专利名称：玉米抗病相关基因npr1的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是玉米抗病相关基因NPRl的应用。
背景技术：
玉米(Zea mays L.)是世界上分布最广泛的粮食作物之一，也是一种重要的经济作物。在我国，其分布范围和种植面积都很大，是我国旱谷地区人民的主要粮食之一。但是每年由于病虫害的侵染给人类带来了巨大经济损失，虽然田间管理以及药剂防治等传统方法在一定程度上抑制了病虫害的威胁，但费时费力且污染环境，存在很大的局限性。随着人类环保意识的加强和基因工程技术的发展，怎样利用生物学技术培养稳定的高效抗病品种、成为一种趋势。1961年Rose等在研究烟草抵御烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)时首先提出系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR),为培养植物广谱抗病品种奠定了理论基础。SAR是一种依赖于一种发病相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR protein)的表达，当植物受到病原微生物侵害时，通过一系列的反应使整株植株在较长时间内表现出对较广泛的病原微生物的抵抗力的一种抗病机制。这种抗性具有系统、持久和广谱的特点。1994年，Cao等人从拟南芥中分离获得了一种NPRl突变体，这种突变体不能表达水杨酸(salicylic acid, SA)和 2,6- 二氯异烟餅(2,6-dichloroiso_nicotinicacid, INA),当用SA或类似SA结构的化学物质处理这种突变体时，突变体抵御病原体的能力增强。后来证实NPRl是SAR系统中的关键基因。关于SAR的反应模型以及其与NPRl基因的关系，在拟南芥中已经有一个简单的模型首先，当病原微生物侵染植株时，会诱导植株体内水杨酸含量的迅速提高；然后，作为正调控因子的NPRl被激活并向细胞核内移动，与核内TGA转录因子结合进而诱导核内相关的抵抗基因的表达，从而使植株获得抗性。NPR类基因编码的蛋白含有两个功能区域BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, and Bric-a-brac/Pox virus and Zinc nger)和锚蛋白重复区域(an ankyrin repeat domain)。这两个结构域都涉及到蛋白质与蛋白质间的相互作用，其中锚蛋白重复序列对NPRl基因发挥其功能的作用极为重要。拟南芥NPRl基因最早是从模式植物拟南芥中获得，在花椰菜、甘蓝、烟草、番茄、马铃薯、小麦、水稻、玉米等中存在其同源基因。2005年Mawsheng Chern等人构建了水稻的NPRl过量表达载体并且证明了过量表达的NPRl转基因水稻对X. oryzae pv. Oryzae的抗性明显增强。目前在拟南芥中已发现六种NPR基因。水稻中存在五种，玉米NPRl基因NCBI登录号NM_ 001154115，但关于玉米NPRl基因在研究和提高玉米广谱抗病性中的作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的多核苷酸。本发明的再一的目的是，提供一种上述多核苷酸的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种RNAi载体。本发明的第四个目的是，提供一种遗传工程化的宿主细胞。本发明的第五个目的是，提供一种制备转基因植物的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下列中的一种a)由部分或全部SEQ IDNO. 7所示的序列构成的 核苷酸序列；或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。所述的多核苷酸的长度为250-600bp。优选地,所述的多核苷酸选自下列中的一种a)由SEQ ID NO. 8所示的序列构成的核苷酸序列；或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是如上所述的多核苷酸在降低或提高植物对病原物敏感性中的应用。及如上所述的多核苷酸在增加或减少植物体内水杨酸含量中的应用。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的RNAi载体含有如上任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的RNAi载体；或其基因组中整合有外源的如上任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是所述的方法是把如上所述的RNAi载体导入植物细胞、组织或器官，并筛选出整合有如上任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列的植物细胞、组织或器官。所述的植物为禾本科植物。所述的禾本科植物选自玉米、水稻、小麦、大麦或高粱。本发明优点在于本发明提供了可用于改变玉米体内水杨酸含量、进一步改变其对病原物敏感性的干涉片段，构建了有效的RNAi载体，证实了玉米基因NPRl在增强玉米抗病性中的作用，为提高玉米对病原物抵抗能力提供了一种新方法，同时可获得玉米基因NPRl沉默的模式植物，对于研究玉米的广谱抗病性有着非常积极的意义。
附图I是PUC19载体图谱。附图2是pUCCRNAi载体载体图谱。附图3是pEASY-T3载体图谱。附图4是CPB载体图谱。附图5是野生植株和转基因植株中SA含量比较结果，此含量的数值是利用高效液相色谱技术测定的结果经过换算得来的，即用水杨酸的峰面积比内参物质的峰面积，内参物质的含量是一定的，由此来确定水杨酸含量的高低，I :野生型植株；2-5 :四株ZmNPRlR转基因植株。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I一、材料
RNAiso Plus、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；Reverse Transcription System反转录试剂盒购于Promega公司；pUC19载体(图谱见图I)、pUCCRNAi载体(图谱见图2)、CPB载体(图谱见图4)购于宝生物工程(大连)有限公司；PEASY-T3 (图谱见图3)购于北京全式金生物科技有限公司；DH5a感受态细胞购于宝生物工程(大连)有限公司，AGIO感受态农杆菌购于Takara公司；植物基因组DNA提取试剂盒为康为世纪新型植物基因组DNA提取试剂盒；除草剂basta购于上海生工。YEP液体培养基配方牛肉浸膏10 g，酵母提取液10 g，NaCl 5 g，pH 7.0，对应的固定培养基添加I. 5%的琼脂；1/4MS培养基购于上海鼎杰生物科技有限公司。二、方法和结果 UTrizol法提取玉米齐319自交系叶片总RNA
实验室环境中种植玉米齐319自交系，待生长至4叶期时将叶片剪下，液氮冷冻后于-70°C保存，即为提取材料。也可随提随取。取叶片O. lg，于液氮中研磨至粉末状；加21111 RNAiso Plus，覆盖样品表面，室温静置至样品完全融化，研棒研磨至裂解液透明状为止；将勻衆转移至I. 5ml eppendorf管中，每Iml —管，室温静置5min ;4°C下，12000rpm离心5min,吸取上清于另一干净eppendorf管中，加200μ1氯仿异戊醇(24 1)，剧烈震荡15s，室温静置5min ;4°C下，12000rpm离心15min，吸取上层水相于另一干净管中，加600 μ I异丙醇，上下颠倒混匀，15_30°C下静置IOmin ;4°C下，12000rpm 离心 IOmin ;去上清,力口 Iml 75% 乙醇，4°C 12000rpm 离心 5min,再去上清，重复此步骤一次；去乙醇，室温干燥2-5min，使乙醇尽量去干净，加20μ I RNA free水溶解RNA，-70°C中保存。2、反转录获得cDNA
用反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，得到cDNA。反转录反应体系为
MgCla, 25mM丨4 μ I
ReverseTranscriptionlO X Buffer2 μ I
dNTPMixture, IOmM2 μ I
RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor0. 5 μ I
AMVReverseTranscriptase(HighConc. )O. 5 μ I
Oligo (dT) 15PrimerI μ I
TotalRNA2 μ I
Nuclease-Freeffater8 μ I
反转录反应程序是42°C，15min ；95°C，5min ；4°C，5min。3、PCR获得候选基因
3.1引物设计引物设计软件为Primer Premier 5. O,引物序列如下
ZmNPRl-S (SEQ ID NO. I) GCCTTGATCACCTCTGGGCATAC ；
ZmNPRl-X (SEQ ID NO. 2) CAAGATGGAGGATCTCGTTCCC,
目的片段长度为1434bp。3. 2 PCR反应体系如下
IOXPCRbuffer|5μ I
IOmMdNTPs4 μ I
引物 ZmNPRl-S1μ I
引物 ZmNPRl-X| μ I
权利要求
1.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸选自下列中的一种 a)由部分或全部SEQID NO. 7所示的序列构成的核苷酸序列；或 b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的长度为250_600bp。
3.根据权利要求I所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下列中的一种 a)由SEQID NO. 8所示的序列构成的核苷酸序列；或 b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
4.如权利要求1-3任一所述的多核苷酸在降低或提高植物对病原物敏感性中的应用。
5.如权利要求1-3任一所述的多核苷酸在增加或减少植物体内水杨酸含量中的应用。
6.—种RNAi载体,其特征在于,所述的RNAi载体含有如权利要求1_3任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞 含有如权利要求6所述的RNAi载体；或 其基因组中整合有外源的如权利要求1-3任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。
8.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法是把如权利要求6所述的RNAi载体导入植物细胞、组织或器官，并筛选出整合有如权利要求1-3任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列的植物细胞、组织或器官。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物为禾本科植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物选自玉米、水稻、小麦、大麦或高粱。
全文摘要
本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下列中的一种a)由部分或全部SEQ ID NO.7所示的序列构成的核苷酸序列；或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供上述多核苷酸在增加或减少植物体内水杨酸含量、降低或提高植物对病原物敏感性中的应用，并提供了有效的RNAi载体，证实了玉米基因NPR1在增强玉米抗病性中的作用，为提高玉米对病原物抵抗能力提供了一种新方法，同时可获得玉米基因NPR1沉默的模式植物，对于研究玉米的广谱抗病性有着非常积极的意义。
文档编号A01H5/00GK102703471SQ20121016973
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者彭晓剑, 朱苏文, 江海洋, 洪玲, 程备久, 赵阳, 马庆 申请人:安徽农业大学