变化对土壤盐溃化的重叠影响(中国土壤与肥料，2009 (2) :80)。就我国而言，在I亿hm2耕地中有667万hm2盐碱化土壤,另有0. 346亿hm2盐碱荒地。贾利霞，NaCl胁迫对苜蓿种子萌发的影响(内蒙古草业，2008，20 (I) :40_42)。随着我国人口的剧增及工业的高速发展，可耕地面积急剧下降，同时，不合理灌溉又造成了大量良田的次生盐溃化。因此，开发和利用大面积的盐溃化土地，利用耐盐植物资源发展盐溃地生态农业十分必要。本发明所涉及的耐盐薄荷是山东省科学院中日友好生物技术研究中心通过测定NaCl胁迫后薄荷的叶片含水量、渗透势、电导率和MDA含量以及CAT酶活性等生理反映指标筛选出的，耐受NaCL胁迫浓度为0. 8%。系椒样薄荷(Mentha piperita L.)的一种，购自北京蔬菜研究中心蔬菜种质资源与特菜引种研究室。耐盐薄荷除具有薄荷的一般功效夕卜，作为耐盐碱的药赏两用植物逐渐被关注。由于椒样薄荷是水薄荷与绿薄荷杂交而成的一个不育性中间类型，仅以分株繁殖为主。(参见陈英，植物体细胞无性系变异与育种南京江苏科学技术出版社，1991: 1-10)。耐盐薄荷长期采用无性繁殖，易发生病毒病，引起品种退化和产量、质量的下降，造成耐盐薄荷种质资源匮乏。因此需要研究开发一种适用于耐盐薄荷的组培快繁方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐盐薄荷的组培快繁技术。本发明以耐盐薄荷茎段为外植体，采用不同发育期茎段分开消毒的方法，对其离体培养及植株再生条件进行了研究，为耐盐薄荷的品种改良和快速繁殖奠定了重要的基础。本发明所述的耐盐薄荷的组培快繁方法包括外植体无菌处理、愈伤诱导培养、不定芽增值培养、生根培养、耐盐变异体的筛选、组培苗的驯化与移栽各步骤，其技术要点包括采用不同生育期的茎段分开灭菌的方法，建立外植体无菌系；愈伤诱导培养基的筛选；不定芽增值培养基的筛选；生根培养基的筛选；耐盐变异体的筛选；组培苗的驯化与移栽方法。具体操作步骤和工艺条件如下I.外植体无菌系的建立
从苗圃中取生长旺盛的薄荷植株，去叶留茎和芽点，流水冲洗20 min后，滤纸吸干水分，用手术剪对外植体进行修剪，截取3cm长茎段，然后将不同生育期的茎段(茎尖、中部茎段、基部茎段)分开，备用。在超净工作台上用75 %酒精溶液消毒IOs 60s、0. I %升汞溶液消毒8 15 min后，用无菌水冲洗4 5遍，吸干水后再用手术剪对外植体进行修剪，去除两端发黑部分，然后将其接种在1/2MS培养基中，置于光照培养箱中培养。3天后观察植株的污染情况，统计污染率(表I)。经试验确定薄荷茎段采用75 %酒精30 60s +0. I %升汞溶液消毒8 lOmin，可将外植体的污染率控制在1%以下，且消毒液对不同生育期的茎段无损害。2.愈伤诱导培养基的筛选采用正交试验L4(23)筛选。选取3cm长的健壮无菌苗，置于培养基中，进行愈伤的诱导。培养30 d后，调查愈伤诱导率(表2、表3)。愈伤诱导率=茎段愈伤形成个数/接种的茎段个数X 100%。 经试验确定NAA是耐盐薄荷诱导愈伤能力的重要因素，其最适浓度范围0. ro. 3mg L 1O3.不定芽增值培养基的筛选。取3cm长的健壮无菌苗，接种到不同浓度6-BA和NAA配比的2/3MS培养基中，并添加30 g L—1蔗糖和4 g L^1GEL进行不定芽诱导。培养50d (期间转接I次)后，调查增值系数(表4)。不定芽增值系数=不定芽总数/接种的茎段数X 100%。经试验确定耐盐薄荷的增殖培养基为2/3MS，2. (T6. O mg L_ ^-BA,0. I 0. 3mg L 1NAA, 30 g L 1 鹿糖，4 g L 1GEL, PH6. O。4.生根培养基的筛选
取2 cm长的健壮无根苗，接种到不同浓度6-BA和NAA配比的1/2MS培养基中，并添加30 g-L-1蔗糖和4 g-L-1 GEL进行生根诱导。培养两周后，统计植株生长量(株高)，生根数量(根数)及根生长量(根长)，21 d后进行比较分析(表5)。经试验确定生根培养基配方为1/2MS, 0. I 0. 3mg tU 1NAA, 30 g 1鹿糖,4 g tU1 GEL, PH6. O。不需添加 6-BA。5.耐盐变异体的筛选
取2 cm长的健壮无根苗，接种到分别添加0. 1%、0. 3%、0. 5%、0. 8%、1. 0%氯化钠的生根
培养基中(重量％)，培养三周后调查生根情况(表6)。依据耐盐诱变选育结果，确定添加氯化钠的重量为生根培养基重量的0.5% 0. 8%。6.组培苗的驯化与移栽
将长有生根苗的组培瓶在实验室内打开瓶盖，添加生根培养基重量0. 5 0. 8%的氯化钠(通常以1%溶液形式添加)，炼苗2 3天，用镊子小心取出，洗去根部培养基，栽植于带基质的穴盘中，放置于半荫处，注意浇水，保持基质湿润。7天后，连基质一起移植到各种培养土中，同时注意浇水，三周后调查薄荷成活率(表7)。经耐盐筛选后的薄荷组培苗在东营市垦利县土壤含盐量为0. 5%的地区成活率达95%以上；在东营市华业新材料有限公司土壤含盐量为I. 0%的地区成活率达50%以上。与现有技术相比本发明的优点是不同茎节分开消毒，既彻底消毒又避免消毒液损害不同 生育期的外植体；使耐盐薄荷便于工厂化生产，繁殖系数高；通过组培阶段的定向诱变，能够筛选变异体，获得高耐盐品种。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。实施例I.外植体无菌系的建立采用不同生育期的茎段分开灭菌的方法
从苗圃中取生长旺盛的薄荷植株，去叶留茎和芽点，流水冲洗20 min后，滤纸吸干水分，用手术剪对外植体进行修剪，截取3cm长茎段，然后将不同生育期的茎段(茎尖、中部茎段、基部茎段)分开，备用。在超净工作台上用75 %酒精溶液消毒IOs 60s、0. I %升汞溶液消毒8 15 min后，用无菌水冲洗4 5遍，吸干水后再用手术剪对外植体进行修剪，去除两端发黑部分，然后将其接种在1/2MS培养基中，置于光照培养箱中培养。3天后观察植株的污染情况，统计污染率。
权利要求
1.一种耐盐薄荷的组培快繁方法，包括外植体无菌处理、愈伤诱导培养、不定芽增值培养、生根培养、耐盐变异体的筛选、组培苗的驯化与移栽各步骤，其特征在于采用不同生育期的茎段分开灭菌的方法，建立外植体无菌体系；愈伤诱导培养基的筛选；不定芽增值培养基的筛选；生根培养基的筛选；耐盐变异体的筛选；组培苗的驯化与移栽方法。
2.如权利要求I所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的不同生育期的茎段分开灭菌的方法为取生长旺盛的薄荷植株，去叶留茎和芽点，流水冲洗20 min后，滤纸吸干水分，用手术剪对外植体进行修剪，截取3cm长茎段，然后将不同生育期的茎段即茎尖、中部茎段、基部茎段分开，采用75 %酒精30 60s +0. I %升汞溶液消毒8 lOmin，用无菌水冲洗4 5遍，吸干水后修剪备用。
3.如权利要求I所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的愈伤诱导培养基中，NAA是耐盐薄荷诱导愈伤能力的重要因素，其最适浓度范围0. ro. 3 mg * L-
4.如权利要求I所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的不定芽增值培养基的配方范围如下2/3MS, 2. 0 6. 0 mg I/ VBA’O. I 0. 3mg 17 1NAA, 30 g 17 1 蔗糖，4 g L_ 1GEL, PH6. O。
5.如权利要求I所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的生根培养基的配方范围如下；1/2MS，0. ro. 3mg 17 1NAA, 30 g 17 1 蔗糖，4 g 17 1 GEL, PH6. 0 ;不需添加6-BA。
6.如权利要求I所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的耐盐变异体的筛选中，添加氯化钠的重量为生根培养基重量的0. 5 0. 8 %。
7.如权利要求I所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的组培苗的驯化与移栽方法的操作方式如下将长有生根苗的组培瓶在实验室内打开瓶盖，以1%溶液形式添加生根培养基重量0. 5 0. 8%的氯化钠，炼苗2 3天，用镊子小心取出，洗去根部培养基，栽植于带基质的穴盘中，放置于半荫处，注意浇水，保持基质湿润，7天后，连基质一起移植到各种培养土中。
8.如权利要求I或3所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的愈伤诱导培养基的配方如下1/2MS 或 2/3MS，I. 0 mg L_ ^-BA ,0. 2 mg L_ 1 NAA, 30 g L—1 蔗糖和4 g L-1 GEL。
9.如权利要求I或4所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的不定芽增值培养基的配方如下2/3MS, 5. 0 mg tU ^-BA, 0. 2 mg tU 1NAA, 30 g*!/1 鹿糖，4 g tU 1GEL,PH 6. O。
10.如权利要求I或5所述的耐盐薄荷的组培快繁方法，其特征在于所说的生根培养基的配方如下即 1/2MS，0. 2 mg I/ 1NAA, 30 g 17 1 蔗糖，4 g 17 1 GEL, PH6. 0 ;不添加6-BA0
全文摘要
本发明为一种耐盐薄荷的组培快繁方法，涉及农业生物技术领域的组织培养繁殖技术。其技术要点包括采用不同生育期的茎段分开灭菌的方法，建立外植体无菌系；愈伤诱导培养基的筛选；不定芽增值培养基的筛选；生根培养基的筛选；耐盐变异体的筛选；组培苗的驯化与移栽方法。与现有技术相比，本发明采用不同茎节分开消毒方式，既彻底消毒又避免消毒液损害不同生育期的外植体；优选了各不同培养阶段的培养基配方；使耐盐薄荷便于工厂化生产，繁殖系数高；通过组培阶段的定向诱变，能够筛选变异体，获得高耐盐品种。
文档编号A01H4/00GK102630564SQ20121008739
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者李纪顺, 杨合同, 王贻莲, 郭凯, 陈凯, 魏艳丽 申请人:山东省科学院中日友好生物技术研究中心