专利名称：具有增强的产率相关性状的植物及其制备方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及通过增加植物中产率增加性多肽的编码核酸序列的表达来增强多种植物产率相关性状的方法，所述产率増加性多肽选自核定位AT-hook 基序蛋白 19/20 (AHL19/20)、GRP (生长调节蛋白，其中所述GRP多肽是金属硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基转移酶(AAT)样多肽，和丙氨酸氨基转移酶(AAT)多肽。本发明还涉及具有増加的编码所述产率増加性多 肽的核酸序列的表达的植物，该植物相对于对照植物具有增强的产率相关性状。本发明还提供了用于本发明方法的构建体。
背景技术：
不断增长的世界人口和逐渐減少的农业可用耕地助长了提高农业效率研究之势。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，这些异质的遗传组分不一定总是导致期望性状自亲本植物的传递。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般为DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。这类技术能够产生具多种改良的经济、农艺或园艺性状的作物或植物。具有特别经济意义的ー种性状是增加的产率。产率通常定义为作物可測量经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产率直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产量、叶子衰老等等。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也是决定产率的重要因素。因此优化ー个或多个上述因素也可以促进作物产率的增加。种子产率是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。通过对种子本身的直接消耗，或是通过消耗由加工的种子所饲养的肉类产品，作物诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等占人类总卡路里摄取量的一半以上。它们也是エ业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(萌发过程和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈籽粒。收获指数为种子产率与地上干重之间的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在植物大小和粮谷(grain)产率之间通常能够获得比较稳靠的相关性(如Rebetzke等人(2002) Crop Science42:739) 0这些方法存在固有的联系，原因是大多数粮谷生物量取决于植物叶和莖的当前的或忙存的光合产率(Gardener等人(1985)Physiology of CropPlants. Iowa State University Press, 68-73页)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作为未来潜在产率的指标(如Tittonell等人(2005)AgricEcosys & Environl05:213)。当检查遗传差异对胁迫耐受性的影响时，温室或植物生长室环境与田间相比具有固有的优势，即，能够使土壌性能、温度、水和养分可利用度以及光强度标准化。不过，由于因缺乏风カ或昆虫导致的不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或冠层生长等等，而对产率造成的人为局限性，会限制这些受控环境在测试产率差异中的应用。因此，在生长室或温室中在标准化条件下測量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产率优势指标的标准作法。另ー重要的性状为增加的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是导致全世界作物损失的首要原因，使大多数主要作物植物的平均产率下降超过50%(Wang等人，Planta (2003) 218:1-14)。非生物胁迫可以因干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(大量元素和/或微量元素)过量或不足、辐射和氧化胁迫而引起。提高植物非生物胁迫耐受性的能力将对全世界的农场主带来重大的经济利益，并将使得能够在不利条件下以及在原本不可能栽培作物的地域中栽培作物。 对于许多作物而言,另ー重要的性状是早期活力(early vigour)。改良早期活力是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的恰当土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速穿过水出苗的情况下，较长的枝条与活力有夫。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，Zea mays L.)杂交种。另ー重要的性状是在非生物胁迫条件下生长的植物的增强的产率相关性状。非生物胁迫是导致全世界作物损失的首要原因，使大多数主要作物植物的平均产率下降超过50% (Wang等人，Planta (2003) 218:1-14)。非生物胁迫可以因干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(大量元素和/或微量元素)过量或不足、辐射和氧化胁迫而引起。增强在非生物胁迫条件下生长的植物的产率相关性状的能力将对全世界的农场主带来重大的经济利益，并将使得能够在不利条件下以及在原本不可能栽培作物的地域中栽培作物。因此通过优化上述因素之一可以增加作物产率。视最终用途而定，可能更优选修饰某些产率性状。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料资源等应用，可能期望植物营养部分的增长，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子參数的增长。即便是在种子參数之中，视用途而定，一些參数也可能比另ー些更优。多种机制可促成増加的种子产率，无论形式是增加的种子大小、还是增加的种子数量。增加植物产率相关性状(种子产率和/或生物量)的ー种方法可以是修饰植物的内在生长机制，如细胞周期或者參与植物生长或防御机制的各种信号传递路径。
发明内容
现已发现，通过在植物中增加编码核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)多肽的核酸序列的表达，可以相对于对照植物增强植物的多种种子产率相关性状，而无延迟的开花。增强的种子产率性状相关性状包括一个或多个下列性状増加的每圆锥花序的花数、增加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数和增加的收获指数。此外，现已发现，増加编码GRP多肽(其中所述GRP多肽是金属硫蛋白2a (MT2a)多肽)的核酸序列的表达，可以产生在非生物胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增强的产率相关性状的植物。此外，现还发现，调节ATT样多肽编码核酸在地上植物部分中的表达，可以产生相对于对照植物具有增强的产率相关性状，特别是增加的产率，的植物。此外，现已发现，在非限氮条件下生长的植物的产率相关性状可通过调节ATT多肽编码核酸在这样的植物中的表达来增強。发明背景
DNA结合蛋白是包含任何DNA结合结构域并因此对DNA具有特定的或一般的亲和力的蛋白质。DNA结合蛋白包括例如调节转录过程的转录因子、切割DNA分子的核酸酶以及參与细胞核中DNA包装的组蛋白。AT-hook基序是首先在高迁移率组非组蛋白染色体蛋白质HMG-I/Y中描述的短DNA 结合蛋白基序(Reeves 和 Nissen(1990) J Biol Chem265:8573-8582)。已知 AT-hook与富含AT的核酸序列的小沟相互作用(Huth等(1997)Nat Struc Biol4:657_665)。已在广泛的来自动物、植物和微生物的DNA结合蛋白中鉴定到AT-hook基序。与几种已良好表征的DNA结合基序不同，AT-hook基序短，不超过13个氨基酸残基，并且在其中心具有典型的三肽序列甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(Gly-Arg-Pro或GRP)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，大约30种包含至少一个AT-hook基序的多肽还包含植物及原核生物保守(nlant and prokaryotes conserved, PPC)结构域,该结构域在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute) (EBI)的 InterPro结构域数据库中被描述为DUF296(未知功能结构域296) (Fujimoto等(2004)Plant MolecBiol56:225-239)。这些蛋白质之ー被发现定位于核质中，从而被称为核定位AT-hook基序蛋白1(AHL1; Fujimoto等，同上)。类似地命名了旁系同源多肽，即AHL，并顺序编号。在美国专利7，193，129和美国专利申请2005/0097638中，将拟南芥AHL多肽AHL19 (根据Fujimoto等，同上)(标识为G2153)转化入拟南芥，并且使用35S CaMV启动子进行表达。转基因植物显示出改良的性状，例如増加的盐胁迫耐受性、増加的滲透胁迫耐受性、增加的干旱耐受性、增加的对冷冻的耐受性和增加的对糖的植物应答。在美国专利申请2005/0097638中，与对照植物相比较，AHL19多肽以及几种旁系同源AHL多肽的过量表达(在35S CaMV启动子的控制下)显著延迟了转基因植物的开花，从而增加产率。发明概述根据ー个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物的种子产率相关性状的方法，该方法包括増加编码AHL19/20多肽的核酸序列在植物中的表达。增强的种子产率相关性状包括一个或多个下列性状増加的每圆锥花序的花数、増加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数和增加的收获指数。根据ー个实施方案，提供了相对于对照植物增强在非生物胁迫条件下生长的植物的产率相关性状的方法，该方法包括增加GRP多肽编码核酸序列在植物中的表达，其中所述GRP多肽是金属硫蛋白2a(MT2a)多肽，增强的产率相关性状是ー个或多个下列性状±曾加的地上生物量、增加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数、增加的种子总数、增加的一级圆锥花序(primary panicles)数、和增加的种子饱满率。根据本发明的一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物的产率相关性状的方法，该方法包括调节编码AAT-样多肽的核酸在地上植物部分中的表达。在优选实施方案中，编码AAT-样多肽的核酸的表达通过将所述核酸有效连接至在地上植物部分中具有活性的启动子来进行调节(优选增加)。根据ー个实施方案，提供了增强在非限氮条件下生长的植物的产率相关性状的方法，该方法包括调节ATT多肽编码核酸在植物中的表达。定义多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在文中互換使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸多聚体。 多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”在文中互換使用，是指任何长度的无支链形式的多聚核苷酸，所述核苷酸或者为核糖核苷酸或者为脱氧核糖核苷酸或者为两者的组合。对照棺物选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子(nullizygote)。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。同源物蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其源自的未修饰蛋白质相似的生物活性和功能活性。缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括单个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端融合以及序列内插入。一般氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级约I到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括如在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、ニ氢叶酸还原酶、Tag 100表位、c-myc表位、厂し\(;"表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破a螺旋结构或0片层结构的倾向性)的其他氨基酸替换。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以发生成簇取代；取代通常在大约I到10个氨基酸残基数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域众所周知(參见例如 Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (编辑)和下表I)。
表I :保守氨基酸取代的实例
权利要求
1.相对于对照植物增强植物的产率相关性状的方法，包括调节编码丙氨酸氨基转移酶(AAT)样多肽的核酸在地上植物部分中的表达。
2.权利要求I的方法，其中所述AAT样多肽包含ー个或多个以下特征 (a)催化下列反应的能力L-丙氨酸+2-酮戌ニ酸◎丙_酸+L-谷氨酸 (b)属于酶分类编号EC2.6. I. 2. (c)具有氨基转移酶结构域(在InterPro中称为IPR004839;以及在PFAM中称为PF00155) (d)具有I-氨基环丙烷-I-羧酸合酶结构域(在InterPro中称为IPROOl176) (e)靶向线粒体 (f)当用于构建包含AAT序列的系统发生树时，与包含SEQID NO :51的AAT样多肽群而非任何其他AAT或AAT样序列群聚类， (g)由编码AAT样多肽并且能够与SEQID NO :50所示核酸杂交的核酸编码， (h)由编码SEQID NO :51所示蛋白的直系同源物或旁系同源物的核酸序列编码。
3.权利要求I或2的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达在启动子控制下的编码AAT样多肽的核酸来实现，其中所述启动子在地上植物部分中具有活性。
4.任何前述权利要求的方法，其中所述增强的产率相关性状包括相对于对照植物増加的产率、优选增加的种子产率。
5.权利要求3或4的方法，其中所述在地上植物部分中具有活性的启动子是枝条特异性和/或叶特异性启动子。
6.任何前述权利要求的方法，其中所述AAT样多肽编码核酸是藻类来源的，优选来自衣藻属，更优选来自物种雷氏衣藻。
7.可通过前述权利要求之任ー项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码AAT样多肽的重组核酸，优选地所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黒麦、黑小麦(triticale)、高粱和燕麦。
8.构建体，包含 (i)编码权利要求2中定义的AAT样多肽的核酸； (ii)能够驱动(i)中的核酸序列在地上部分中表达的启动子序列；和任选地 (iii)转录终止序列。
9.权利要求8的构建体在用于产生相对于对照植物具有增加的产率，特别地增加的种子产率的植物的方法中的用途。
10.用权利要求8的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞，优选地所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黒麦、黑小麦(triticale)、高粱和燕麦。
11.产生与对照植物相比具有增加的产率，特别地增加的种子产率的转基因植物的方法，包括 (i)在植物中引入和表达编码权利要求2中所定义的AAT样多肽的核酸，该核酸处于在地上部分中具有活性的启动子的控制之下；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
12.由于编码权利要求2中定义的AAT样多肽的核酸的表达增加而与对照植物相比具有増加的产率、特别是増加的种子产率的转基因植物、或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述核酸处于在地上部分中具有活性的启动子的控制之下，优选地所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黒麦、黑小麦(triticale)、高粱和燕麦。
13.根据权利要求7、10或12的植物的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
14.AAT样多肽编码核酸用于相对于对照植物増加植物的产率，特别是増加种子产率的用途，其中该核酸处于在地上部分中具有活性的启动子的控制之下。
15.AAT样多肽编码核酸用于改变植物的收获周期的用途。
16.AAT样多肽编码核酸作为探针用于对包含其的基因进行遗传作图以及用作与那些基因连锁的性状的标志物的用途。
全文摘要
本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及通过调节植物中编码产率增加性多肽的核酸序列的表达来增强多种植物产率相关性状的方法，所述产率增加性多肽选自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生长调节蛋白)(其中所述GRP多肽是金属硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基转移酶(AAT)样多肽、和丙氨酸氨基转移酶(AAT)多肽。本发明还涉及具有调节的产率增加性多肽编码核酸序列表达的植物，所述产率增加性多肽选自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生长调节蛋白)(其中所述GRP多肽是金属硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基转移酶(AAT)样多肽、和丙氨酸氨基转移酶(AAT)多肽，该植物相对于对照植物具有增强的产率相关性状。本发明还提供了可以用于本发明方法的构建体。
文档编号A01H5/10GK102827865SQ20121028186
公开日2012年12月19日 申请日期2008年7月21日 优先权日2007年7月20日
发明者Y·海茨费尔德, V·弗兰卡德 申请人:巴斯夫植物科学有限公司